液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法
【专利摘要】本发明提供了一种液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，属于生化【技术领域】。该方法利用高荷载量（≥0.8mmol/g树脂）的树脂为起始原料，先采用标准的固相多肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相缩合技术连接肽片段，从而获得高纯度(＞99%)的目标肽。相比较固相合成胸腺肽α1的工艺，本发明避免了12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α1的收率（达25～30%）；同时固相合成的肽片段不必纯化，简化了后处理工艺，最终采用高效液相色谱纯化胸腺肽α1，制备难度降低，制备次数减少，胸腺肽α1的合成成本降低，有利于实现规模化、产业化生产。
【专利说明】液相片段缩合制备胸腺肽ct1的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生化【技术领域】，涉及一种胸腺肽α I的合成方法，尤其涉及一种液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法。
【背景技术】
[0002]胸腺肽α I (又称胸腺素α 1、胸腺法新)是一种具有下式结构的胸腺肽:Ac_SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。胸腺肽α I是哺乳动物胸腺中存在的单一组分的多肽化合物，是由28个氨基酸残基和N端氨基酸乙酰化构成的多肽，是与免疫细胞发育分化相关的分子，具有使T淋巴细胞分化、增殖、提高细胞免疫功能的作用，能破坏被感染的靶细胞，还可激活NK细胞活性，促进与免疫相关的细胞因子的产生。胸腺肽α I的活性较胸腺五肽高10到1000倍，是复合治疗慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷综合症药物，在非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤治疗中也发挥了较大的作用。胸腺肽α I于1997年由意大利赛生(Sciclone)公司开发上市，现己被24个国家批准用于慢性乙型肝炎(HBV)的治疗，在欧美日等国也用于治疗丙型肝炎(HCV)、肝细胞癌及增强免疫疾病的治疗。
[0003]1983年公开的美国专利US4504415使用全液相合成胸腺肽α I。最近的胸腺肽α I及其类似物的制备方法主要有两种，其中一种是采用生物合成技术，在2003年I月I日公开的中国发明专利(CN1388133A)中，利用人工基因合成技术获得胸腺肽α I的全序列。另一种为固相合成方法，“化学 学报”2004年第55卷第2期《胸腺素α I的DIC固相化学合成与鉴定》中提到，以Wang Resin为起始原料，通过激活试剂DIC+HOBt将Fmoc-Asn (Trt) -OH与树脂相连接；“天津药学”2001年6月第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α I及其反应途径》中提到，以HMP树脂为起始原料，通过激活试剂DCC+ HOBt将Fmoc-Asn(Trt)-OH与树脂相连接。中国专利 CN200610024610.0、CN200680014615.3、CN200710024406.3、CN200780024724.8、CN201110069876.8 均为固相合成胸腺肽 α I。
[0004]综合参考国内外关于胸腺肽α I制备方法以及相关的合成报道文献，发现这些技术都存在一些不足，主要表现在:①全液相合成费时，需要良好的后处理技术生物合成技术难以规模化生产；③常规固相合成方法难以获得高纯度的胸腺肽α 1，而且收率低(5~10%)，导致生产成本高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法。
[0006]本发明液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法，包括在固相支持体上合成胸腺肽α I的侧链保护肽片段，在液相中缩合侧链保护肽片段，形成保护的胸腺肽α 1，然后将侧链和羧基端去保护，获得目的肽。其具体制备工艺如下:
(I)将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到结构为Fmoc-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段，并使该肽片段的氨基端去保护，得到结构为nh2-evveeaen-y的侧链保护肽； (2)采用液相片段缩合方法，将侧链保护肽Nh2-EvvEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；并使该肽片段的氨基端去保护，得nh2-kekkevveeaen-y ；
(3)将Fmoc-EITTKD-COOH侧链保护肽与Leu-OBzl反应得到侧链保护肽Fmoc-EITTKDL-OBz I，并将氨基Fmoc脱去，得到侧链保护肽NH2-EI TTKDL-OBz I，再采用液相片段缩合法将NH2-EITTKDL-OBzl侧链保护肽与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽缩合，产生结构为侧链保护肽Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl ;再将肽氨基末端乙酰化，得侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSE I TTKDL-OBz I，并脱去羧基端Bz I保护，得到Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ；
或将侧链保护肽NH2-EI TTKDL-OBz I与侧链保护肽Ac-SDAAVDTSS-COOH缩合得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSE I TTKDL-OBz I，并脱去羧基端Bz I保护，得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ；
(4)采用液相片段缩合方法将羧基保护的侧链保护肽nh2-kekkevveeaen-y与结构为Ac-SDAAVDTSSE ITTKDL-C00H 的侧链保护肽反应，产生结构为 Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
(5)将肽Ac-SDAAVDTSSEI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽 Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH ；
本发明液相片段缩合制备胸腺肽αI的方法也可以由以下工艺步骤完成:
Cl)将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到Fmoc-EVVEEAEN-Y ;将肽氨基端去保护，得侧链保护肽NH2-EVVEEAEN_Y ；
(2)采用液相片段缩合方法，使侧链保护肽Nh2-EWEEAEN-Y与结构为Fmoc-EITTKDLKEKK-COOH 的侧链保护肽反应，产生结构为 Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y 羧基保护的侧链保护肽，并将肽氨基端去保护，得肽nh2-eittkdlkekkevveeaen-y ；
(3 )采用液相片段缩合方法，使侧链保护肽NH2-EI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；再将肽氨基末端乙酰化，得肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y ；
或将肽 NH2-EI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y 与结构为 Ac-SDAAVDTSS_COOH 的肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
(4)将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽 Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。
[0007]上述两种合成工艺中，各步骤所涉及的片段肽中，Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基、三苯甲基。各步骤所涉及的肽片段均是以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法而得。
[0008]上述方法合成的产物经高效液相色谱分析、质谱分析检测，表明目标肽成功合成。
[0009]本发明相对现有技术具有以下优点:
1、本发明利用高荷载量O 0.8mmol/g树脂)的树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相缩合技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(> 99%)的目标肽；
2、相比较固相合成胸腺肽αI的工艺，本发明避免了 12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α I的收率(达25~30%)；
3、对生产的肽片段不必用色谱技术来纯化，只需要使用前进行沉淀、研磨，大大简化了后处理工艺；在最终高效液相色谱纯化中减少制备次数，降低了胸腺肽α I的合成成本，有利于实现规模化、产业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明制备的胸腺肽α I粗肽分析色谱图；
图2为本发明制备的胸腺肽αI纯肽分析色谱图；
图3为本发明制备的胸腺肽αI纯肽质谱图；
图4为实施例一的2+2片段合成胸腺肽α I的工艺路线图；
图5为实施例二的三片段合成胸腺肽αI的工艺路线图。
【具体实施方式】
[0011]下面通过具体实施例对本发明液相片段缩合制备胸腺肽α I的合成工艺作进一步说明。
[0012]下列各实施例中，合成胸腺肽α I所涉及的目的肽及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表1。各实施例中肽片段组合方式见表2。中间片段肽的氨基酸序列见表3。本发明所涉及氨基酸的缩写见的表4。
【权利要求】
1.一种液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法，包括以下工艺步骤: (1)将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到结构为Fmoc-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段，并使该肽片段的氨基端去保护，得到结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽； (2)采用液相片段缩合方法，将侧链保护肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；并使该肽片段的氨基端去保护，得nh2-kekkevveeaen-y ； (3)将Fmoc-EITTKD-COOH侧链保护肽与Leu-OBzl反应得到侧链保护肽Fmoc-EITTKDL-OBzl，并将氨基Fmoc脱去，得到侧链保护肽NH2-EITTKDL-OBzI，再采用液相片段缩合法将NH2-EITTKDL-OBzl侧链保护肽与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽缩合，产生侧链保护肽Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl ;再将肽氨基末端乙酰化，得侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBz I，并脱去羧基端Bz I保护，得到Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ； 或将侧链保护肽NH2-EI TTKDL-OBz I与侧链保护肽Ac-SDAAVDTSS-COOH缩合得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSE I TTKDL-OBz I，并脱去羧基端Bz I保护，得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ； (4)采用液相片段缩合方法将羧基保护的侧链保护肽nh2-kekkevveeaen-y与结构为Ac-SDAAVDTSSE ITTKDL-C00H 的侧链保护肽反应，产生结构为 Ac-SDAAVDTSSE ITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽； (5)将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽 Ac-SDAAVDTSSE ITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH ； 上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
2.如权利要求1所述液相片段缩合制备胸腺肽αI的方法，其特征在于:各肽片段是以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法而得。
3.一种液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法，包括以下工艺步骤: Cl)将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到Fmoc-EVVEEAEN-Y ;将肽氨基端去保护，得肽 NH2-EVVEEAEN_Y ； (2)采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-EITTKDLKEKK-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽，并将肽氨基端去保护，得肽NH2-EI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y ； (3)采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH 的侧链保护肽反应，产生结构为 Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；再将肽氨基末端乙酰化，得肽Ac-SDAAVDTSSE ITTKDLKEKKEWEEAEN-Y ； 或将肽NH2-EI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Ac-SDAAVDTSS_COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽； (4)将肽Ac-SDAAVDTSSEI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽 Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH ； 上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
4.如权利要求3所述液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法，其特征在于:各肽片段是以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法而得。
【文档编号】C07K1/02GK103665144SQ201310523577
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】王锐, 常民, 彭雅丽, 薛宏祥, 李明生 申请人:江苏施美康药业股份有限公司