热胁迫相关蛋白AtGCN5及其编码基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种热胁迫相关蛋白AtGCN5及其编码基因的应用。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，是将编码AtGCN5蛋白的基因导入目的植物，得到耐高温胁迫能力高于所述目的植物的转基因植物；所述AtGCN5蛋白为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐高温胁迫能力相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明通过转基因的方法对AtGCN5蛋白的功能进行深入分析和鉴定，进一步明确了AtGCN5蛋白在拟南芥响应高温胁迫中的作用。本发明对于培育耐高温植物具有重大价值。
【专利说明】热胁迫相关蛋白AtGCN5及其编码基因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种热胁迫相关蛋白AtGCN5及其编码基因的应用。
【背景技术】
[0002]在作物生长、发育过程中，除了受到病虫等生物因素的侵袭外，也常常受到不良气候和土壤因素的影响，而使产量和品质受到影响，这种不良影响称为环境胁迫或非生物逆境。随着全球变暖，水资源短缺，土壤沙化、盐碱化，作物所经受的非生物胁迫会越来越频繁，越来越严重。
[0003]增强作物对非生物胁迫的抗性是育种家的主要工作之一，对于非生物胁迫在模式植物拟南芥取得的研究成果可以在农作物上应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种热胁迫相关蛋白AtGCN5及其编码基因的应用。
[0005]本发明提供了一种培育转基因植物的方法，是将编码AtGCN5蛋白的基因导入目的植物，得到耐高温胁迫能力高于所述目的植物的转基因植物；所述AtGCN5蛋白为如下
(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐高温胁迫能力相关的由序列I衍生的蛋白质。
[0006]所述编码AtGCN5蛋白的基因可为如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(`2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜一次。
[0007]所述编码AtGCN5蛋白的基因可通过重组表达载体导入所述目的植物。可用现有的植物表达载体构建含有所述编码AtGCN5蛋白的基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述编码AtGCN5蛋白的基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述编码AtGCN5蛋白的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为将所述编码AtGCN5蛋白的基因插入pCAMBIA-1300载体的多克隆位点(如KpnI和SacI酶切位点之间)得到的重组质粒。
[0008]所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0009]所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。
[0010]本发明还保护所述AtGCN5蛋白、所述编码所述AtGCN5蛋白的基因、含有所述编码所述AtGCN5蛋白的基因的重组表达载体、含有所述编码所述AtGCN5蛋白的基因的表达盒、含有所述编码所述AtGCN5蛋白的基因的转基因细胞系或含有所述编码所述AtGCN5蛋白的基因的重组菌在培育具有耐高温胁迫能力的转基因植物中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。
[0011]本发明还保护以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。
[0012]本发明还保护所述AtGCN5蛋白在调节植物耐高温胁迫能力中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为拟南芥，如gcn5突变体。
[0013]以上任一所述的高温具体可为38°C以上。
[0014]高温这一非生物逆境是影响植物生长发育的重要因子。本发明以拟南芥为基础，通过对突变体进行耐热性鉴定，发现gcn5突变体对高温极为敏感，本发明通过转基因的方法对AtGCN5蛋白的功能进行深入分析和鉴定，进一步明确了 AtGCN5蛋白在拟南芥响应高温胁迫中的作用。本发明对于培育耐高温植物具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为实施例1中的表型照片。
[0016]图2为实施例2中的表型照片。
【具体实施方式】
[0017]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pCAMBIA-1300载体:Cambia公司。农杆菌GV3101:Biovector公司。gcn5突变体与瓦斯莱生态型拟南芥的差异仅在于AtGCN5基因突变失活了。
[0018]瓦斯莱生态型拟南芥(用“Ws”表示):参考文献:Bertrand, C., Bergounioux, C., Domenichini, S., Delarue, M., and Zhou, D.X.(2003).Arabidopsis histoneacetyltransferase AtGCN5regulates the floral meristem activity through theWUSCHEL/AGAMOUS pathway.J.Biol.Chem.278，28246 - 28251。
[0019]gcn5突变体(即文献中的AtGCN5mutant，用“gcn5”表示):参考文献:Bertrand，C.，Bergouniouxj C.，Domenichini, S.，Delarue, Μ.，and Zhou, D.X.(2003).Arabidopsishistone acetyltransferase AtGCN5regulates the floral meristem activity throughthe WUSCHEL/AGAMOUS pathway.J.Biol.Chem.278，28246 - 28251。
[0020]实施例1、瓦斯莱生态型拟南芥和gcn5突变体的比较
[0021]正常条件下，在MS培养基上生长14天的瓦斯莱生态型拟南芥和gcn5突变体的表型见图1A。在MS培养基上的瓦斯莱生态型拟南芥和gcn5突变体，先在正常条件下培养8天，然后在38°C环境中热胁迫培养4天，随后在正常条件下恢复2天的表型见图1B。与瓦斯莱生态型拟南芥相比，gcn5突变体受高温胁迫后叶片失绿，成活率明显降低(瓦斯莱生态型拟南芥的成活率为95.22%±2.89%，gcn5突变体的成活率为9.48%±3.31%)。
[0022]为了分析AtGCN5基因与植物耐热性的关系，以瓦斯莱生态型拟南芥及其gcn5突变体为材料，在抽薹前选取第5片叶，对叶片细胞膜热稳定性进行测定。gcn5突变体叶片的相对电导率(80.83%)明显高于瓦斯莱生态型拟南芥(51.07%)。
[0023]结果表明，与瓦斯莱生态型拟南芥相比，gcn5突变体对热更为敏感。进一步说明AtGCN5基因突变后导致拟南芥耐热性下降，说明该基因对拟南芥耐热性有重要贡献。
[0024]实施例2、转基因植物的获得和鉴定
[0025]一、重组质粒的构建
[0026]1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0027]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0028]Fl:5，-CACCCGGGGTACCATGGACTCTCACTCTTCCCA-3’ ；
[0029]Rl:5，-CTGGGTCGAGCTCCTATTGAGATTTAGCACC-3，。
[0030]3、用限制性内切酶KpnI和SacI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0031]4、用限制性内切酶KpnI和SacI双酶切pCAMBIA-1300载体，回收载体骨架。
[0032]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下:在pCAMBIA-1300载体的KpnI和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0033]二、转基因植物的获得
[0034]1、将步骤一构建的重组质粒转化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
[0035]2、取gcn5突变体种子，4°C春化3天后播种于MS培养基，培养(22°C /18°C、16小时光照/8小时黑暗、60% -70%湿度)，生长到两片真叶时移栽到填充有培养基质(培养基质为等体积混合的营养土和蛭石)的种植钵中，植株开花后剪去主枝顶端以促进侧枝发展，将剪枝后4-6天的植株倒置于步骤I得到的重组农杆菌的菌悬液中浸泡，然后取出植株，用充满气的黑色塑料袋包住，平放，22°C暗培养24小时，然后去掉塑料袋将种植钵直立，培养(220C /18°C、16小时光照/8小时黑暗、60% -70%湿度)至植株至结实，收获Ttl代种子。
[0036]3、取Ttl代种子，4°C春化3天后平铺于含60μ 1/lOOml潮霉素的MS培养基，培养(220C /18°C、16h光照/8h黑暗、60% -70%湿度)7天后挑选阳性植株(阳性植株表现为:真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中)，将阳性植株转移至MS培养基并采用相同条件培养10天，然后再转移至土壤并采用相同条件培养植株至结实，收获T1代种子。
[0037]4、取T1代种子，按照步骤3的方法筛选阳性植株并收获T2代种子。
[0038]5、取T2代种子，按照步骤3的方法筛选阳性植株。[0039]对于某一 T1代植株，如果其T2代植株均为阳性植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。
[0040]6、将T2代植株自交，获得T3代种子。
[0041]三、转空载体植株的获得
[0042]用pCAMBIA-1300载体代替步骤一构建的重组质粒，其它同步骤二，得到转空载体植株。
[0043]四、表型比较和成活率统计
[0044]分别将步骤二得到的转基因株系的T3代种子、步骤三得到的转空载体株系的1~3代种子、瓦斯莱生态型拟南芥的种子和gcn5突变体的种子(每个株系50粒)进行热胁迫下的表型比较和成活率检测，方法如下:种子消毒后，用无菌水清洗6-7次，平铺于MS培养基，4°C春化3天，然后培养(22°C /18°C、16h光照/8h黑暗、60 % -70 %湿度)8天，然后培养(即热胁迫处理；38°C、16h光照/8h黑暗、60% -70%湿度)4天，然后培养(22°C /18°C、16h光照/8h黑暗、60%-70%湿度)2天，拍照并统计成活率。照片见图2A。转基因株系与瓦斯莱生态型拟南芥均长势良好，二者之间没有显著差异。转空载体株系与gcn5突变体均长势不佳，二者之间没有显著差异。转基因株系的T3代种子的成活率为95%，瓦斯莱生态型拟南芥的种子的成活率为95.22%，转空载体株系的T3代种子的成活率为9.36%，gcn5突变体的种子的成活率为9.48%。结果表明，导入AtGCN5基因可以显著增强gcn5突变体的耐高温胁迫能力。
[0045]分别将步骤二得到的转基因株系的T3代种子、步骤三得到的转空载体株系的T3代种子、瓦斯莱生态型拟南芥的种子和gcn5突变体的种子进行热胁迫下的表型比较，方法如下:种子消毒后，用无菌水清洗6-7次，平铺于MS培养基，4°C春化3天，然后培养(22 °C /18 °C、16h光照/8h黑暗、60 % -70 %湿度)8天，然后移栽至培养基质(培养基质为等体积混合的营养土和蛭石)中培养(22°C /18°C、16h光照/8h黑暗、60% -70%湿度)14天，然后培养(即热胁迫处理；38°C、16h光照/8h黑暗、60% -70%湿度)4天，然后培养(22°C/18°C、16h光照/8h黑暗、60%-70%湿度)2天，拍照。照片见图2B。转基因株系与瓦斯莱生态型拟南芥均长势良好，二者之间没有显著差异。转空载体株系与gcn5突变体均长势不佳，二者之间没有显著差异。结果表明，导入AtGCN5基因可以显著增强gcn5突变体的耐高温胁迫能力。
[0046]分别将步骤二得到的转基因株系的T3代种子、步骤三得到的转空载体株系的1~3代种子、瓦斯莱生态型拟南芥的种子和gcn5突变体的种子进行正常培养条件下的表型比较，方法如下:种子消毒后，用无菌水清洗6-7次，平铺于MS培养基，4°C春化3天，然后培养(220C /18°C、16h光照/8h黑暗、60% -70%湿度)8天，然后移栽至培养基质(培养基质为等体积混合的营养土和蛭石)中培养(22°C /18°C、16h光照/8h黑暗、60% -70%湿度)21天，拍照。照片见图2C。转基因株系与瓦斯莱生态型拟南芥均长势良好，二者之间没有显著差异。转空载体株系与gcn5突变体均长势不佳，二者之间没有显著差异。结果表明，在正常培养条件下，导入AtGCN5基因可以回补gcn5突变体的表型至瓦斯莱生态型拟南芥的表型。 [0047]结果表明，AtGCN5基因突变失活后，拟南芥的耐热性显著下降，在突变植株中导入AtGCN5基因则可以回补突变植株对热胁迫的耐逆性，AtGCN5基因对拟南芥耐热性具有重要贡献。
【权利要求】
1.一种培育转基因植物的方法，是将编码AtGCN5蛋白的基因导入目的植物，得到耐高温胁迫能力高于所述目的植物的转基因植物；所述AtGCN5蛋白为如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐高温胁迫能力相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述编码AtGCN5蛋白的基因为如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述编码AtGCN5蛋白的基因通过重组表达载体导入所述目的植物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体为将所述编码AtGCN5蛋白的基因插入pCAMBIA-1300载体的多克隆位点得到的重组质粒。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
6.AtGCN5蛋白、编码所述AtGCN5蛋白的基因、含有编码所述AtGCN5蛋白的基因的重组表达载体、含有编码所述AtGCN5蛋白的基因的表达盒、含有编码所述AtGCN5蛋白的基因的转基因细胞系或含有编码所述AtGCN5蛋白的基因的重组菌在培育具有耐高温胁迫能力的转基因植物中的应用；所述AtGCN5蛋白为如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所不的氣基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物耐高温胁迫能力相关的由序列I衍生的蛋白质。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于:所述编码AtGCN5蛋白的基因为如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且与植物耐高温胁迫能力相关的蛋白的DNA分子。
8.权利要求1至5中任一所述方法在植物育种中的应用。
9.AtGCN5蛋白在调节植物耐高温胁迫能力中的应用；所述AtGCN5蛋白为如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐高温胁迫能力相关的由序列I衍生的蛋白质。
【文档编号】C07K14/415GK103525827SQ201310478446
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】胡兆荣, 孙其信, 宋娜, 倪中福, 姚颖垠, 彭惠茹, 解超杰, 杜金昆, 梁荣奇 申请人:中国农业大学