鲨肌醇的制造方法
【专利摘要】本发明的课题在于提供一种可采用一步法由葡萄糖等低成本且普遍存在的原料生产鲨肌醇的工业制造方法。进一步提供由该制造方法得到的新颖的鲨肌醇衍生物。鲨肌醇利用保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化微生物通过一个步骤由葡萄糖进行发酵生产。通过该发酵还提供与葡萄糖等糖类结合的鲨肌醇衍生物。
FERM BP-11515
2011.10.25
FERM BP-11513
2011.10.25
FERM BP-11514
2011.10.25
FERM BP-11512
2011.04.20
【专利说明】鲨肌醇的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因重组技术在鲨肌醇的制造中的应用。特别涉及可采用一步法由葡 萄糖等普遍存在的原料生产鲨肌醇的转化体以及利用该转化体的鲨肌醇的工业制造方法。 本发明还涉及利用上述转化体生产得到的鲨肌醇衍生物及其制造方法、以及来自该衍生物 的鲨肌醇的制造方法。
【背景技术】
[0002] S肌醇（scyllo-inositol ;顺-1，3, 5-反-2, 4, 6-环己六醇）为肌醇的光学惰性 异构体之一，是自古以来在动物和植物中发现的化合物。但是，到了近年，鲨肌醇所具有的 各种生理活性引起了人们的注意。
[0003] 例如，非专利文献1报告了鲨肌醇具有淀粉样β蛋白聚集抑制作用，该作用暗示 鲨肌醇在阿兹海默氏病治疗中的潜在的有用性。此外，专利文献1请求保护以鲨肌醇为有 效成分的血糖值降低剂。从而存在对鲨肌醇进行工业生产的明确的必要性。
[0004] 在传统的生产方法中，是从植物体提取鲨肌醇或以肌肉肌醇为原料进行该化合物 的化学合成（非专利文献2和3、专利文献2等）。但是，近年来研究了利用天然型微生物 或微生物来源的酶更有效地进行鲨肌醇的生产的方法。
[0005] 专利文献3中公开了下述方法：利用含有肌肉肌醇的培养基对属于农杆菌属的微 生物进行培养，在培养液中生成肌醇空间异构体；或者使属于农杆菌属的微生物的菌体或 菌体处理物作用于肌肉肌醇，生成肌醇空间异构体。通过这些异构体化，肌肉肌醇被转换为 S肌醇、手性肌醇（chiro-inositol :为D体和L体的混合物）和新肌醇（neo-inositol)的 混合物。
[0006] 在专利文献4中记载了使假单胞菌sp. AB10064株（FERMP-18330)或醋酸 杆菌sp. AB10253株（FERMP-18868)作用于肌肉肌醇，将肌肉肌醇转换为鲨肌醇单酮 (scyllo-inosose)的内容。进一步尝试了通过将由此生成的鲨肌醇单酮利用硼氢化钠进行 还原来合成鲨肌醇，但利用该还原处理实质上仅生成了与肌肉肌醇（即，向原料的逆向反 应）的混合物的形式的鲨肌醇。因而，在专利文献4所记载的鲨肌醇的制造方法中，需要反 复进行利用肌肉肌醇的微生物向鲨肌醇单酮的转换与利用硼氢化钠的还原处理来逐渐增 加鲨肌醇的含量。
[0007] 专利文献5中公开了一种鲨肌醇的制造方法，在该制造方法中，使用肌肉肌醇作 为原料，在将由肌肉肌醇生成鲨肌醇单酮的肌肉肌醇2-脱氢酶（EC1. 1. 1. 18)、将鲨肌醇单 酮立体选择性地还原为鲨肌醇的鲨肌醇脱氢酶、以及NAD+或NADP+混合得到的溶液中进行 将肌肉肌醇转换为鲨肌醇的酶转换反应。该文献中，由肌肉肌醇向鲨肌醇的转换以产率基 准计为31%。
[0008] 从而，上述任一文献均涉及的是以肌肉肌醇为起始原料来生产鲨肌醇的方法，对 于鲨肌醇的从头生物合成、也即由葡萄糖等普遍存在的原料直接地且利用一步法来生产鲨 肌醇的方法却并未教导。
[0009] 特别是，肌肉肌醇本身本来就是极为有用且贵重的生理活性物质。即，肌肉肌醇对 多数高等动物来说为必不可缺的物质，因而其作为营养食品、饲料、药品等成分广泛使用。 例如，已知肌肉肌醇在脂肪、胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用，在高胆固醇血症等的预 防、治疗中是特别有效的。
[0010] 因而，实际上，目前就对肌肉肌醇工业规模的制造工艺提出了很多改良。例如，专 利文献6中公开了可向菌体外分泌肌肉肌醇的假丝酵母属酵母的表达及其利用。专利文献 7和8分别公开了在上述肌肉肌醇分泌性假丝酵母属酵母中导入可赋予针对葡萄糖代谢拮 抗物质和抗生素的耐性的突变的内容。另外，在专利文献9、10和11中还分别公开了通过在 具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对叔胺、六氯环己烷和十六烷基 三甲基铵盐的耐性的突变来提高肌肉肌醇的收率的内容。专利文献12中同样公开了在具 有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对6-卤代-6-脱氧葡萄糖的耐性 的突变的内容。在专利文献13中还公开了在具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中 导入可赋予针对卤化乙酰甲酸的耐性的突变的内容。并且，除此之外,例如专利文献14中 公开了下述内容：在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中，肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反 应，在这一恰当推论下，通过单独利用编码上述肌醇-1-磷酸合成酶的DNA对不具有肌肉肌 醇分泌能力的假丝酵母属酵母进行转化，对该酵母赋予了肌肉肌醇生产能力；专利文献15 中公开了通过将置于甘油-3-磷酸脱氢酶基因的启动子的调节下的编码肌醇-1-磷酸合成 酶的DNA单独导入到酵母中来提高该酵母的肌肉肌醇生产率的内容。
[0011] 上述事实均表明，确立肌肉肌醇的有效且经济的生产方法本身在目前依然是重要 的技术课题。因而，现有技术中不得不以贵重且昂贵的肌肉肌醇为原料的鲨肌醇制造方法 的低效率性、不经济性一目了然。
[0012] 进一步地，在上述任一文献中均未公开或暗示鲨肌醇衍生物、特别是由糖类进行 了衍生化的鲨肌醇。
[0013] 现有技术文献
[0014] 专利文献
[0015] 专利文献1 :日本特开2003-160478号公报
[0016] 专利文献2 :西德专利公开公报第3, 405, 663号公报
[0017] 专利文献3 :日本特开平9-140388号公报
[0018] 专利文献4 :日本特开2003-102492号公报
[0019] 专利文献5 :日本特开2010-187688号公报
[0020] 专利文献6 :日本特开平8-00258号公报
[0021] 专利文献7 :日本特开平8-38188号公报
[0022] 专利文献8 :日本特开平8-89262号公报
[0023] 专利文献9 :日本特开平9-117295号公报
[0024] 专利文献10 :日本特开平10-42860号公报
[0025] 专利文献11 :日本特开平10-42882号公报
[0026] 专利文献12 :日本特开平10-42883号公报
[0027] 专利文献13 :日本特开2000-41689公报
[0028] 专利文献14 :日本特开平9-220093号公报
[0029] 专利文献15 :日本特开平10-271995号公报
[0030] 非专利文献
[0031] 非专利文献 1 :The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 24, ρρ· 1849 5 ?18502(2000)
[0032] 非专利文献2 :药学杂志，89卷，1302?1305页（1969)
[0033] 非专利文献 3 :Liebigs Ann. Chem.，866 ?868 页（1985)
【发明内容】
[0034] 发明所要解决的课题
[0035] 因而，本发明的第一课题涉及一种可由葡萄糖等低成本且普遍存在的原料通过一 步法生产鲨肌醇的工业制造方法。本发明人进一步在上述研究过程中首次发现了与糖类结 合的本发明的鲨肌醇衍生物。该鲨肌醇衍生物与鲨肌醇本来所显示出的水溶性相比，也显 示出了格外优异的水溶性。由于例如纤维素二糖（D-吡喃葡萄糖_( β 1 - 4)-D-葡萄糖） 显示出了比葡萄糖低的溶解性，因而本发明的技术思想令人吃惊。从而，本发明的第二课题 在于提供一种新颖的鲨肌醇衍生物。
[0036] 解决课题的手段
[0037] 如上所述，最近的研究中均主要涉及的是以肌肉肌醇为起始原料通过酶反应转换 为鲨肌醇的方法。在上述任一现有文献中，均未成功构建宿主微生物细胞内的功能性鲨肌 醇的从头的生物合成体系，也即未成功确立由葡萄糖等普遍存在的原料直接且以一步法进 行鲨肌醇的发酵生产的方法。
[0038] 但是，本发明人发现，表达肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌 醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化体能够由葡萄糖直接地且以一个步骤进行鲨肌 醇的发酵生产。本发明人进一步在这样的转化体的培养物中发现了新颖的鲨肌醇衍生物。
[0039] 因而，本发明的第一方面在于：
[0040] (1) 一种鲨肌醇和鲨肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序：
[0041] 1)准备转化微生物的工序，该转化微生物保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单 磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因；和
[0042] 2)在适于上述微生物的生长和/或维持的条件下，使该微生物与葡萄糖或具有葡 萄糖单元的二糖类或者多糖类进行接触的工序。
[0043] 更特定地说，上述制造方法为使用转化体的鲨肌醇及其衍生物的制造方法，其特 征在于，该转化体表达肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因 和鲨肌醇脱氢酶基因。
[0044] 上述（1)的培养物中生产的鲨肌醇衍生物为新颖的化合物，在该衍生物中，葡萄 糖与鲨肌醇呈β 1 - 4键合。因而，本发明的一个方式为：
[0045] (2)如上述（1)所述的制造方法，其中，上述鲨肌醇衍生物为下述结构式所表示的 化合物：
[0046] [化 1]
[0047]
【权利要求】
1. 一种鲨肌醇和鲨肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序： 1) 准备转化微生物的工序，该转化微生物保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸 酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因；和 2) 在适于所述微生物的生长和/或维持的条件下，使该微生物与葡萄糖或具有葡萄糖 单元的二糖类或者多糖类进行接触的工序。
2. 如权利要求1所述的制造方法，其中，所述鲨肌醇衍生物为下述结构式所表示的化 合物： [化1]
〇
3. 如权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，所述转化微生物具有对功能性肌醇 单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。
4. 如权利要求1?3的任一项所述的制造方法，其特征在于，所述转化微生物来源于不 具有肌肉肌醇同化能力的微生物。
5. 如权利要求1?4的任一项所述的制造方法，其中，所述转化微生物来源于选自由大 肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。
6. 如权利要求3?5的任一项所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是 通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的： a) 导入外来肌醇单磷酸酶基因； b) 增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数； c) 在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异、 d) 利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或 者 e) 使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。
7. 如权利要求6所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述 转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。
8. 如权利要求3?5的任一项所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的活化是通过 对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的： f) 在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异； g) 置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部； h) 使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失； i) 使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少； j) 使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。
9. 一种转化微生物，其保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱 氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因。
10. 如权利要求9所述的转化微生物，其特征在于，所述转化微生物进一步具有对功能 性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。
11. 如权利要求9或10所述的转化微生物，其特征在于，所述转化微生物来源于不具有 肌肉肌醇同化能力的微生物。
12. 如权利要求9?11的任一项所述的转化微生物，其中，所述转化微生物来源于选自 由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。
13. 如权利要求10?12的任一项所述的转化微生物，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩 生产是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的： a) 导入外来肌醇单磷酸酶基因； b) 增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数； c) 在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异； d) 利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或 者 e) 使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。
14. 如权利要求13所述的转化微生物，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对 所述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。
15. 如权利要求10?12的任一项所述的转化微生物，其中，所述肌醇单磷酸酶的活化 是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的： f) 在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异； g) 置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部； h) 使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失； i) 使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少； j) 使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。
16. 下述结构式所表示的化合物：
17. -种鲨肌醇的制造方法，其特征在于，利用能够催化β-糖苷键的水解反应的酶将 权利要求16所述的化合物分解，生成鲨肌醇。
18. -种组合物，其包含鲨肌醇与权利要求16所述的化合物。
【文档编号】C07C35/16GK104245950SQ201380006347
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年1月22日 优先权日:2012年2月2日
【发明者】小西一诚, 今津晋一 申请人:旭化成化学株式会社