一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法
【专利摘要】本发明提供了一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，包括以下工艺步骤:皂化预处理分离不皂化物，一级柱层析分离生育酚和甾醇，二级柱层析提纯角鲨烯。整个工艺可得含量为50%左右的角鲨烯，并兼得含量70%以上的生育酚和98%以上的甾醇。克服了传统角鲨烯提取工艺针对性不强的问题，发挥了柱层析的优良选择性，大大提高了提取效率。该工艺具有操作简单、分离效率高、角鲨烯回收率高、投资小等优点。
【专利说明】一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及角鲨烯提纯领域，具体涉及一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法。
【背景技术】
[0002]角鲨烯(Squalene),分子式为C3tlH5tl,分子量410.7,化学名称为2,6, 10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，属开链三萜。角鲨烯是一种无色或微黄色透明油状液体，易溶于正己烷、乙醚、石油醚、丙酮和四氯化碳，微溶乙醇，不溶于水。易于氧化，故而在保存时需加入适当的抗氧剂。
[0003]角鲨烯在抗氧化、抗辐射效果显著，并能强化免疫调节和增强新陈代谢。医学上常作为抗肿瘤、抗癌的有效药物，参与治疗心脑血管疾病和作为抗感染药物。角鲨烯是很好的活性氧输送载体，含角鲨烯化妆品可以防止皮肤粗糙、增强皮肤免疫力、令肌肤散发健康美丽的自然光泽。含角鲨烯的保健品能提高人的肌体免疫功能，增强抗病能力。
[0004]角鲨烯作为一种脂质不皂化物，主要来源于动物肝脏中，尤其深海鲨鱼肝油中的角鲨烯含量最高(40%-89%)。因此，目前角鲨烯提取工艺大多基于鲨鱼肝油为原料。出于对野生动物的保护，现提出寻找角鲨烯的植物来源。其实角鲨烯在植物中分布很广，只是普遍含量不高和无有效方法提取限制了其应用价值。
[0005]脱臭馏出物作为油脂脱臭过程中的工业副产物，是角鲨烯的良好来源。脱臭馏出物主要组成为:游离脂肪酸、甘油酯、生育酚、留醇、角鲨烯等，其中角鲨烯含量一般为
0.5%-2.5%。如果能将其中角鲨烯提取，并兼得一部分生育酚、留醇，不仅能充分利用工业废物，节约成本和保护环境，还能产生一定的经济效益，开发新产品。
[0006]目前提取角鲨烯的工艺方法并不多，尤其是植物油脱臭馏出物中的角鲨烯。例如专利CN102146014公开了一种以油茶籽为原料提取角鲨烯的方法，其工艺流程涉及甲酯化、配位-硼砂反应、大孔树脂色谱分离纯化、多次超临界二氧化碳萃取，可得角鲨烯含量≥80%的角鲨烯精油，原料中角鲨烯含量不详，提取率不详。专利CN102089263公开了一种以脱臭馏出物为原料提取角鲨烯的方法，该方法采用酯化、三级分子蒸馏，可到20-30%左右的角鲨烯馏分。CN101597204公开了一种从橄榄油中提取角鲨烯的方法，原料含量为3.6%，工艺涉及皂化，不皂化物的萃取、二级分子蒸馏和柱色谱，角鲨烯含量可以提高30倍，提取率不详。
[0007]从以上实例可见，目前植物角鲨烯的提取多采用多种方法的组合，例如皂化、酯化、分子蒸馏、超临界二氧化碳萃取等，步骤较为繁琐，并且分子蒸馏、超临界萃取装置价格昂贵，安全性低。因此，想要获得含量很高的角鲨烯产品，往往需要复杂的工序，付出很大代价，然而角鲨烯的提取率却普遍不高。
[0008]柱层析的优良选择性，且具有操作简便，环境友好，溶剂可回收利用，操作条件温和等特点，使其成为天然产物分离纯化的经典方法。脱臭馏出物成分的复杂性和不确定性，是角鲨烯提取物纯度不高的重要原因，而柱层析优良的选择性，为角鲨烯的分离纯化提供了可能。常见的柱层析类型有吸附柱层析、分配柱层析、离子交换层析等。吸附柱层析按照吸附能力的不同达到分离的目的。分配层析根据待分离物质在两相中分配系数的差值。离子交换层析是利用离子交换剂进行分离。脱臭馏出物经过预处理后，利用不同成分的极性和酸碱性等性质的差异，单级、二级或多级柱层析的选择性分配或吸附，使不同性质的成分分离，达到纯化角鲨烯的目的。
[0009]考虑到当前植物角鲨烯提取步骤繁琐、效率不高、针对性不强的问题，发挥柱层析在天然产物分离时的高选择性，采用柱层析法来分离植物角鲨烯。但作为原料的脱臭馏出物成分复杂，大部分成分为脂肪酸和甘油脂类，角鲨烯的含量普遍不到3%，直接的柱层析不仅分离效率低、分离效果差，而且过多的杂质会堵塞床层，使工艺无法进行。故设计在柱层析前用皂化法预处理原料，除去大部分的皂化物，收集不皂化物来进行吸附分离。另考虑到不皂化物中含有大量生育酚和留醇，将其分离不仅能提高角鲨烯的纯度，还能回收一部分具体商业价值的生育酚和留醇，因此在一级柱层析后采用二级柱层析，进一步提高角鲨烯的纯度。
[0010]
【发明内容】
[0011]针对现有技术的不足，本发明提供了一种皂化预处理和二级柱层析相结合提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的工艺。本发明工艺具有分离效率高、角鲨烯回收率高、操作简单、投资小等优点。
[0012]本发明的技术方案为:
一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征是包括如下步骤:
1)分离不皂化物:将植物油脱臭馏出物在有保护的情况下，边搅拌边加入无机碱皂化，反应温度为60-80°C，反应`时间为45-60min，形成皂化混合物，皂化结束后，分离皂化物，剩余物萃取浓缩得不皂化物；
2)一级柱层析:以步骤I)获得的不皂化物为原料，低级醇为流动相，少量流动相稀释不皂化物后，加入碱性阴离子交换树脂为填充料的层析柱中，流动相以一定的流速洗脱，收集流动相得角鲨烯制备液A ;
3)生育酚回收:一级层析柱继续用低级酸的低级醇溶液解析，得混合生育酚制备液，浓缩得混合生育酚；
4)甾醇回收:浓缩角鲨烯制备液A，少量低级醇溶解，低温析出白色晶体留醇，过滤并多次重结晶得高纯植物留醇，滤液为角鲨烯制备液B ；
5)二级柱层析:浓缩的角鲨烯制备液B为原料，硅胶为填充料，弱极性或非极性溶剂洗脱，收集无色部分，浓缩得植物角鲨烯。
[0013]步骤I)所述的保护措施为通氮气、加抗氧化剂中的一种或组合；所述的皂化所需的醇介质是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和1-丁醇中的一种,所述的无机碱为KOH或NaOH，用量为皂化值计算所需量的1.0-1.5倍。
[0014]其中，步骤I)所述的分离皂化物的方法为分相、转皂、沉淀、离心、冷析、过滤中的一种或多种组合；所述的萃取溶剂为正己烷、石油醚、乙醚中的一种。
[0015]其中，步骤2)所述的低级醇为甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和1-丁醇中的一种；所述的树脂为碱性离子交换树脂，型号为HY-2002、201X7、JK206、HZ202中的一种。
[0016]其中，步骤2)的所述的一级柱层析的具体步骤为:不皂化物用2-5倍低级醇稀释，在10-30°C下，以流速0.5-3.5BV/h通过装有树脂的层析柱，低级醇洗脱床层，直至流出液为无色透明为止，收集洗脱液角鲨烯制备液A ; 其中，步骤3)所述的低级醇为甲醇、乙醇，所用低级酸为甲酸、乙酸、丙酸中的一种；解析时根据颜色的变化收集洗脱液，浓缩即可得生育酚浸膏。
[0017]其中，步骤4)所述的用少量低级醇溶解浓缩物，其比例为: Vffige=1: 2-10。
[0018]其中，步骤4)所述的留醇回收的具体步骤为:将角鲨烯制备液A真空浓缩，脱溶后用低级醇完全溶解，放于_4°C -(TC的冰箱中冷析12-24h，真空抽滤得留醇粗晶体，粗晶体多次重结晶得高纯植物留醇，滤液为角鲨烯制备液B。
[0019]其中，步骤5)所述的填充料为100-200目、200-300目硅胶；流动相为石油醚、正己烷、乙醚、环己烷、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种混合。
[0020]其中，步骤5)所述的二级柱层析的具体步骤为:浓缩角鲨烯制备液B，浓缩物用2-5倍流动相稀释，在10-30°C下，以流速0.5-3.5BV/h通过装有硅胶的层析柱，流动相洗脱床层，收集无色部分，浓缩得植物角鲨烯。
[0021]本发明在提取脱臭馏出物中角鲨烯时，具有以下几个优势:
1.工艺的选择性好，可使角鲨烯的含量从0.5%~1.5%提高到50-70%左右，含量平均提高50倍，分离效率高。
[0022]2.克服了传统工艺普遍提取率不高的缺点，该工艺具有环境友好，操作条件温和等特点，在提取角鲨烯时加入了保护措施，既提高了角鲨烯的提取率(80-90%)，又防止了生育酚的损失。
[0023]3.工艺在得到植物角鲨烯的同时，并且能分别得到一些较高纯度的生育酚(含量70%左右)和留醇(含量98%左右)。
[0024]4.采用脱臭馏出物为原料，和鲨鱼肝油、橄榄油、油茶籽油等相比，成本较低，并且能更好的开发利用脱臭馏出物，实现油脂精炼副产物的综合利用。
[0025]5.工艺避免使用分子蒸馏、超临界萃取装置等大型设备，投资小，可实现短期回报。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1:发明工艺流程图；
图2:实施例一中不皂化物GC-MS图。其中出峰时间5.79、6.87、7.95、8.74、10.19、10.55、11.59依次为角鲨烯、δ-生育酚、Υ-生育酚、α -生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇；
图3:实施例一中角鲨烯制备液A GC-MS图。其中出峰时间5.82、10.22、10.57、11.62依次为角鲨烯、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇；
图4:实施例一中生育酚GC-MS图，其中出峰时间6.93、7.98、8.77依次为δ -生育酚、Y-生育酚、α-生育酚；
图5:实施例一中甾醇GC-MS图。其中出峰时间10.04、10.41、11.38依次为菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇；
图6:实施例一中植物角鲨烯浸膏GC-MS图。其中出峰时间6.0O为角鲨烯。
[0027]
【具体实施方式】
[0028]实施例一
该实例将采用皂化预处理和二级柱层析相结合的方法提取大豆油脱臭馏出物中的角鲨烯，具体实施步骤为:
1.分离不皂化物:取大豆油脱臭馏出物108g(角鲨烯含量1.96%)，加入少量TBHQ作为保护剂，在搅拌的情况下，加入1. 5mol/L NaOH-甲醇溶液320ml，80°C回流皂化lh，反应结束后，加入300ml蒸馏水，搅拌2分钟后取出冷却到室温。石油醚萃取三次，每次500mL，合并石油醚层，5%盐水洗石油醚层至中性。石油醚层去水后60°C条件下旋转蒸发除去溶剂，即得不皂化物，经GC-MS检测(附图2)，不皂化物中角鲨烯含量为12.48%。
[0029]2.一级柱层析:以步骤I中所得不皂化物为原料，甲醇为流动相，少量甲醇稀释该不皂化物后，加入JK206阴离子交换树脂为填充料的层析柱中，流动相以一定的流速洗脱，收集流动相，当颜色变成无色时停止收集，合并收集的流动相得角鲨烯制备液A。GC-MS检测见附图3。
[0030]3.生育酚回收:一级层析柱继续用6%(wt)的乙酸甲醇溶液解析，根据颜色变化分段收集，得混合生育酚制备液，60°C旋转蒸发溶剂，得混合生育酚，生育酚含量可达70%以上(附图4)。
[0031]4.留醇回收:取一级柱层析所得角鲨烯制备液A，蒸除溶剂后，甲醇溶解，其比例为Vmm: Vm=I: 5。放入-4°c冰箱12h，可见白色晶体析出，真空抽滤可得植物甾醇。按以上步骤多次重结晶，可得高纯植物留醇，纯度可达98%以上(附图5)。所得滤液为角鲨火布制备液B。
[0032]5.二级柱层析:取步骤4中角鲨烯制备液B，60°C真空浓缩，作为二级柱层析原料。将其置于硅胶柱(100-200目)顶端，用硅胶柱层析法分离，石油醚洗脱，收集无色部分，浓缩得植物角鲨烯，经检测，角鲨烯含量为72.85%，总提取率85.44%。
[0033]实施例二
该实例将采用皂化预处理和二级柱层析相结合的方法提取米糠油脱臭馏出物中的角鲨烯。具体实施步骤为:
1.分离不皂化物:取米糠油脱臭馏出物100g (角鲨烯含量0.86%)，将馏出物放入三口圆底烧瓶中，边搅拌边加入少量BHA作为保护剂，之后加入1.5mol/L KOH-乙醇溶液(加入量为理论量的1.5倍)，80°C回流皂化1.5h，反应结束后，加入300ml蒸馏水，搅拌2分钟后取出冷却到室温。正己烷萃取三次，每次500mL，合并正己烷层，5%盐水洗正己烷层至中性。正己烷层去水后60°C条件下旋转蒸发除去溶剂，既得不皂化物，经GC-MS检测，不皂化物中角鲨烯含量为5.63%。
[0034]2.一级柱层析:以步骤I中所得不皂化物为原料，乙醇为流动相，少量乙醇稀释该不皂化物后，加入717阴离子交换树脂为填充料的层析柱中，流动相以一定的流速洗脱，收集流动相，当颜色变成无色时停止收集，合并收集的流动相得角鲨烯制备液A。[0035]3.生育酚回收:一级柱层析柱继续用3%(wt)的乙酸乙醇解析，根据颜色变化分段收集，得混合生育酚制备液，60°C旋转蒸发溶剂，得混合生育酚，生育酚含量可达70%以上。
[0036]4.留醇回收:取一级柱层析所得角鲨烯制备液A，蒸除溶剂后，甲醇溶解，其比例为Vmm: Vm=I: 3。放入-4°c冰箱24h，可见白色晶体析出，真空抽滤可得植物甾醇。按以上步骤多次重结晶，可得高纯植物留醇，纯度可达98%以上。所得滤液为角鲨烯制备液B0
[0037]5.二级柱层析:取步骤4中角鲨烯制备液B，60°C真空浓缩，作为二级柱层析原料。将其置于硅胶柱(100-200目)顶端，用硅胶柱层析法分离，石油醚洗脱，收集无色部分，浓缩得植物角鲨烯，经检测，角鲨烯含量为52.78%，总提取率87.92%。
[0038]对比实施例
该实例用传统皂化加分子蒸馏的方法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯，具体实施步骤
为:
1.分离不皂化物:取大豆油脱臭馏出物108g(角鲨烯含量1.96%)，在搅拌的情况下，加入1.5mol/L NaOH-甲醇溶液300ml，80°C回流皂化lh，反应结束后，加入320ml蒸馏水，搅拌2分钟后取出冷却到室温。石油醚萃取三次，每次500mL，合并石油醚层，5%盐水洗石油醚层至中性。石油醚层去水后60°C条件下旋转蒸发除去溶剂，即得不皂化物，不皂化物中角鲨烯含量为12.48%。
[0039]2.二级分子蒸馏提取角鲨烯:以步骤I中所得不皂化物为原料，在蒸发温度为70°C、刮膜转速为250rpm、进料速度为2.8ml/min时进行第一次分子蒸馏。以第一次分子蒸馏的馏余物为原料， 在蒸发温度为200°C、刮膜转速为250rpm、进料速度4ml/min时进行第二次分子蒸馏，得到约16g的角鲨烯粗品，其中角鲨烯含量为32.68%，角鲨烯粗提物中含有
一定量的生育酚和甾醇。
[0040]通过实例一、二和实例三对比可见，一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法和传统方法相比，角鲨烯产品的纯度更高，分离效率高；实现了角鲨烯、甾醇、生育酚的分离，提高了利用价值；整个工艺工序少，设备投资小。
【权利要求】
1.一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征是包括如下步骤: 1)分离不皂化物:将植物油脱臭馏出物在有保护的情况下，边搅拌边加入无机碱皂化，反应温度为60-80°C，反应时间为45-60min，形成皂化混合物，皂化结束后，分离皂化物，剩余物萃取浓缩得不皂化物； 2)一级柱层析:以步骤I)获得的不皂化物为原料，低级醇为流动相，少量流动相稀释不皂化物后，加入碱性阴离子交换树脂为填充料的层析柱中，流动相以一定的流速洗脱，收集流动相得角鲨烯制备液A ; 3)生育酚回收:一级层析柱继续用低级酸的低级醇溶液解析，得混合生育酚制备液，浓缩得混合生育酚； 4)甾醇回收:浓缩角鲨烯制备液A，少量低级醇溶解，低温析出白色晶体甾醇，过滤并多次重结晶得高纯植物留醇，滤液为角鲨烯制备液B ； 5)二级柱层析:浓缩的角鲨烯制备液B为原料，硅胶为填充料，弱极性或非极性溶剂洗脱，收集无色部分，浓缩得植物角鲨烯。
2.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:步骤I)所述的保护措施为通氮气、加抗氧化剂中的一种或组合；所述的皂化所需的醇介质是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇，1-丁醇中的一种，所述的无机碱为KOH或NaOH，用量为皂化值计算所需量的1.0-1.5倍。
3.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤I)所述的 分离皂化物的方法为分相、转皂、沉淀、离心、冷析、过滤中的一种或多种组合；所述的萃取溶剂为正己烷、石油醚、乙醚中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤2)所述的低级醇为甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和1-丁醇中的一种；所述的树脂为碱性离子交换树脂，型号为HY-2002、201 X7、JK206、HZ202中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤2)的所述的一级柱层析的具体步骤为:不皂化物用2-5倍低级醇稀释，在10-30°C下，以流速0.5-3.5BV/h通过装有树脂的层析柱，低级醇洗脱床层，直至流出液为无色透明为止，收集洗脱液角鲨烯制备液A。
6.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤3)所述的低级醇为甲醇、乙醇，所用低级酸为甲酸、乙酸和丙酸中的一种；解析时根据颜色的变化收集洗脱液，浓缩即可得生育酚浸膏。
7.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤4)所述的用少量低级醇溶解浓缩物，其比例为: Vffige=1: 2-10。
8.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤4)所述的留醇回收的具体步骤为:将角鲨烯制备液A真空浓缩，脱溶后用低级醇完全溶解，放于-4 °C -(TC的冰箱中冷析12-24h，真空抽滤得留醇粗晶体，粗晶体多次重结晶得高纯植物留醇，滤液为角鲨烯制备液B。
9.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤5)所述的填充料为100-200目、200-300目硅胶；流动相为石油醚、正己烷、乙醚、环己烷、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种混合。
10.根据权利要求1所述的一种二级柱层析法提取植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，其特征在于:其中步骤5)所述的二级柱层析的具体步骤为:浓缩角鲨烯制备液B，浓缩物用2-5倍流动相稀释，在10-30°C下，以流速0.5-3.5BV/h通过装有硅胶的层析柱，流动相洗脱床层，收集无色部分，浓缩得植物`角鲨烯。
【文档编号】C07J9/00GK103708992SQ201310739702
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】袁传勋, 琚裕杰, 金日生 申请人:合肥工业大学