一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法，其中植物乳杆菌（Lactobacillus?plantarum）163菌种保藏号为CGMCC?NO.8224。该植物乳杆菌在MRS液体培养基或者白菜番茄培养基中进行培养，可以发酵产生细菌素，其中所产生的细菌素为由两种氨基酸序列构成一级结构的两种新型细菌素，细菌素通过四次分离纯化以及鉴定得到。经过测定，该细菌素具有较广的抑菌谱以及较好的热稳定性和pH稳定性，可以广泛应用于食品及医药领域中。
【专利说明】一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物乳杆菌及其细菌素，特别涉及一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分尚纯化方法。
【背景技术】
[0002]在食品工业中，有关食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题。据FDA统计,全世界每年约有10%-20%的食品损失于各种腐败变质，在食品腐败变质的过程中，微生物起着决定性的作用。针对食品腐败变质的原因，采取不同的处理手段控制食品中的微生物，但是有些杀菌方法会对食品的质地、风味和营养产生不良影响。食品防腐剂因其使用方便有效，同时能很好地保存食品的商品价值，目前仍然是食品防腐的重要措施之一。
[0003]乳酸菌及发酵产物人类已经有数千年的使用历史，现在不仅应用在食品制造，而且还应用在治病、保健方面。数千年的利用历史及无毒副作用的优良品质使乳酸菌被认为是GRAS(generalIy recognized as safe公认安全)菌。其发酵产物被视为GRAS物质。其中某些种类的乳酸菌在代谢过程中会由核糖体合成小分子多肽一一细菌素，部分细菌素能抑制病原微生物、腐败性细菌的生长繁殖，具有防腐应用前景。目前，国内外研究最深、最透彻的乳酸链球菌素一Nisin，已在80多个国家和地区得到广泛应用(也是唯一一种得到商业化应用批准)。我国也于1992年将Nisin列入1992年10月I日实施的国标GB2660-86中的增补品种，可用于罐头食品、植物蛋白饮料、乳制品和肉制品的保藏中。然而，Nisin在碱性环境下活性较低；只对格兰阳性菌有作用，对格兰阴性致病菌、酵母、霉菌、病毒无抑制作用；活性受生物酶影响较大等限制了它的使用。因而继续筛选新的高效广谱乳酸菌细菌素成为近年来全世界范围内科学家的一个热门研究方向。
[0004]目前我国食品添加剂标准(GB2760)允许使用的32种防腐剂中以化学防腐剂为主，天然防腐剂仅乳链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)两种。化学防腐剂通常成本较低、化学性能稳定以及抑菌谱较广、防腐效果好，但目前研究已表明，化学防腐剂对人体不同程度存在一定的毒性，其中一些具有诱癌性和致畸性，在超标使用的情况下易引起食物中毒。
[0005]随着人民生活水平的提高和食品安全意识的增强，人们对食品的安全卫生和自身健康状况日益关注，不含化学防腐剂的天然食品和绿色食品更容易被消费者认可和接受。因此，研究开发高效安全无毒的天然防腐剂已成为当今国际食品添加剂发展的主要方向。
[0006]我国允许使用的抗菌物质Nisin和Natamycin均为微生物源天然防腐剂。Nisin是乳酸链球菌合成的短肽分子，对革兰氏阳性菌，特别是对肉毒梭状芽孢杆菌及其孢子，嗜热脂肪芽孢及其孢子、金黄色葡萄球菌、李`斯特菌等具有显著拮抗活性。Nisin是目前公认安全和应用范围最广的天然食品防腐剂，但也存在某些局限性，其抑菌谱较窄，仅对革兰氏阳性菌表现出显著抑制作用，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性，在中性和碱性条件下对热不稳定，从而使其在食品中的应用受到一定限制。Natamycin源于放线菌纳塔尔霉菌(Streptomyces natalensis)，为多烯烃大环内酯类真菌抑制剂，能有效抑制霉菌、酵母菌和丝状真菌，但对细菌和病毒无效。
[0007]虽然国内外对不同来源的微生物天然防腐剂如乳酸菌细菌素、抗菌肽研究较多，但是在食品工业中实际应用很少，这主要是因为其中一些天然防腐剂抑菌谱窄，抑菌效果不够理想，抗菌性能不稳定，尤其是价格偏高、产率低且安全性未能得以确定，目前还很难取代化学防腐剂的作用和地位。因此，开发出广谱、高效、稳定、安全、产率高、低成本的天然食品防腐剂具有潜在应用价值和巨大的市场需求。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法。
[0009]本发明是由以下技术手段实现的:
[0010]一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)163,菌种保藏号为 CGMCC N0.8224。上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 163,已于2013年9月20日保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)，保藏登记号为CGMCC N0.8224。
[0011]一种细菌素，以上所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)163发酵得到。
[0012]所述的细菌素，可以具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。[0013]所述的细菌素，可以具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0014]一种所述的细菌素的制备方法，由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)163通过下述步骤培养发酵得到:
[0015](1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 163种子液制备:将保藏的菌种，接种于MRS液体培养基中，37°C静置培养12-16h ；
[0016](2)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 163发酵:将活化的种子液,按体积百分比为1%接种于MRS液体培养基或者白菜番茄培养基，在MRS液体培养基静置培养24h或白菜番茄培养基静置培养30h后，5000rpm离心即得含细菌素的发酵液。
[0017]以上所述的细菌素的制备方法，其中步骤(2)中所述的白菜番茄培养基配方可以为葡萄糖10g,白菜汁200mL,番爺50mL,蒸懼水750mL, pH6.5。
[0018]一种以上所述的细菌素的分离纯化方法，先将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) 163进行培养发酵，然后采取以下步骤进行:
[0019](1)硫酸铵沉淀纯化:先将植物乳杆菌MRS发酵液浓缩，浓缩液加入粉末状硫酸铵至饱和度60%，搅拌均匀，4°C下离心完全后取上清液继续加入粉末状硫酸铵至饱和度85%，搅拌均匀，4°C下离心完全，得沉淀，沉淀用蒸馏水溶解；
[0020](2) Sephadex G25纯化:将硫酸铵沉淀下来的样品进行浓缩，吸取样品，打开装好SephadexG25柱材料的柱下面的阀门，打开恒流泵，用纯净水充分洗脱，调节流速，利用自动收集器收集馏分；
[0021](3)Sephadex LH-20纯化:S印hadex LH-20装柱，G25纯化出来的活性馏分冻干后加入蒸懼水溶解，上样，用80%甲醇洗脱，流速1.5mL/9min,每懼分接1.5mL,收集懼分,纯化后得到两个活性洗脱峰；
[0022](4) HPLC纯化:第一个活性洗脱峰，利用反相高效液相色谱法纯化，纯化条件:C18 柱，A:水 +0.1%TFA, B:乙腈 +0.1%TFA, Time:60min, A:95%-5%, B: 5%_95% 梯度洗脱，波长:267nm，流速0.4mL/min ;第二个活性洗脱峰，纯化条件:95%A+5%B等度洗脱，A:水+0.1%TFA, B:乙腈 +0.1%TFA,时间:40min，柱子:C18 柱，流速 3mL/min，检测波长 267nm。
[0023]以上所述的细菌素，可以应用于食品防腐或制备抗菌性药物中。
[0024]有益效果
[0025]本发明从植物乳杆菌纯化出两种具有广谱抗菌作用的细菌素(SEQ ID N0.1和SEQID N0.2)，其有益效果如下:
[0026]( 1)来源安全，植物乳杆菌分离自贵州传统发酵食品发酵酸萝卜，有历史悠久的食用历史，故从安全上看，植物乳杆菌的发酵产物(两种细菌素，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2)是可直接食用。
[0027](2)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 163产酸能力强，本身又产生有广谱抗菌作用的细菌素，故可作为工业食品发酵的出发菌，而且可以减少甚至杜绝其所发酵食品其他防腐剂的使用，延长发酵食品的货架期。
[0028](3)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 163产生的广谱抗菌作用的细菌素SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，抗菌谱广，能抑制革兰阳性菌，革兰阴性菌，能作为食品天然防腐剂添加到食品中，延长食品的货架期。
[0029](4)SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2性质较为稳定，pH、温度对其活性影响不大，在PH3-6的范围内以及温度80°C以下，其活性基本可以完全保留，更有利于食品中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是S印hadex LH-20第三次纯化后活性洗脱曲线图。
[0031]图2 是 SEQ ID N01 的 HPL``C 图。
[0032]图 3 是 SEQ ID N01 的 MALD1-TOF-MS 及 MALD1-T0F-MS/MS 图，其中 a 为MALD1-T0F-MS,b 为 MALD1-T0F-MS/MS。
[0033]图4是SEQ ID N01的氨基酸组成分析图。
[0034]图5 是 SEQ ID N02 的 HPLC 图。
[0035]图 6 是 SEQ ID N02 的 MALD1-TOF-MS 图。
[0036]图 7 是 SEQ ID N02 的 MALD1-TOF-MS/MS 图。
【具体实施方式】
[0037]本发明从贵州传统发酵食品酸萝卜中分离纯化出乳酸菌430株，从中筛选出一株能产生广谱抗菌作用细菌素的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)163。主要生物学特征:MRS固体培养基上呈白色或乳白色小点，无芽孢革兰氏阳性菌，短杆状，无鞭毛，过氧化氢酶阴性，能耐受6.5% (质量比，下同)以下NaCl，产酸，不产C02、H2S、NH3，可发酵纤维素、七叶灵，果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、水杨醇、海藻糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、但不能发酵阿拉伯糖和鼠李糖。在特定培养基中发酵培养可产生具有广谱抗菌活性的细菌素。
[0038]植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 163可采用MRS培养基或者白菜番爺培
养基，37 °C静置培养。[0039]以下实施例中所述的MRS培养基与白菜番茄培养基均采用如下配方:
[0040]MRS培养基配方:蛋白胨10g,牛肉浸取物10g,酵母提取液5g,葡萄糖5g,乙酸钠5g,柠檬酸二胺2g，吐温801mL，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g,碳酸?丐 20g,蒸懼水 1L, pH6.4。
[0041]白菜番爺培养基配方:葡萄糖10g,白菜汁200mL,番爺50mL,蒸懼水750mL,pH6.5。
[0042]实施例1
[0043]1、产广谱抗菌细菌素乳酸菌的筛选
[0044](1)乳酸菌纯化:采集样品十倍稀释，得到ιοΛιοΛιο—6三个浓度，取上各浓度
0.lmL，涂布添加碳酸钙的MRS培养基平板，37°C下培养48小时，随机挑取出现溶钙圈的菌落，添加碳酸钙的MRS培养基划线分离纯化，得到溶钙圈明显，菌落形态单一的单菌落，挑取单菌落，进一步分离纯化后进行过氧化氢酶测试及革兰染色法染色，过氧化氢酶测试阴性，革兰染色阳性的菌落，甘油管_70°C保藏。
[0045](2)产细菌素的乳酸菌初筛:
[0046]1)配制MRS固体培养基，倒好平板，待凝固后，接种环或者牙签接种乳酸菌菌株于MRS培养基上，37°C下培育2天，待其长出菌落。
[0047]2)指示菌接种于10mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，37°C摇床培养10小时，按1%(ν/v)接种于50°C，琼脂浓度0.8%的牛肉膏蛋将带指示菌的牛肉膏蛋白胨倾倒在已经长出乳酸菌菌落的MRS培养基上。
[0048]3) 37°C培养，一天后观察其是否出现抑菌圈(抑菌圈大于5mm认为有抑菌效果)。
[0049](3)产细菌素的乳酸菌复筛:初筛呈阳性的菌株，接种活化于MRS培养基后，静置培养24h，5000g离心，得上清液，上清液排除酸抑制及过氧化氢抑制后仍然表现抑菌活性的菌株视为阳性菌。实验得到5株阳性菌，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)163抑菌效果最好。
[0050]2、菌株的鉴定
[0051]生理生化鉴定:根据《伯杰氏细菌鉴定手册》及凌代文的《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》对筛选出来的菌株进行革兰染色及生理生化特性鉴定。
[0052]结果表明，菌株为无芽孢革兰氏阳性菌，短杆状，无鞭毛，过氧化氢酶阴性，能耐受6.5% (质量比，下同)以下NaCl，产酸，不产C02、H2S、NH3，可发酵纤维素、七叶灵，果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、水杨醇、海藻糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、但不能发酵阿拉伯糖和鼠李糖。具体结果见表1。
[0053]表1菌株生理生化鉴定结果
[0054]
【权利要求】
1.一种植物乳杆菌(L3cioAaci77w5.163,菌种保藏号为 CGMCC N0.8224。
2.—种细菌素，其特征在于，由权利要求1所述的植物乳杆菌Uactobacillusplantarum) 163 发酵得到。
3.根据权利要求2所述的细菌素，其特征在于，具有SEQID N0.1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的细菌素，其特征在于，具有SEQID N0.2所示的氨基酸序列。
5.一种权利要求2所述的细菌素的制备方法，其特征在于，由植物乳杆菌{Lactobacillus plan tarum ) 163通过下述步骤培养发酵得到:
(1)植物乳杆菌{Lactobacillusplantarum) 163种子液制备:将保藏的菌种，接种于MRS液体培养基中，37°C静置培养12-16 h ； (2)植物乳杆菌{Lactobacilluspi ant arum') 163发酵:将活化的种子液,按体积百分比为I %接种于MRS液体培养基或者白菜番茄培养基，在MRS液体培养基静置培养24 h或白菜番茄培养基静置培养30 h后，5000 rpm离心即得含细菌素的发酵液。
6.根据权利要求5所述的细菌素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的白菜番茄培养基配方为葡萄糖10 g,白菜汁200 mL,番爺50 mL,蒸懼水750 mL, pH 6.5。
7.—种权利要求2或3或4所述的细菌素的分离纯化方法，其特征在于，先将植物乳杆MiLactobacillus pIantarum) 163进行培养发酵,然后采取以下步骤进行: (1)硫酸铵沉淀纯化:先将植物乳杆菌MRS发酵液浓缩，浓缩液加入粉末状硫酸铵至饱和度60%，搅拌均匀，4°C下离心完全后取上清液继续加入粉末状硫酸铵至饱和度85%，搅拌均匀，4°C下离心完全，得沉淀，沉淀用蒸馏水溶解； (2)Sephadex G25纯化:将硫酸铵沉淀下来的样品进行浓缩，吸取样品，打开装好Sephadex G25柱材料的柱下面的阀门，打开恒流泵，用纯净水充分洗脱，调节流速，利用自动收集器收集馏分； (3)SephadexLH-20纯化:S印hadex LH-20装柱，G25纯化出来的活性馏分冻干后加入蒸懼水溶解，上样，用80 %甲醇洗脱,流速1.5 mL/9 111；[11,每懼分接1.5 mL,收集懼分,纯化后得到两个活性洗脱峰； (4)HPLC纯化:第一个活性洗脱峰，利用反相高效液相色谱法纯化，纯化条件:C18柱，A:水 +0.1 %TFA, B:乙腈 +0.1 %TFA, Time:60 min, A: 95 %-5 %，B:5 %-95 % 梯度洗脱，波长:267 nm，流速0.4 mL/min ;第二个活性洗脱峰，纯化条件:95%A+5%B等度洗脱，A:水+0.1%TFA, B:乙腈 +0.1%TFA,时间:40min，柱子:C18 柱，流速 3mL/min，检测波长 267nm。
8.权利要求2或3或4所述的细菌素在食品防腐中的应用。
9.权利要求2或3或4所述的细菌素在制备抗菌性药物中的应用。
【文档编号】C07K1/30GK103667106SQ201310470098
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】陆兆新, 胡美忠, 吕凤霞, 别小妹, 张充, 赵海珍 申请人:南京农业大学