Cdim结合蛋白及其用途

Cdim结合蛋白及其用途
【专利摘要】本发明涉及细胞死亡诱导分子(“CDIM”)结合蛋白及其药物组合物。特别是，本发明提供可用于选择性耗尽和杀灭B细胞的CDIM结合蛋白，所述B细胞包括肿瘤性B细胞以及非B细胞来源的表达CDIM样抗原的肿瘤样细胞。此外，本发明包含编码所公开的抗原结合蛋白的多核苷酸，以及用于产生其的表达系统。本发明另包含通过施用所述CDIM结合蛋白以治疗具有B细胞增生性及B细胞介导的疾病的患者的方法，以及用于鉴别与CDIM结合的蛋白质的诊断试验。本发明另包含用于鉴别可以CDIM结合蛋白治疗的患者群的诊断试验。
【专利说明】CDIM结合蛋白及其用途
[0001] 序列表
[0002] 本申请包含序列表，该序列表已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并据此以参照方 式将其整体并入。所述ASCII副本于2013年2月7日制作，其名称为0155-005W01_SL. txt， 大小为225,619字节。 I.【技术领域】
[0003] 本发明涉及细胞死亡诱导分子（以下称为CDM)结合蛋白及其药物组合物。特别 是，本发明提供可用于选择性耗尽及杀灭B细胞的CDIM结合蛋白，所述B细胞包括肿瘤性B 细胞以及表达CDIM或CDIM样抗原的其他肿瘤细胞。本发明还提供编码本发明的CDIM结 合蛋白的多核苷酸，以及用于产生其的表达系统。本发明还包含通过施用该CDIM结合蛋白 治疗患有B细胞增生性疾病及B细胞介导的疾病的患者的方法。本发明还涉及用于鉴别可 以用CDIM结合蛋白治疗的患者群的诊断试验。 N.【背景技术】
[0004] 免疫系统的功能主要是由称为淋巴细胞的白血球负责进行。淋巴细胞可被分成 两大类，即T细胞和B细胞。T细胞（即T淋巴细胞）源自骨髓中的干细胞，其在胸腺中发 育，并负责分泌淋巴因子。B细胞（即B淋巴细胞）源自骨髓中的干细胞，其为抗体的来源。 事实上,Β细胞产生五种不同类型的抗体，包括IgM、IgG、IgA、IgD及IgE。这些抗体可中和 可诱发免疫反应的物质，也就是抗原，抗体通过与抗原上的特定位点连接以阻断抗原。IgM 是最大的抗体，并且为针对红血球上的A抗原及B抗原的主要抗体。在结构上，IgM形成聚 合物，其中多个免疫球蛋白经二硫键共价连接，主要形成五聚体，但也可能形成六聚体。IgM 的五聚体形式的分子量大约为900kDa。由于每个单体具有二个抗原结合位点，因此五聚体 IgM具有十个结合位点。
[0005] 许多疾病与B细胞改变或功能异常有关，包括但不限于自身免疫疾病及癌症。B细 胞的增殖及分化是由位于细胞表面的受体调节。这些受体的结合诱导细胞内信号传导蛋白 的活化，因而传递受体信号至细胞内控制细胞反应的特定靶标。许多信号传导蛋白是肿瘤 基因的产物，而许多肿瘤基因与肿瘤发生有关。控制B细胞增殖及分化的信号传导途径的 分子机制仍在研究中（Jumaa et al. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23:415-445)。
[0006] -种涉及肿瘤性B淋巴细胞的疾病的实例是急性淋巴母细胞性白血病（ALL)。在 对抗此疾病上的一些进展可归因于化学疗法的强化，以及对于幼年型及成人型ALL更好的 支持疗法。虽然幼年型ALL的复发风险较低，但若是复发，不论幼年或成人病患皆面临严 重后果。尽管采取积极疗法及干细胞移植，但是只有不到三分之一的ALL复发病童及少数 ALL复发成人可以存活。因此需要能超越常规化疗的新的疗法。一些关于ALL的单克隆抗 体包括利妥昔单抗（Rituximab)、依帕珠单抗（epratuzumab)及吉妥珠单抗（gemtuzumab) 的临床前及早期临床数据指出，单独使用单克隆抗体或与标准化疗组合使用是可行的治疗 选择。
[0007] 美国专利第5, 593, 676号描述通过使用与特定B细胞表位（称为细胞死亡诱导分 子（CDIM))结合的试剂来诱导肿瘤性B细胞的细胞死亡的方法。其中，B细胞特定寡糖表 位CDM被用来作为肿瘤性B细胞标记。对此标记特异的IgM抗体被施用至宿主体内以诱 导肿瘤性B细胞的死亡。相同概念可被应用于体外临床情况以选择性移除B细胞。识别B 细胞表位CDIM的人单克隆抗体（即MAb 216)对于肿瘤性B细胞及正常B细胞具有细胞毒 性，并且与人外周血液及脾脏中所有的⑶19+及⑶20+B淋巴细胞结合。另外，MAb 216无 法区别B细胞表达的同种型，其以相同强度与IgG+及IgM+细胞结合。MAb 216亦与所有 B细胞结合，不论它们的⑶5表达如何。因此，MAb 216可用于诊断及治疗。亦见Bhat et al. (2000), Scand. J. Immunol. .51:134-140。
[0008] 然而，本领域当中仍然需要鉴别对B细胞具有特异性的抗体，以选择性杀灭和/或 移除宿主体内的B细胞，并且减少靶标外的结合和/或组织损伤的不良反应。癌症治疗仍 然亟需这类治疗性抗体。本申请可解决该需求。 111.附图简介
[0009] 本发明当与附图一起解读时能得到最好地理解，所述附图作为说明实施方案之 用。然而应当了解，本发明并不限于附图中所公开的特定实施方案。
[0010] 图1A-D描述代表性的本文公开的⑶Μ结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1至22)。显示了三个重链互补决定区（⑶RH1、⑶RH2及⑶RH3)和重链可变区的框 架区（FR1、FR2及FR3)以及JH(链接区）。
[0011] 图1E描述代表性的本文公开的CDIM结合蛋白的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID N0:23及24)。显示了三个轻链互补决定区（⑶RL1、⑶RL2及⑶RL3)和轻链可变区的框 架区（FR1、FR2及FR3)以及叉（链接区）。
[0012] 图1F描述在本文公开的代表性实施例中使用的重链恒定区（Igy) (SEQ ID NO: 25)和两个轻链恒定区（分别为IgA和IgK) (SEQ ID NO: 26和27)的氨基酸序列。
[0013] 图2A-2V描述本文公开的44种抗⑶頂抗体（命名为IGM1至IGM44)的完整氨基 酸序列。该44种公开的抗体是通过将22种所公开的重链（SEQ ID N0:28至49)的每一个 与2种所公开的轻链（SEQ ID N0:50和51)的每一个组合形成。
[0014] 图3描述本文公开的代表性H1至H22⑶頂结合蛋白的⑶R3序列。各序列中的 精氨酸残基被加以下划线。
[0015] 图4A-K描述编码本文公开的抗原结合蛋白的22种重链的示例性多核苷酸序列 (SEQ ID N0:52 至 73)。
[0016] 图4L描述编码本文公开的抗原结合蛋白的2种轻链（λ及〇的示例性多核苷 酸序列（SEQ ID Ν0:74 及 75)。
[0017] 图5描述分别得自表达H1至H7 (A图）及H9至H21 (B图）的CH0细胞的粗制细 胞提取物的天然SDS凝胶。在1，048 kD处的条带代表IgM五聚体，在1，236 kD处的条带 代表IgM六聚体。
[0018] 图6说明⑶Μ结合蛋白与人B细胞系上所表达的⑶Μ的结合，以及所公开的抗 体造成的后续细胞毒性结果。收集细胞培养物，利用流式细胞技术分析，使用（1)平均荧光 强度以定量结合，以及（2)碘化丙啶的摄取以区别活细胞与死细胞。如图6Α所示，在广泛 剂量范围内，所有被测试的抗体皆与表达CDM的人B细胞系NALM-6结合。图6B显示所述 抗体与CDIM表位结合后的细胞毒性结果。
[0019] 图7显示所述抗体与⑶頂表位结合后的细胞毒性结果。
[0020] 图8的A-E图描述基于ELISA的结合数据，其代表⑶頂结合蛋白与非⑶頂抗原 的结合。使用单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、脂质A、心脂（cardiolipin)及丙二醛 LDL(MDA-LDL)抗原的结果分别显示于A至E图。如图所示，在广泛剂量范围内，MAb 216与 所有抗原结合，相较之下，所有公开的抗体显示与这些选定抗原的结合显著减少或完全缺 乏。
[0021] 图9的A-F图描述基于ELISA的结合数据，其代表⑶頂结合蛋白与非⑶頂抗原 的结合。使用单链DNA (ssDNA)、双链DNA (dsDNA)、脂多醣、心脂、软骨素及乙酰肝素抗原的 结果分别显示于A至F图。如图所示，在广泛剂量范围内，MAb 216与所有抗原结合，相较 之下，所有公开的抗体显示与这些选定抗原的结合显著减少或完全缺乏。
[0022] IV.实施方案详述
[0023] 本文使用的段落标题仅供组织的目的，不可被视为限制本发明的主题。
[0024] 除非本文另外加以定义，关于本申请所使用的科学术语和技术用语应具有本领域 普通技术人员通常理解的意义。另外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数意义且复 数术语应包括单数意义。
[0025] -般来说，与本文所描述的细胞培养、组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、 基因学以及蛋白质及核酸化学和杂交有关所使用的命名法及技术是本领域所熟知和经常 使用的。本申请的方法和技术通常根据该领域所熟知的常规方法进行，除非另外说明否则 如同本说明书各处引述的讨论的各种一般性及更具体的参考文献所述。见例如Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)，Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),和 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)，此类文献通过引用并入本文。酶反应及纯化技术是根据制造商说明书，以本领域 经常完成或本文所描述的方式进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学、医学及制药化 学有关所使用的术语和实验室方法及技术是本领域所熟知且经常使用的。标准技术可被用 于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送及患者的治疗。
[0026] 应了解的是，本发明并不限于本文所描述的特定方法、步骤及试剂等，因此可能有 所差异。本文所使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范 围，本发明的范围仅由权利要求书所限定。
[0027] 除了在操作实施例中或另外说明的地方以外，应了解所有表示本文所使用的成分 的量或反应条件的数字在所有情况下由术语"约"所修饰。当与百分比一起使用时，术语 "约"可能表示+/-1%。
[0028] -般概况
[0029] 本发明提供与治疗或诊断涉及表达CDIM抗原的细胞的增生性疾病有关的材料和 方法。特别是，本发明提供体外及体内性能增强的CDIM结合蛋白，其可用于选择性杀灭和 /或耗尽肿瘤性B细胞，特别是用于罹患特征为B细胞增生的疾病及B细胞介导的疾病的 病况的患者。此外，CDIM结合蛋白可用于治疗表达CDIM抗原的实体肿瘤。本发明公开的 CDIM结合蛋白可单独使用或与小分子化学治疗剂组合使用。由于本发明的CDIM结合蛋白 具有独特的孔诱导效应，也就是造成细胞膜损伤，因此使得化疗分子更容易进入靶细胞。因 此，本发明的结合蛋白特别适用于治疗原本对于与其组合的小分子化合物具抗性的细胞。
[0030] 定义
[0031] 本文使用的下列术语应具有下文指定的意义。
[0032] 术语"抗原"是指能诱导特定免疫反应且能与特定抗体反应的任何物质。
[0033] 本文使用的"抗原结合蛋白"或"CDIM结合蛋白"是一种具有抗体样结合活性的支 架蛋白或为一种抗体，即抗⑶頂抗体。
[0034] 本文使用的术语"CDIM"（ "细胞死亡诱导分子"）是指附着于细胞表面分子的聚 η-乙酰基乳糖胺糖化形式。CDIM表位可见于几乎所有外周B淋巴细胞及脾脏B淋巴细胞 以及某些经培养的B细胞淋巴瘤细胞系上。该表位亦可见于不同组织病理学分类的原发B 细胞淋巴瘤，以及某些实体肿瘤的细胞上。
[0035] 在更特定的术语中，⑶IM表位是一线性B细胞乳糖胺抗原（即，聚-N-乙酰基乳 糖胺第2型决定簇，有或无末端唾液酸），其具有立体结构构型并对内-β -半乳糖苷酶敏 感。该表位不具分支或取代基，并且它可附着于糖脂或糖蛋白。在糖蛋白上，该表位可自甘 露糖框架（例如，酶MGAT4)伸出，或可为自一"大I"结构伸出的长链，但在分支Gal β 1-4 GlcNac β 1-3 Gal β 1-4 Glc β 1之后的直链中通常至少有约4个己糖部分（第2型）； 至少约6个己糖以具有良好亲和性；及最长形式中至少约12个己糖。该链是由酶（例如 B3GNTUB4GALT1)制成，该酶添加交互糖至该表位。应注意的是，该糖基化表位⑶頂存在 于多种蛋白质上，从分子量约20KD至大于约200KD的蛋白质都有。
[0036] 该CDIM表位已被进一步阐释，该抗原的糖化形式是由唾液酸加帽的，使其成为更 成熟的糖基化形式。
[0037] 术语"表位"通常指抗原（即，分子的抗原决定簇）的一部分，其由免疫系统识别。 表位可由糖、脂质和/或氨基酸或其混合物组成。所述表位由免疫细胞如特定T细胞、B细 胞和/或B细胞产生的抗体识别。当免疫细胞识别特定表位并由该特定表位活化时，它们 启动免疫反应。或者，当抗体识别并结合特定表位时，携带该表位的细胞可能会被耗尽、杀 灭、失活、受伤、移除和/或改变。
[0038] 本文所使用的术语"支架蛋白"或"抗原结合蛋白"是指具有暴露的表面区域的多 肽或蛋白，而该暴露的表面区域对氨基酸插入、取代或删除具有高度耐受性。可用于本发明 的支架蛋白的实例包括来自金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白质A、来自大 菜粉蝶（Pieris brassicae)的胆汁三烯结合蛋白或其他脂质运载蛋白（lipocalin)、锚蛋 白（ankyrin)重复蛋白及人纤维粘连蛋白（fibronectin)(于 Binz and Pliickthun(2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16:459-69中综述）。支架蛋白的工程化可被视为移植或嵌入亲和 性功能至稳定折叠的蛋白的结构框架之上或之中。亲和性功能是指如本发明所述的蛋白结 合亲和性。支架在结构上可与授予结合特异性的氨基酸序列分开。一般来说，似乎适用于发 展这类人工亲和性试剂的蛋白质可能通过合理或最常见的组合蛋白质工程技术获得，诸如 体外表达的人工支架库中筛选针对CDIM的结合剂（不论是经纯化的蛋白或在细胞表面表 达的蛋白），该技术为本领域已知的（Skerra，A. (2000)J.Mol.Recog. 13:167-187 ;Binz and Plilckthun，同上）。此外，具有抗体样结合活性的支架蛋白可源自包含该支架结构域的受 体（acceptor)多肽，该受体多肽可接受供体（donor)多肽的结合结构域的移植以将供体多 肽的结合特异性赋予包含受体多肽的支架结构域。所述插入的结合结构域可以为例如抗体 (特别是抗⑶頂抗体）的互补决定区（⑶R)。插入可通过本领域技术人员已知的各种方法 完成，所述方法包括例如多肽合成、核酸合成编码氨基酸以及本领域技术人员所熟知的各 种形式的重组方法。重要的是，术语"重链"或"轻链"应被广义地理解为嵌入一个或数个 已公开的CDR的支架蛋白，而非限制于该术语在抗体技术范畴内的传统意义。
[0039] 另外，本文使用的术语"抗体"或"CDIM结合抗体"意为单克隆抗体、多克隆抗体、 重组抗体、人源化抗体（Jones 等·（1986)Nature 321:522-525 ;Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329 ;及 Presta(1992)Curr. Op. Struct.Biol. 2:593-596)、嵌合抗体 (Morrison 等·（1984)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6851-6855)、由至少二个抗体形成 的多特异性抗体（例如，双特异性抗体）或它们的抗体片段。术语"抗体片段"包含前述抗体 的任何部分，优选它们的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab'片段、 (Fab'） 2 片段、Fv 片段、双价抗体（diabodies) (Hollinger 等·（1993)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S. A. 90:6444-6448)、单链抗体分子（Pliickthun in:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag，N.Y. (1994) ,269-315)及 其他片段，只要它们表现出与CDIM结合的期望的能力。
[0040] 此外,本文使用的术语"抗体"或"⑶頂结合抗体"可包括含有抗体的工程化亚结 构域的抗体样分子或天然存在的抗体变异体。这些抗体样分子可以为单结构域抗体，诸如 源自天然来源如胳能（Muyldermans et al. (2001) Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302)或通过来自人、骆驼或其他物种的体外表达文库（Holt et al. 2003 Trends Biotechnol. 21:484-90)的仅 VH 或仅 Vl 的结构域。
[0041] 根据本发明，"Fv片段"是包含完整抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片 段。此区域由一个重链可变结构域及一个轻链可变结构域以紧密、非共价连接所形成的 二聚体组成。在这种配置下，各可变结构域的三个⑶R(重链⑶RH1、⑶RH2及⑶RH3 ;轻链 ⑶RL1XDRL2及⑶RL3)相互作用以定义在VH-'二聚体的表面上的抗原结合位点。整体来 说，这六个CDR赋予抗原结合特异性给抗体。然而，即使单一可变结构域（或仅包含3个具 抗原特异性的CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力。"Fab片段"还包含轻链的恒 定结构域和重链的第一恒定结构域（CHI)。"Fab片段"与"Fab'片段"的不同处在于Fab' 片段的重链CH1结构域的羧基端增加数个残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱胺 酸。"F(ab'） 2片段"本来被产生为一对"Fab'片段"，它们之间具有绞链半胱胺酸。制备这 类抗体片段的方法（诸如木瓜酶或胃蛋白酶消化）是本领域技术人员已知的。
[0042] 在本发明的一些实施方案中，抗ΟΠΜ抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型抗体，优 选为186或181型抗体，包括但不限于1861、1862、1863、1864、1811和18112型抗体。在大 部分实施方案中，该抗体为IgM型抗体。该轻链可以为λ-1、λ-2或κ。可以包括或不包 括J链。
[0043] IgG具有数种亚型，包括但不限于IgGl、lgG2、lgG3及lgG4。IgA亚型包括IgAl及 lgA2。在人类中，IgA同种型包含四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型包含二条重链和 二条轻链；而IgM同种型包含10条或12条重链和10条或12条轻链（五聚体或六聚体）。 在天然存在的IgM分子中，该J链稳定该五聚体构型。
[0044] 重链C区通常包含一个或多个可能负责效应功能的结构域。重链恒定区结构域的 数量将依同种型而定。在一个实施方案中，该CDIM结合蛋白为IgM亚型。在全长轻链和重 链中，可变区和恒定区可由约12个或更多个氨基酸的"J"区连接，且重链还包括约10个或 更多个氨基酸的"D"区。（见例如 Fundamental Immunology, 2nd ed.，Ch. 7 (Paul, W.，ed.) (1989)New York:Raven Press)〇
[0045] OHM结合蛋白
[0046] 本发明的第一方面涉及一种分离的结合蛋白，该结合蛋白与人外周B淋巴细胞、 脾脏B淋巴细胞、肿瘤性B淋巴细胞和一些实体肿瘤上的⑶頂表位结合。
[0047] 在一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含重链和/或轻链，该重链包含⑶RH1、 CDRH2和CDRH3中的至少一个，该CDRH1、CDRH2及CDRH3具有如SEQ ID NO: 1至22中任一 个所示的序列，该轻链包含如SEQ ID N0:23或24所示的⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3中的至少 一个。在一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含至少一个如SEQ ID N0:1至22所示的⑶RH3。在另一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含如SEQ ID N0:1至22 所示的⑶RH1XDRH2及⑶RH3各一个，以及轻链。在其他实施方案中，该抗原结合蛋白另外 包含 SEQ ID N0:23 或 24 的 CDRL1、CDRL2 和 CDRL3,该 CDRL1、CDRL2 和 CDRL3 嵌入轻链之 中。在一些实施方案中，该抗原结合蛋白另外具有如SEQ ID N0:1至22中所示的FR1，该 FR1嵌入重链之中。
[0048] 在另一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含如SEQ ID NO: 1至22中任一个所示的 重链可变区。此外，本发明包括其中该抗原结合蛋白包含具有如SEQ ID N0:23或24所示 序列的轻链可变区的实施方案。另外，本发明考虑包含如SEQ ID NO: 1至22中任一个所示 的重链可变区和如SEQ ID N0:23或24所示的轻链可变区的抗原结合蛋白。图1A至D说 明本文公开的CDIM结合蛋白的22种示例性的独特的重链可变区。图1E说明两种轻链可 变区（SEQ ID N0:23和24)。图1F显示重链恒定区（Ig μ ) (SEQ ID N0:25)，以及轻链恒定 区（Igλ和Igκ)(SEQIDN0:26及27)。SEQIDN0:108代表MAb216(Bhatetal，2000， 同上），一种CDIM结合抗体，其被用来作为评估效价和特异性的试验参照抗体。见以下的实 施例。
[0049] 各重链可变区可与重链恒定区连接以形成全长重链，以及各轻链可变区可与轻链 恒定区连接以形成全长轻链。本文公开的示例性全长重链的氨基酸序列具有如SEQ ID N0: 28至49所示的序列。本文公开的示例性轻链的氨基酸序列具有如SEQ ID NO :50和51所 示的氨基酸序列。如上所述，两个重链和两个轻链序列可形成一个全长抗体四聚体。本文特 别公开的示例性⑶頂结合抗体四聚体，命名为IGM1、IGM2、IGM3、IGM4、IGM5、IGM6、IGM7、 IGM8、IGM9、IGM10、IGM11、IGM12、IGM13、IGM14、IGM15、IGM16、IGM17、IGM18、IGM19、IGM20、 IGM21、 IGM22、 IGM23、 IGM24、 IGM25、 IGM26、 IGM27、 IGM28、 IGM29、 IGM30、 IGM31、 IGM32、 IGM33、IGM34、IGM35、IGM36、IGM37、IGM38、IGM39、IGM40、IGM41、IGM42、IGM43 和 IGM44 (本 文也统称为"IGM1-IGM44"）。如图2A至2V所示，这44个公开的ΟΠΜ结合蛋白包含SEQ ID N0:28至49的重链，该重链的每一个与SEQ ID N0:50至51的轻链的任一个组合。下表 3显示各种多肽及多核苷酸SEQ ID N0与IGM1至IGM44抗原结合蛋白之间的关系。
[0050] 在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白与⑶頂结合，并其包含重链⑶R3序 列 XAX^GXsSXA，其中：
[0051] XiSG'A*!?;
[0052] X2 为 R、G 或 A ;
[0053] X3 为 Μ、T 或 R ;
[0054] X4 为 R、W 或 Y ;
[0055] X5 为 A、S 或 G ;
[0056] X6 为 I、V 或 Y;且
[0057] X7为N或无氨基酸；
[0058] 且其中在位置1至3 (相对于重链可变区的位置98至100,位置97是位于该⑶R3 区之前的不可变的精氨酸）存有一个且不超过一个精氨酸。
[0059] 在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白与⑶頂结合，并且包含重链⑶R3 序列XAX^GXsSXA，其中：
[0060] 父丨为G、A或R ;
[0061] X2SR、G或 A;
[0062] X3 为 Μ、T 或 R ;
[0063] X4 为 R 或 W ;
[0064] X5 为 A 或 S ;
[0065] 乂6为1或￥;且
[0066] X7为N或无氨基酸；
[0067] 且其中在位置1至3 (相对于重链可变区的位置98至100,位置97是位于该⑶R3 区之前的不可变的精胺酸）存有一个且不超过一个精氨酸。
[0068] 根据本发明，应了解本发明的结合蛋白的氨基酸序列并不限于20种常规氨基 酸（见 Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))，其通过引用并入本文）。举例来说，所述氨基酸可 能包括该20种常规氨基酸的立体异构体（例如D-氨基酸）、非天然氨基酸诸如a -，α -二 取代氨基酸、Ν-烷基氨基酸、乳酸及其他非常规的氨基酸。非常规氨基酸的实例（其也可 能为本发明的结合蛋白的适当成分）包括：4_羟基脯氨酸、羧基谷氨酸、ε-Ν，Ν，Ν_三 甲基赖氨酸、ε -Ν-乙酰基赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、Ν-乙酰基丝氨酸、Ν-甲酰基甲硫氨酸、 3_甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ο-N-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨基酸，例如 4_羟基脯氨酸。
[0069] 另外，根据本发明，在SEQ ID NO: 1至51中所示的氨基酸序列中的轻微变异被认 为包含于本发明，只要该氨基酸序列中的变异维持如SEQ ID NO: 1至51中所示序列的至少 75%、更优选至少80%、90%、95%和最优选99%。该变异可发生在框架区内（即⑶R之 外）、⑶R内或在框架区及⑶R之内。在SEQ ID NO: 1至51中所示的氨基酸序列中的优选 的变异（即删除、插入和/或取代至少一个氨基酸）发生在靠近功能性结构域的边界。结 构性和功能性结构域可通过比较该核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或专用序列数据 库加以确认。计算机比较法可被用来鉴别发生在其他已知结构和/或功能的结合蛋白中的 序列基序（motif)或预测的蛋白质构型结构域。鉴别折叠成已知三维结构的蛋白序列的方 法为本领域所已知。见例如 Bowie 等·（1991) Science 253:164 ;Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed. , ff. H. Freeman and Company, New York (1984))； Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze,eds. , Garland Publishing,New York, N.Y. (1991));以及 Thornton 等.1991 Nature354:105,上述文献均 通过引用并入本文。因此，本领域技术人员可识别可能用来定义本发明所述的结构性及功 能性结构域的序列基序和结构构型。
[0070] 在SEQ ID NO: 1至51中所示的氨基酸序列中，特别优选的变异为导致对蛋白水解 或氧化的敏感性降低、改变糖基化模式或改变结合亲和性或授予或修饰该结合蛋白的其他 物理化学或功能特性的那些变异。特别是可考虑保守性氨基酸取代。保守性取代是指发生 于侧链相关的氨基酸家族内的那些取代。优选的氨基酸家族包括下列：酸性家族=天冬氨 酸、谷氨酸；碱性家族=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；及不带电极性家族=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨 酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族为：脂肪族-羟基家族=丝氨酸及 苏氨酸；含酰胺家族=天冬酰胺及谷氨酰胺；脂肪族家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮 氨酸；及芳香性家族=苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸。举例来说，可以合理期待以异亮氨酸或 缬氨酸独立取代亮氨酸、以谷氨酸独立取代天冬氨酸、以丝氨酸独立取代苏氨酸或以结构 相关的氨基酸类似地取代氨基酸将不会对所形成的结合蛋白的结合或特性产生重大影响， 特别是如果该取代并未牵涉在框架区内的氨基酸。氨基酸改变是否会导致功能性结合蛋 白，即是否导致与⑶頂结合的抗原结合蛋白可通过ELISA或FACS试验容易地测定。
[0071] 在一些实施方案中，所述CDIM结合蛋白为具有抗体样结合活性的"支架蛋白"，其 中SEQ ID NO: 1至24中的一个或多个⑶R如上文定义地嵌入支架中。在一些实施方案中， 至少⑶RH3和⑶RL3嵌入支架中。在一些实施方案中，所有六个⑶R嵌入支架中。所述支 架蛋白是否具有⑶頂结合活性可通过与MAb 216竞争结合的ELISA或FACS试验（MAb 216 是一种天然存在的CDIM结合抗体）或体外或体内功能性试验容易地测定。
[0072] 另外，根据本发明，应了解的是本发明的CDIM结合抗体为全人或人源化抗体。人 抗体避免与异种抗体有关的某些问题，例如具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体。 异种源性蛋白如小鼠或大鼠源性蛋白的存在可导致患者产生针对该抗体的免疫反应，继而 导致快速清除该抗体、通过中和该抗体而丧失治疗效用和/或严重、甚至致命的过敏反应。
[0073] 本文描述的抗原结合蛋白可以是抗体或可以源自抗体。在某些实施方案中，所述 抗原结合蛋白的多肽结构是基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、迷你抗体 (minibodies)、结构域抗体、合成抗体（本文有时称为"抗体模拟物"）、嵌合抗体、人源化抗 体、人抗体、抗体融合（本文有时称为"抗体共轭物"）和它们的片段。本文提供的抗原结合 蛋白已显示能与所有B细胞（包括肿瘤性B细胞和一些实体肿瘤细胞）上的CDIM表位结 合。如实施例所示，受伤B细胞的自行修复和存活的能力下降或受到抑制。因此，本发明的 抗原结合蛋白能耗尽和杀灭B细胞，包括肿瘤细胞。本文公开的抗原结合蛋白具有多种用 途。举例来说，这些抗原结合蛋白中有些能用于特定结合试验以亲和纯化CDIM表达细胞， 有些可用于筛选试验以鉴别⑶頂表达细胞包括实体肿瘤细胞和B细胞来源的细胞。此外， 本发明的抗原结合蛋白可被用于诊断和/或治疗疾病，如B细胞增生性疾病及自身免疫疾 病。就此而言，本发明公开的抗原结合蛋白可单独使用或与小分子化学治疗剂组合使用。
[0074] 在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白为多价CDIM结合蛋白（即，具有两个或更 多个CDIM表位的结合位点的CDIM结合蛋白）。因此，该结合蛋白可作为对CDIM表位具有 特异亲和性和亲合力的受体，通常至少约1(Γ6Μ，更优选为至少约1(Γ7Μ。所述受体的多价特 性允许同时结合在细胞膜表面上的至少两个CDIM表位。可使用来自任何免疫球蛋白家族 的抗体，如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM ;所述抗体不需要具有与特定Fc启动作用有关的各种 细胞毒性作用。在一个实施方案中，所述抗体将为IgM，因为此分子的五聚体或六聚体结构 允许不受立体位阻干扰的交联。在一些实施方案中，所述抗体组合物为IgM五聚体和IgM 六聚体的混合物，包括至少20 %六聚体、或至少30 %六聚体、至少40 %六聚体、至少50 %六 聚体、或至少60%六聚体、或至少70%六聚体、或至少80%六聚体。或者，可使用抗体片段 或它们的类似抗体作用的合成性替代物。举例来说，可设计允许与CDIM表位特异结合和交 联的小型合成分子。
[0075] 在一个实施方案中，所述抗体具有J链，在另一个实施方案中，所述抗体无 J链。
[0076] 在一个方面中，所述抗原结合蛋白为基于VH4-34种系序列构建的重组抗体。 VH4-34基因（重链可变区）为已鉴别的53个人功能性抗体种系基因的其中之一。VH4-34 基因存在于所有单体型，并且从不相关个体分离的种系DNA中并未发现序列变异。抗B细 胞 VH4-34 抗体对 B 细胞具有细胞毒性（Bhat 等·（1997) Clin. Exp. Immunol. 108:151 and Bhat et al.(2001)Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39:59)。如上文所暗不，由抗体诱导的细胞 膜缺损或破洞比其他广为周知的孔形成蛋白所形成的大。通过使细胞通透，本发明的CDIM 结合蛋白能有效显著地耗尽靶细胞（也见于专利
【发明者】纳尔逊·N·H·邓, 倪丽娜·M·巴特, 玛西亚·M·比伯, 布鲁斯·A·凯特 申请人:Igm生物科学有限公司