一种适用于大规模生产的结核分枝杆菌rTPA38蛋白包涵体初纯的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，涉及结核分枝杆菌rTPA38蛋白包涵体初纯的方法。具体的技术方案是通过菌体的获得、破碎，四次洗涤的步骤得到了初纯的包涵体。本方法适合工业化大生产，批量大，一次性可处理100g至5000g?rTPA38菌体，破碎效果高，破碎率可达99.9%以上，收率高，包涵体收率达90%以上，包涵体中rTPA38蛋白纯度高，rTPA38包涵体目的蛋白纯度(电泳)达到50%以上，并给后续纯化工作降低了难度，且不影响rTPA38蛋白的活性。
【专利说明】—种适用于大规模生产的结核分枝杆菌「TPA38蛋白包涵体初纯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及结核分枝杆菌rTPA38蛋白包涵体初纯的方法。
【背景技术】
[0002]结核病是由结核分枝杆菌复合群感染引起的多器官感染性疾病，主要为肺结核。其中我国每年新发患者高达150万。结核杆菌流行病学的一个重要特征是结核分枝杆菌的潜伏感染。结核分枝杆菌潜伏性感染是一种亚临床状态，无放射检查征象，细菌呈休眠状态，约有10%的结核分枝杆菌潜伏性感染人群一生中会发展成为结核病患者。
[0003]目前结核杆菌潜伏感染人群尚无诊断金标准，PPD皮试试验是诊断结核杆菌潜伏感染人群的常用方法，但这一方法有一定的缺陷性，因为试验所用pro抗原为结核分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗(即BCG)所共有，具有交叉反应，诊断特异性差。我国是普遍接种卡介苗的国家，而由于卡介苗接种者和结核杆菌自然感染者对pro试验的反应在表现上很难区分，即使采用上 述的pro皮试试验强阳性作为判断标准，仍然会有一部分卡介苗接种者以及非致病性分枝杆菌的感染者被纳入结核杆菌潜伏感染人群中，因此导致PPD试验在结核杆菌潜伏感染人群诊断中的实际作用十分有限。需寻找一种新的特异性高、副作用小的制剂代替。重组结核分支杆菌蛋白38K D a(r T P A38)是结核分支杆菌的一种脂蛋白和主要抗原，其诱发豚鼠迟发型超敏反应D T H的效果优于其它单一抗原。用于结核病血清学检测的敏感性和特异性较高。因此，r T P A38蛋白是目前具有较好应用前景的蛋白。
[0004]大肠杆菌表达系统因遗传背景清楚、基因操作简单、表达水平高、发酵成本低和易于工业规模放大等优点而成为药用重组TPA38KDa (recombinant TPA38KD, rTPA38KDa)的理想宿主系统。因MTB与大肠杆菌在进化上近源，所以MTB来源的天然或经简单改造的TPA38KDa编码序列在强启动子(如T7启动子)的控制下很容易获得高效表达，表达水平一般能达到30%以上。与其它在大肠杆菌系统高效表达的目的蛋白一样，TPA38KDa的高效表达产物也是一种无活性的、水不溶的包涵体蛋白，必须采取适当的复性和纯化方法才能获得药用级的产品。但是现有技术中包涵体的初步纯化中得率低，成本高，难以应用于大规模生产。
[0005]因此，针对现有技术中的不足，亟需提供一种可工业化放大、便于质控、效率高、节约生产成本的药用级的结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的纯化方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供:一种结核分枝杆菌rTPA38蛋白包涵体初纯的方法，从而收集扩增得到的大量包涵体，获得大量的纯化后的目的蛋白，促进了 r T P A38蛋白用于大规模使用。
[0007]本发明的技术方案:一种结核分枝杆菌rTPA38蛋白包涵体初纯的方法，包括如下步骤:
[0008]一.菌体前处理:
[0009](I)菌体悬浮:将发酵培养的表达rTPA38蛋白的初始工程菌菌体解冻，解冻后，用rTPA38菌体悬浮缓冲液稀释，然后在不锈钢菌体处理罐中搅拌至完全悬浮均匀，搅拌电机频率45Hz。包涵体菌体处理罐夹套内通入_5°C -0°C冷冻水将菌体悬浮液降至温度低于15°C以下；
[0010](2)菌体破碎:用硅胶管将不锈钢菌体处理罐出料口与高压均质机进料口连接，将菌体悬浮液以1.35L每分钟的流速通入高压均质机，用800bar的压力破碎处理，破碎压力约80MPa，处理后的菌液接入不锈钢桶中，再返回不锈钢菌体处理罐中搅拌冷却至低于15°C后再次破碎，重复进行，连续三次；
[0011](3)离心:将高压均质破碎三次后的菌体破碎液离心，废弃上清液，收集沉淀即得粗包涵体；
[0012]二.包涵体洗涤:
[0013](I)第一次包涵体洗涤:1.搅拌悬浮:粗包涵体按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL) (2%Triton-X100, IOOmM NaCl, ImM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl，0.5% 巯基乙醇)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，离心收集包涵体沉淀，废弃上清液；
[0014](2)第二次包涵体洗涤:1.搅拌悬浮:将第一次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) / 缓冲液体积(mL)(l%Triton-X100, IOOmM NaCl, ImM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl,
0.1%巯基乙醇)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，离心收集包涵体沉淀，废弃上清液；
[0015](3)第三次包涵体洗涤:1.搅拌悬浮:将第二次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) / 缓冲液体积(mL) (ImM EDTA2Na, pH8.020mM Tris-HCl)的比例将 rTPA38 粗包涵体稀释离心收集包涵体沉淀，废弃上清液；
[0016](4)第四次包涵体洗涤:a.搅拌悬浮:将第三次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL) (ImM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，离心即得经初纯后的包涵体，并在_30°C保存。
[0017]本发明的有益效果:本发明的方法，适合工业化大生产，批量大，一次性可处理100g至5000g rTPA38菌体，破碎效果高，破碎率可达99.9%以上，收率高，包涵体收率达90%以上，包涵体中rTPA38蛋白纯度高，rTPA38包涵体目的蛋白纯度(电泳)达到50%以上，并给后续纯化工作降低了难度，且不影响rTPA38蛋白的活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图lrTPA38菌体破碎前革兰氏染色后光学显微镜图
[0019]图2rTPA38菌体破碎后革兰氏染色后光学显微镜图
[0020]图3rTPA38包涵体电泳图谱(I泳道:菌体破碎后得到的粗包涵体；2泳道:第一次洗涤后得到的包涵体；3泳道:第三次洗涤后得到的包涵体；4泳道:第四次洗涤后得到的包涵体)
[0021]图4rTPA38包涵体初纯方法工艺流程图【具体实施方式】[0022]实施例1:菌体前处理:
[0023](I)将结核分枝杆菌rTPA38蛋白与PET表达载体连接，经诱导表达后得到以包涵体的方式表达的重组大肠杆菌菌体，冷冻保存。
[0024]菌体悬浮:将发酵培养的表达rTPA38蛋白的初始工程菌菌体置37°C恒温水浴锅中解冻，解冻后，按1:20 (菌体重量(g) /缓冲液体积(mL))的比例用rTPA38菌体悬浮缓冲液(IOOmM NaCl,lmM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH8.0)稀释，然后在不锈钢菌体处理罐中搅拌至完全悬浮均匀，搅 拌电机频率45Hz。包涵体菌体处理罐夹套内通入_5°C -0°C冷冻水将菌体悬浮液降至温度低于15°C以下；
[0025](2)菌体破碎:用硅胶管将不锈钢菌体处理罐出料口与高压均质机进料口连接，将菌体悬浮液以1.35L每分钟的流速通入高压均质机，用800bar的压力破碎处理，破碎压力约80MPa，处理后的菌液接入不锈钢桶中，再返回不锈钢菌体处理罐中搅拌冷，却至低于15°C后再次破碎，重复进行，连续三次；
[0026](3)离心:将高压均质破碎三次后的菌体破碎液离心(4°C，8000rpm，12min)，废弃上清液，收集沉淀即得粗包涵体。从图2可以看出，菌体破碎非常完全，几乎不存在没有破碎的菌体，说明破碎的方法非常成功，图1是未破碎之前解冻后观测到的的菌体图像。
[0027]实施例2:包涵体洗涤
[0028](I)第一次包涵体洗涤:1.搅拌悬浮:粗包涵体按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL) (2%Triton-X100, IOOmM NaCl, ImM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl，0.5% 巯基乙醇)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约30°C ±5°C。2.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min至20min，收集包涵体沉淀，废弃上清液；
[0029](2)第二次包涵体洗涤:1.搅拌悬浮:将第一次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) / 缓冲液体积(mL)(l%Triton-X100, IOOmM NaCl, ImM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl,
0.1%巯基乙醇)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约30°C ±5°C。2.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm,离心温度为4°C,离心时间为15min至20min,收集包涵体沉淀,废弃上清液；
[0030](3)第三次包涵体洗涤:1.搅拌悬浮:将第二次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL) (ImM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约300C ±5°C。2.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min至20min,收集包涵体沉淀,废弃上清液；
[0031](4)第四次包涵体洗涤:a.搅拌悬浮:将第三次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL) (ImM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约300C ±5°C ；b.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min至20min，c.收集:收集包涵体沉淀，废弃上清液，即得经初纯后的包涵体，并在_30°C保存。通过图3电泳检测可以看出，第四次洗涤之后包涵体已经非常纯净，几乎没有杂蛋白的干扰。
[0032]实施例3常规的方法获得的包涵体[0033]菌体构建及表达同实施例1。取出冷冻后的菌体，以30ml/mg重悬于细胞超声波破碎缓冲液(50mmol/LTris.HCl ρΗ8.0 ；lmmol/L EDTA ;50mmol/L NaCl ;5%甘油)，冰浴条件下进行超声波破碎，12000rpm,4°C离心15min,收集沉淀；用包涵体洗漆缓冲液(50mmol/L Tris.HCl ρΗ8.0 ；2mmol/L尿素；0.5% Triton-X-lOO)洗涤3次，获得的沉淀即为纯化的包涵体。
[0034]实施例4活性检测
[0035]将实施例2和实施例3获得包涵体装入透析袋中进行复性，复性条件变化不应太过剧烈，以免形成絮状蛋白沉淀，通常每隔6h更换一次复性液(2mmol/L还原型谷胱甘肽；
0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽，)，复性48h，收集复性后的蛋白溶液经紫外吸收法测定浓度后，建立38KDa复性蛋白ELISA检测方法并评价其免疫反应性结果如下:
【权利要求】
1.一种适用于大规模生产的结核分枝杆菌rTPA38蛋白包涵体初纯的方法，包括以下步骤: 一、菌体前处理:(I)菌体悬浮:将发酵培养的表达rTPA38蛋白的初始工程菌菌体置37°C恒温水浴锅中解冻，解冻后，按1:20菌体重量(g) /缓冲液体积(mL)的比例用rTPA38菌体悬浮缓冲液稀释，然后在不锈钢菌体处理罐中搅拌至完全悬浮均匀，搅拌电机频率45Hz。包涵体菌体处理罐夹套内通入_5°C -0°C冷冻水将菌体悬浮液降至温度低于15°C以下；rTPA38 菌体悬浮缓冲液:IOOmM NaCl, ImM EDTA, 50mM Tris-HCl, ρΗ8.0 ； (2)菌体破碎:用硅胶管将不锈钢菌体处理罐出料口与高压均质机进料口连接，将菌体悬浮液以1.35L每分钟的流速通入高压均质机，用800bar的压力破碎处理，破碎压力约80MPa，处理后的菌液接入不锈钢桶中，再返回不锈钢菌体处理罐中搅拌冷，却至低于15°C后再次破碎，重复进行 ，连续三次； (3)离心:将高压均质破碎三次后的菌体破碎液离心4°C，8000rpm，12min，废弃上清液，收集沉淀即得粗包涵体。 二、包涵体洗涤 (1)第一次包涵体洗涤:a.搅拌悬浮:粗包涵体按1:20包涵体重量(g)/缓冲液体积(mL)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约30°C ±5°C。b.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min至20min，收集包涵体沉淀，废弃上清液；缓冲液配方为:2%Triton-X100, IOOmM NaCl, ImM EDTA, pH8.020mMTris-HCl, 0.5% 巯基乙醇； (2)第二次包涵体洗涤:a.搅拌悬浮:将第一次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约30°C ±5°C;b.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min至20min，收集包涵体沉淀，废弃上清液；缓冲液配方为:l%Triton-X100, IOOmM NaCl, ImM EDTA, pH8.020mM Tris_HCl，0.1%巯基乙醇。 (3)第三次包涵体洗涤:a.搅拌悬浮:将第二次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约30°C ±5°C。b.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min至20min，收集包涵体沉淀，废弃上清液；缓冲液配方为:lmM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl ; (4)第四次包涵体洗涤:a.搅拌悬浮:将第三次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量(g) /缓冲液体积(mL)的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15-20分钟至完全均匀，温度约300C ±5°C;缓冲液配方为:lmM EDTA, pH8.020mM Tris-HCl ；b.粗包涵体悬浮液离心:离心转速为8000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min至20min，c.收集:收集包涵体沉淀，废弃上清液，即得经初纯后的包涵体，并在_30°C保存。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于菌体的处理的量可以是一次性处理100g至5000g rTPA38 菌体。
【文档编号】C07K1/14GK103665116SQ201310693256
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】何秀云, 崔玉华, 李申建, 贺运泉 申请人:广东瀚森生物药业有限公司