一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白，其特征在于，包括用于基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白的引物组，其为SEQ?ID?No：1、SEQ?ID?No：2、SEQ?ID?No：3和SEQ?ID?No.4所示的多核苷酸序列；一种用于基因工程改造免疫球蛋白-亲和蛋白的方法。本发明的有益效果是本发明方法是通过对敏感氨基酸的定点突变，获得对极端碱性条件耐受的免疫球蛋白-亲和蛋白。本发明方法对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了抗体药物纯化的成本。
【专利说明】一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白【技术领域】
[0001]本发明涉及分子学和分类学领域，特别涉及一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白。
【背景技术】
[0002]随着生物技术的发展，抗体药作为一种具有特效的新型治疗药物，具有见效快，特异性好，疗效显著，副作用小等众多优点。抗体药的研发和生产势必会成为各大药厂药物研发和生产的重点发展方向。除了用作治疗的抗体，国内外还有很多公司在生产数量极其庞大的科研和诊断检测用抗体，例如美国的Cell Signaling, Millore, Abcam和Santa Cruz等公司。而抗体药和诊断检测及科研用的制备和纯化需要蛋白A作为亲和层析介质。蛋白A是金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)细胞壁的一种组成成分,共有5个结构域，D，E，A，B，C，每个结构域都由三个α-螺旋构成，结构上具有一定的同源性。蛋白A对人类IgGl和IgG2免疫球蛋白，以及小鼠IgG2a和IgG2b免疫球蛋白具有高亲和性，对人类IgM，IgA和IgE，以及小鼠的IgGl和IgG3具有中等程度的亲和性。
[0003]在纯化抗体时，将蛋白A交联固定在惰性层析介质上，利用抗体与蛋白A的结合进行亲和层析，可以获得高纯度的抗体。用于抗体纯化的固定化蛋白A介质是能多次重复使用的。在抗体纯化过程中，有很多污染物会残留在固定化蛋白A介质里，例如脂类，多糖，蛋白质，细菌细胞碎片以及病毒颗粒等。要在抗体洗脱后去除这些污染物，通常要进行就地清洗(Clean In Place，CIP)，以使固定化蛋白A介质获得再生。最常用的就地清洗的试剂是
0.1-1M的氢氧化钠(NaOH)溶液。NaOH溶液作为就地清洗试剂具有很多优点，例如除了能够去除常规的蛋白质和核酸残留之外，还能够轻松地杀死细菌，霉菌等污染微生物，可以将脂类等疏水性的杂质溶解和去除，可以根据不同的污染程度选择不同浓度的NaOH溶液，价格便宜，而且就地清洗完毕以后，只需要用水或者磷酸缓冲液等清洗介质就可以将NaOH轻松去除。但是NaOH具有强碱性，用于就地清洗的NaOH溶液pH会达到13以上，对于天然的蛋白A来说，这种严苛的洗脱条件是不能承受的，会造成蛋白A的变性和破坏，从而丧失对抗体的结合能力。
[0004]鉴于上述问题，亟待有一种可抗高碱性条件的改造蛋白的出现，从而可方便的多次重复被利用于抗体药的纯化，降低抗体药的生产成本的同时提高了抗体药的纯化率和产率。
【发明内容】
[0005]本发明目的之一在于提供一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白。本发明的总体目的是利用基因工程改造技术将原有金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域对应的基因序列发生改变，从而通过后期诱导表达之后获得新的免疫球蛋白-亲和蛋白，产生的新的免疫球蛋白-亲和蛋白能抗高碱性条件，从而可以保证在抗体药物纯化结束后用氢氧化钠清洗的带有免疫球蛋白-亲和蛋白的惰性层析介质过程中免疫球蛋白-亲和蛋白结构域不被破坏，从而提高用于纯化抗体药物的免疫球蛋白-亲和蛋白的利用率。本发明方法对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了抗体药物纯化的成本。
[0006]为实现上述目的，一种用于基因工程改造免免疫球蛋白-亲和蛋白的引物组，其特征在于，包括，
[0007]正向引物C-N6T-F，其为SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列；
[0008]反向引物C-N6T-R，其为SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列；
[0009]正向引物C-N28T-F，其为SEQ ID N0.3所示的多核苷酸序列；
[0010]反向引物C-N28T-R，其为SEQ ID N0.4所示的多核苷酸序列。
[0011]优选的是，所述引物组中C-N6T-F和C-N6T-R用于金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域中第6个天门冬酰胺突变成苏氨酸的改造，突变位点简写为N6T，所述引物组中C-N28T-F和C-N28T-R用于金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域中第28个天门冬酰胺突变成苏氨酸的改造，突变位点简写为N28T。
[0012]一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白-亲和蛋白为使用权利要求1所述引物组通过基因工程改造方法获得的免疫球蛋白-亲和蛋白，所述改造后的免疫球蛋白-亲和蛋白可用于抗体药物纯化。
[0013]一种基因工程改造免疫球蛋白-亲和蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0014]I)根据金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列通过全序列基因合成出一段DNA，备用；
[0015]2)将所述DNA作为模板，使用权利要求1所述的引物组，并使用PCR点突变试剂盒进行点突变PCR扩增，所述点突变PCR扩增结束后，向PCR产物中加入0.5μ I限制性内切酶DpnI，混匀后在37°C反应lh，所述限制性内切酶用于酶切模板DNA，从而获得只含有突变位点的克隆质粒的酶切产物；
[0016]3)取I~2 μ I所述酶切产物与所述大肠杆菌DH5感受态细胞混合进行常规转化，所述转化结束后将所述转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的抗性LB平皿上36~38°C下培养12~14h,待培养基上长出大肠杆菌的菌落；
[0017]4)挑取培养出的大肠杆菌的单菌落进行再次培养同时提取所述大肠杆菌中的质粒进行Sanger法测序以确定正确的阳性克隆质粒；
[0018]5)将所述正确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌BL21/DE3中进行蛋白质的诱导表达，获得改造的免疫球蛋白-亲和蛋白。
[0019]优选的是，所述步骤I)所述金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列为SEQ ID N0.5所示的多核苷酸序列。
[0020]优选的是，所述步骤5)所述改造的免疫球蛋白可以为含有N6T单突变或者N28T单突变或者N6T/N28T双突变的C蛋白单体或者二聚体或者四聚体。
[0021]在抗体药纯化过程中，需要利用与惰性层析介质交联的金黄色葡萄球菌蛋白A作为配基，利用蛋白A与抗体Fe结构域的结合进行亲和层析，从而达到纯化抗体的目的。固定化的蛋白A亲和层析柱是需要反复使用的。而在重复使用之前，必须使用强碱性的0.1-1MNaOH溶液对层析介质进行就地清洗(Clean In Place, CIP)。就地清洗的强碱性会使天然的蛋白A失活，从而丧失结合抗体的能力。
[0022]先前的科学研究发现，在强碱性条件下，由于蛋白A侧链基团中的酰胺基会变得非常不稳定，甚至脱落，这个现象叫做脱酰胺化或去酰胺化。酰胺基团的脱落会极大地改变蛋白质的结构和性质，严重的会导致活性的丧失。针对此种情况，本发明中将N6和N28两个天门冬酰胺残基的残基突变成苏氨酸，既避免了天门冬酰胺残基的去酰胺化，同时又保证了替换残基和天门冬酰胺具有相似的亲水性，而且这两个氨基酸残基的等电点(Pl值)也极其接近，天门冬酰胺的等电点是5.41，苏氨酸的等电点是5.60，基本上是相同的。另外，这两个氨基酸的侧链集团碳链长度相同，都是两个碳。综合起来，将C结构域蛋白(包括单体，二聚体，三聚体和四聚体)中的两个天门冬酰胺残基的残基突变成苏氨酸，既能避免既避免了天门冬酰胺残基在强碱性条件下因为去酰胺化而导致蛋白质失活，又能最大程度的保证替换后的氨基酸理化性质和天门冬酰胺接近。
[0023]本发明 申请人:经过大量试验还得出在C结构域蛋白的N-端增加一段12个特定氨基酸的序列构建成C+蛋白之后，再通过C+蛋白的N-端连接一个半胱氨酸之后，半胱氨酸通过硫醚键与惰性层析介质(例如交联琼脂糖)交联，就可以将野生型或含有N6T，和N28T突变的C+蛋白固定化，成为可以结合纯化抗体的亲和层析介质。C+蛋白中增加的12个氨基酸理论上不会破坏C结构域的空间构象,对C结构域与抗体的结合也不会产生不利影响，与惰性层析介质交联时使C+蛋白空间结构更舒展，使C+蛋白的结构域能更容易的与抗体相结合，在纯化抗体药过程中提高了纯化效率。
[0024]本发明方法使用的是Gen-Foci Biotech (AnnArbor, MI,USA)公司生产的点突变试剂盒对蛋白A的C结构域进行点突变。
[0025]25 μ I点突变PCR反应体系为:12.5 μ 1，2x Pfu超级反应混合液；0.5 μ I物质的量浓度为10 μ M的正向引物；0.5μ I物质的量浓度为10 μ M的反向引物；1μ I体积浓度为5ng/ μ I 的 pET16b_C 模板 DNA 和 10.5 μ I 双蒸水。
[0026]点突变PCR反应条件为95°C预变性3min，然后95°C变性30s、60°C退火30s、72°C延伸10.5min，从预热、退火到延伸共反应25个循环，然后72°C延伸lOmin。
[0027]本发明的有益效果是本发明方法是通过对敏感氨基酸的定点突变，获得对极端碱性条件耐受的免疫球蛋白-亲和蛋白。本发明选取了金黄色葡萄球菌蛋白A的C结构域，通过对C结构域中敏感氨基酸的定点突变和筛选，增加了该蛋白的稳定性和不良条件耐受性，获得了一个能够耐受PH13.5以上极端碱性条件的重组免疫球蛋白-亲和蛋白，从而可以保证在抗体药物纯化结束后用氢氧化钠清洗的带有免疫球蛋白-亲和蛋白的惰性层析介质过程中免疫球蛋白-亲和蛋白结构域不被破坏，从而提高用于纯化抗体药物的免疫球蛋白-亲和蛋白的利用率。本发明方法对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了抗体药物纯化的成本。
[0028]本发明所涉及到的术语定义
[0029]除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0030]术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。
[0031]术语“PCR”意指聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR。聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方.聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
[0032]术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为DNA引物)。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3'端的复制起始点的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA模板5'端的复制起始点的引物。
[0033]术语“限制性内切酶”意指一类在细胞复制DNA的过程中起重要作用的酶，以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。链置换DNA活性聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相辅的活性。[0034]术语“转化(Transformation) ”意指将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
[0035]术语“大肠杆菌感受态细胞”意指转化过程中经常用到的一类受体细胞，受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaC12，RbCl (KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。
[0036]术语“质粒(Plasmid) ”意指附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目前也发现有少数的质粒属于线性构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。本发明中所用的质粒PUC57为环形质粒。
[0037]术语“免疫球蛋白(immunoglobulin, ig) ”意指一组具有抗体活性的蛋白质，ig由浆细胞产生，主要存在于生物体血液和其他体液(包括组织液和外分泌液)中，约占血浆蛋白总量的20% ;还可分布在b细胞表面。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白(Y-球蛋白)中。免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。
【专利附图】
【附图说明】
图1为在相同清洗条件下，本发明所述的基因工程改造出的免疫球蛋白-亲和蛋白N6T、N28T、N6T/N28T和野生型C蛋白分别与抗体结合力的变化图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。[0039]实施例1:
[0040]弓丨物设计:
[0041]所述引物组的四个引物使用Premier Biosoft公司的LAMP引物设计软件LampDesignerl.10,根据肉毒杆菌NTNH结构域的保守序列来设计。
[0042]实施例2
[0043]含有N6T的免疫球蛋白-亲和蛋白单体的构建
[0044]I)根据金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列通过全序列基因合成出一段DNA，备用；
[0045]2)将所述DNA作为模板，使用权利要求1所述的引物组中的C_N6T_F和C-N6T-R，并使用PCR点突变试剂盒进行点突变PCR扩增，所述点突变PCR扩增结束后，向PCR产物中加入0.5μ I限制性内切酶Dpnl，混匀后在37 V反应lh，所述限制性内切酶用于酶切模板DNA,从而获得只含有突变位点的克隆质粒的酶切产物；
[0046]3)取I~2 μ I所述酶切产物与所述大肠杆菌DH5感受态细胞混合进行常规转化，所述转化结束后将所述转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的抗性LB平皿上36~38°C下培养12~14h,待培养基上长出大肠杆菌的菌落；
[0047]4)挑取培养出的大肠杆菌的单菌落进行再次培养同时提取所述大肠杆菌中的质粒进行Sanger法测序以确定正确的阳性克隆质粒；
[0048]5)将所述正确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌BL21/DE3中进行蛋白质的诱导表达，获得改造的含有N6T的免疫球蛋白-亲和蛋白单体。
[0049]实施例3:
[0050]含有N28T的免疫球蛋白-亲和蛋白单体的构建
[0051]I)根据金黄 色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列通过全序列基因合成出一段DNA，备用；
[0052]2)将所述DNA作为模板，使用权利要求1所述的引物组中的C_N28T_F和C-N28T-R,并使用PCR点突变试剂盒进行点突变PCR扩增，所述点突变PCR扩增结束后，向PCR产物中加入0.5 μ I限制性内切酶DpnI，混匀后在37°C反应lh，所述限制性内切酶用于酶切模板DNA，从而获得只含有突变位点的克隆质粒的酶切产物；
[0053]3)取I~2 μ I所述酶切产物与所述大肠杆菌DH5感受态细胞混合进行常规转化，所述转化结束后将所述转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的抗性LB平皿上36~38°C下培养12~14h,待培养基上长出大肠杆菌的菌落；
[0054]4)挑取培养出的大肠杆菌的单菌落进行再次培养同时提取所述大肠杆菌中的质粒进行Sanger法测序以确定正确的阳性克隆质粒；
[0055]5)将所述正确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌BL21/DE3中进行蛋白质的诱导表达，获得改造的含有N6T的免疫球蛋白-亲和蛋白单体。
[0056]实施例4
[0057]含有N6T/N28T双突变的免疫球蛋白-亲和蛋白单体的构建
[0058]I)根据金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列通过全序列基因合成出一段DNA，备用；
[0059]2)将所述DNA作为模板，使用权利要求1所述的引物组，并使用PCR点突变试剂盒进行点突变PCR扩增，所述点突变PCR扩增结束后，向PCR产物中加入0.5μ I限制性内切酶DpnI，混匀后在37°C反应lh，所述限制性内切酶用于酶切模板DNA，从而获得只含有突变位点的克隆质粒的酶切产物；[0060]3)取I~2 μ I所述酶切产物与所述大肠杆菌DH5感受态细胞混合进行常规转化，所述转化结束后将所述转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的抗性LB平皿上36~38°C下培养12~14h,待培养基上长出大肠杆菌的菌落；
[0061]4)挑取培养出的大肠杆菌的单菌落进行再次培养同时提取所述大肠杆菌中的质粒进行Sanger法测序以确定正确的阳性克隆质粒；
[0062]5)将所述正确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌BL21/DE3中进行蛋白质的诱导表达，获得改造的含有N6T的免疫球蛋白-亲和蛋白单体。
[0063]实施例5:免疫球蛋白-亲和蛋白单体或二聚体、四聚体(野生型或者含有N6T，N28T，N6T/N28T突变株)的表达纯化与交联
[0064]I)将表达免疫球蛋白-亲和蛋白单体或二聚体或四聚体(野生型或者含有N6T，N28T, N6T/N28T突变株)的pET_16b质粒转化大肠杆菌BL21/DE3:
[0065]2)挑单菌落，接种到50ml含有50ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37°C振荡培养12-14h，然后将40ml培养液接种到8L含有50ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中；
[0066]3)将所述接种大肠杆菌的LB液体培养基分装到4个5L的灭菌三角瓶中37°C震荡培养至0D600达到0.6，然后加入过滤灭菌的0.1M IPTG(Sigma-aldrich, St.Luis, MO,USA)至终浓度0.5mM，继续震荡培养4h以诱导蛋白质表达；
[0067]4)离心收集大肠杆菌，用预冷的双蒸水重悬洗涤大肠杆菌一次，再次离心收集大肠杆菌，弃去上清，将大肠杆菌冷冻于-80°C冰箱，备用；
[0068]5)用Novagen(Darmstadt, Germany)His-bind试剂盒,按照生产商的说明对冷冻保存的大肠杆菌进行免疫球蛋白-亲和蛋白的纯化；
[0069]6)将纯化的免疫球蛋白-亲和蛋白单体或二聚体或四聚体(野生型或者含有N6T，N28T, N6T/N28T突变株)，使用反向悬浮液凝胶化方法，通过硫醚键与琼脂糖颗粒层析介质进行交联，从而形成固定化的免疫球蛋白-亲和蛋白抗体纯化介质。
[0070]实施例6:固定化的免疫球蛋白-亲和蛋白对强碱性CIP再生条件的耐受性
[0071]为了测试野生型或突变免疫球蛋白-亲和蛋白对强碱性CIP再生条件的耐受性，我们使用了 0.5M NaOH对以下几种蛋白进行了长时间的反复清洗:C蛋白野生型四聚体-cys，免疫球蛋白-亲和蛋白N6T四聚体-cys，免疫球蛋白-亲和蛋白N28T四聚体_cys和免疫球蛋白-亲和蛋白N6T/N28T四聚体-cys。
[0072]将纯化的上述蛋白通过硫醚键交联到琼脂糖颗粒惰性层析介质上，并且装入体积为0.5mL的色谱柱中，使用AKTA purifier 10全自动蛋白质分离纯化系统(GEHealthcare, Uppsala, Sweden)进行抗体纯化和检测。
[0073]抗体纯化所用缓冲溶液:
[0074]1.抗体结合-漂洗缓冲液:137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,ρΗ8.0
[0075]?.抗体洗脱缓冲液:0.1M甘氨酸(Glycine)，用盐酸将pH调至3.0
[0076]ii1.就地清洗缓冲液:0.5M NaOH[0077]抗体纯化过程:
[0078]1.用> 5倍柱体积的抗体结合-漂洗缓冲液平衡色谱柱
[0079]i1.将人的单克隆抗体以0.3mL/min的速度缓慢结合到色谱柱上
[0080]ii1.用约20倍柱体积的抗体结合-漂洗缓冲液过柱去除杂质
[0081]iv.用洗脱缓冲液以1.5mL/min的速度洗脱结合的抗体
[0082]V.用大于20倍柱体积双蒸水清洗色谱柱
[0083]柱料就地清洗(CIP)再生 :
[0084]1.用> 15倍柱体积的就地清洗缓冲液冲洗色谱柱，流速约为0.3mL/min,冲洗时间为50min到Ih。
[0085]i1.用大于10倍柱体积双蒸水清洗色谱柱
[0086]ii1.用> 5倍柱体积的抗体结合-漂洗缓冲液加0.02%叠氮化钠平衡色谱柱
[0087]每次运行抗体纯化时，加入的免疫球蛋白的量都是大于色谱柱的结合能的，这样会确保柱料能最大程度地结合抗体。而当柱料经过多次再生而导致结合力下降时，这个下降的程度会直观地从抗体的结合量上面体现出来。
[0088]在一个抗体结合-洗脱-柱料再生流程结束以后，马上开始一个新的循环，每个循环都包括50min的0.5M NaOH就地清洗(CIP)。柱料每次再生之后，结合抗体的能力都会有所降低。柱料结合抗体的量可以通过计算抗体洗脱峰的峰面积获得。如果将第一次的抗体结合量设定为100%，那么将以后各个循环的抗体洗脱峰的峰面积与第一次的想比较，就能够获得经过多次0.5M NaOH就地清洗(CIP)后柱料所保持的抗体结合能力。
[0089]设定每个循环的就地清洗时间为50min,经过15个循环，共计750min的就地清洗。如图1所示，经比较发现，野生型C蛋白在三个循环共计150min的清洗以后，与抗体的结合力就降到了 19.4%，到750min时与抗体的结合力已经下降到接近于O。而N28T突变体经过三个循环共计150min的清洗以后，活性还有73.8，在经过15个循环750min的清洗后，结合活性还有25.8%。N6T突变体在经过150min的清洗后，结合活性还有83.4%，在750min的清洗后，结合活性还有49.5%，而N6T/N28T双突变体经过150min的清洗后，结合活性还有94.7%，在750min的清洗后，结合活性还有73.8%。
[0090]上述数据标明，C蛋白N28T和N6T突变体相对于野生型，抗强碱性清洗的能力都有显著提高，尤其是N6T/N28T双突变体，其抗强碱性清洗能力获得了本质性的提高。从而使这几种突变体成为理想的替代野生型蛋白A的免疫球蛋白纯化介质。
[0091]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
【权利要求】
1.一种用于基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白的引物组，其特征在于，包括， 正向引物C-N6T-F，其为SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列； 反向引物C-N6T-R，其为SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列； 正向引物C-N28T-F，其为SEQ ID N0.3所示的多核苷酸序列； 反向引物C-N28T-R，其为SEQ ID N0.4所示的多核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的用于基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白的引物组，其特征在于，所述引物组中C-N6T-F和C-N6T-R用于金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域中第6个天门冬酰胺突变成苏氨酸的改造，突变位点简写为N6T，所述引物组中C-N28T-F和C-N28T-R用于金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域中第28个天门冬酰胺突变成苏氨酸的改造，突变位点简写为N28T。
3.一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白-亲和蛋白为使用权利要求1所述引物组通过基因工程改造方法获得的免疫球蛋白-亲和蛋白，所述改造后的免疫球蛋白-亲和蛋白可用于抗体药物纯化。
4.一种用于基因工程改造免疫球蛋白-亲和蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)根据金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列通过全序列基因合成出一段DNA，备用； 2)将所述DNA作为模板，使用权利要求1所述的引物组，并使用PCR点突变试剂盒进行点突变PCR扩增，所述点突变PCR扩增结束后，向PCR产物中加入0.5 μ I限制性内切酶Dpnl，混匀后在37°C反应lh，所述限制性内切酶用于酶切模板DNA，从而获得只含有突变位点的克隆质粒的酶切产物； 3)取I~2μI所述酶切产物与所述大肠杆菌DH5感受态细胞混合进行常规转化，所述转化结束后将所述转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的抗性LB平皿上36~38 °C下培养12~14h，待培养基上长出大肠杆菌的菌落； 4)挑取培养出的大肠杆菌的单菌落进行再次培养同时提取所述大肠杆菌中的质粒进行Sanger法测序以确定正确的阳性克隆质粒； 5)将所述正确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌BL21/DE3中进行蛋白质的诱导表达，获得改造的免疫球蛋白-亲和蛋白。
5.如权利要求4所述的用于基因工程改造免疫球蛋白-亲和蛋白的方法，其特征在于，所述步骤I)所述金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列为SEQ ID N0.5所示的多核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的用于基因工程改造免疫球蛋白-亲和蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5)所述改造的免疫球蛋白-亲和蛋白可以为含有N6T单突变或者N28T单突变或者N6T/N28T双突变的C蛋白单体或者二聚体或者四聚体。
【文档编号】C07K14/31GK103540588SQ201310465402
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】杨波, 吴立峰, 郭春雨 申请人:杨波, 杨建新, 吴立峰, 郭春雨