一种褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种褪黑素半抗原，以及由该半抗原制备的褪黑素完全抗原，该褪黑素完全抗原的结构式如P2所示：式中，k为1～5的自然数，R为载体蛋白，n为10～20的自然数；该褪黑素完全抗原中，其褪黑素分子的抗原决定簇能充分暴露，且具有较完整的空间构象，因此，本发明提供的褪黑素完全抗原具有较好的免疫原性。本发明还提供了一种褪黑素半抗原及褪黑素完全抗原的制备方法和应用。
【专利说明】一种褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]免疫分析是以抗原与抗体之间特异性识别和可逆性结合反应为基础的痕量分析方法，其不仅适用于大分子化合物(如蛋白质、核酸、细菌)的检测，也适用于小分子化合物(如激素、药物)的测定。建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制备出对小分子化合物具有高亲和力和高选择性的抗体。由于大多数小分子化合物的分子量小于1000，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体等产生特异性抗体。然而，小分子化合物可以通过适当的化学修饰方法，与大分子载体结合，生成小分子化合物-大分子载体的偶联物，此偶联物即为完全抗原，它可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖及分化，产生特异性抗体。
[0003]褪黑素(Melatonin，MLT)是一种小分子物质，化学名为N-乙酰_5_甲氧基色胺，分子量仅为232.28D，不具有免疫原性，用于免疫，必须先与蛋白质大分子载体结合，形成褪黑素-蛋白质载体偶联的完全抗原后才具免疫原性。然而，制备褪黑素-蛋白质载体偶联的完全抗原不能影响褪黑素的空间构象，而且需要保持褪黑素抗原决定簇(如5-甲氧基、N-烷基侧链)的有效性，才能获得效价高、特异性强的褪黑素抗体。因此，如何制备具有良好免疫原性的完全抗原是建立测定褪黑素的免疫分析方法的难点。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明第一方面，本发明提供了一种褪黑素半抗原；
`[0005]第二方面提供了一种褪黑素完全抗原，该褪黑素完全抗原能充分暴露褪黑素的抗原决定簇，并保持褪黑素的空间构象，以该褪黑素完全抗原为免疫原制备的单克隆抗体和多克隆抗体对褪黑素具有较高的特异性和灵敏性；
[0006]本发明第三方面还提供了一种褪黑素半抗原的制备方法，该制备方法将褪黑素进行硝化、还原、衍生化并水解后，制得了含连接臂的褪黑素半抗原，
[0007]本发明第四方面还提供了一种褪黑素完全抗原的制备方法，该方法将该褪黑素半抗原再与载体蛋白进行偶联，即得到褪黑素完全抗原；
[0008]本发明第五方面还提供了一种褪黑素完全抗原的应用。
[0009]第一方面，本发明提供了一种褪黑素半抗原，结构式如Pl所示:
[0010]
【权利要求】
1.一种褪黑素半抗原，其特征在于，结构式如P1所示:
2.一种褪黑素完全抗原，其特征在于，结构式如P2所示:
3.如权利要求2所述的一种褪黑素完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。
4.一种褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: S10、提供褪黑素，其结构式如A所示:
5.如权利要求4所述的褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤SlO中，所述硝酸盐为硝酸钠或硝酸钾。
6.如权利要求4所述的褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤S20中，所述还原性金属为锌或铁；所述反应液的pH为I~3 ;所述第一有机溶剂为乙醇或甲醇。
7.如权利要求4所述的褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤S30中，所述缚酸剂为碳酸钠或碳酸钾；所述缚酸剂的用量为所述化合物C摩尔浓度的2.5~3.5倍；所述第二有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；所述步骤S40中，所述第三有机溶剂为甲醇与水的混合液或乙醇与水的混合液。
8.—种褪黑素完全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (I )、将如权利要求4所制备的褪黑素半抗原溶解在N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，然后加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，得到第一反应液，在15~20°C下搅拌反应2~3小时后，得到第二反应液，其中，在所述第一反应液中，所述1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔浓度分别为所述褪黑素半抗原摩尔浓度的1.0~1.1、1.0~1.2倍； (2)、将载体蛋白加入磷酸盐缓冲液得到载体蛋白溶液，其中，所述步骤(1)制备的第一反应液中褪黑素半抗原的摩尔浓度为所得载体蛋白溶液中载体蛋白摩尔浓度的10~20倍;(3)、将步骤(1)所得的第二反应液逐滴加入到步骤(2)配置的所述载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，在15~20°C下搅拌反应6~8小时后，得到含褪黑素完全抗原的混合溶液，将所述含褪黑素完全抗原的混合溶液进行透析后离心，得到含褪黑素完全抗原的上清溶液，所述褪黑素完全抗原的结构式如P2所示:
9.如权利要求8所述的一种褪黑素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。
10.如权利要求2所述的褪黑素完全抗原在制备检测褪黑素的药物或试剂盒中的应用。
【文档编号】C07K1/107GK103601662SQ201310593798
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】王铁杰, 殷果, 韩东岐, 鲁艺, 王珏, 秦斌, 谭渺, 闫研, 关潇滢, 黎雪清, 王防修, 蒋永青 申请人:深圳市药品检验所