一种禽偏肺病毒f蛋白多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种F蛋白多肽及其应用。该抗原多肽是根据F蛋白基因序列，进行生物信息学分析比较得到的，该抗原多肽的氨基酸序列是CTNAGSTAYYPNKDD。该抗原多肽保守性高、抗原性强，利用该多肽能产生针对禽偏肺病毒F蛋白的单克隆抗体。
【专利说明】一种禽偏肺病毒F蛋白多肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种禽偏肺病毒F蛋白多肽，本发明还涉及该蛋白多肽在检测禽偏肺病毒感染中的用途。
【背景技术】
[0002]禽偏肺病毒(aMPV)感染作为目前危害养鸡业健康发展的新发传染病，其病原aMPV属于副粘病毒科肺病毒亚科肺病毒属，无血凝和神经氨酸酶特性。aMPV可广泛引起鸡、火鸡、雉鸡、珍珠鸡发病，在野生鸟类中也可检测到抗体。病禽感染aMPV后，常有温和或严重的呼吸道症状，采食量及产蛋量下降。许多鸡只头部肿大，aMPV是诱发鸡肿头综合征(SHS)的主要病原；而火鸡主要表现为急性呼吸道症状一火鸡鼻气管炎(TRT)。
[0003]aMPV可以感染各年龄的鸡只，肉鸡主要感染日龄为4_7周，高峰在5_6周，种鸡为24-25周龄。而本发明人检测到种鸡群中，有些肉种鸡在10周龄就有50%的抗体阳性率。aMPV具有极高的传染性，其致病率高，传播速度快，死亡率因养殖条件、个体营养水平及并发、继发感染状态不同差异很大。传播方式为水平传播，主要通过病禽直接接触传播和饲养人员、器具、饲料的机械传播，不能完全排除垂直传播的可能性。aMPV可在不同禽类之间传播，甚至可以直接或间接感染鼠。在鸡传染性支气管炎、传染性法氏囊病存在的情况下，aMPV会对鸡群造成严重后果，继发大肠杆菌后，产蛋率下降，死淘率明显升高，死亡率1-20%不等，取决于继 发感染的控制水平。
[0004]目前禽偏肺病毒的单克隆抗体有报道是利用C亚群病毒制备成的单克隆抗体，共获得6株，均是针对病毒N蛋白制备而成，其他蛋白的单克隆抗体均未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的是提供一种F蛋白多肽；
[0006]本发明的第二个目的在于提供一种针对禽偏肺病毒F蛋白的单克隆抗体；
[0007]本发明的第三个目的在于提供一种用于禽偏肺病毒感染监测的检测试剂盒。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]一种禽偏肺病毒F蛋白多肽，其氨基酸序列是CTNAGSTAYYPNKDD。该多肽可以采用人工合成的方法直接合成得到。
[0010]进一步，基于该多肽通过将其与载体蛋白偶联，可以获得具有免疫原性的抗原，所述载体蛋白包括但不限于血清蛋白、卵清蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白及纤维蛋白。
[0011]进一步，本发明提供一种单克隆抗体，其是由所述的抗原作为免疫原制备获得。可以按照本领域公知的方法制备得到单克隆抗体，通过将本发明F蛋白多肽与载体蛋白偶联，进行动物免疫得到致敏B淋巴细胞，然后将其与同系骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，通过选择性培养筛选融合的杂交瘤细胞，然后再进一步筛选杂交瘤细胞阳性克隆，最后将筛选出的阳性克隆进行扩大培养分泌得到单克隆抗体。
[0012]在本发明实施例中，采用如下方法制备得到针对禽偏肺病毒F蛋白单克隆抗体:[0013]1)多肽偶联和动物免疫
[0014]将上述F蛋白多肽与钥孔虫戚血蓝素和牛血清白蛋白偶联，脱盐之后，钥孔虫戚血蓝素偶联的多肽与等量的福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂混合，作为免疫原，用与福氏完全佐剂混合的免疫原免疫小鼠，然后在随后的几天内，用与福氏不完全佐剂混合的免疫原多次加强免疫，酶联免疫吸附试验检测免疫反应。
[0015]2)杂交瘤细胞生产
[0016]从免疫滴度最高的小鼠身上提取脾脏，分离出脾细胞，并利用PEG4000与鼠骨髓瘤细胞SP2/0按4:1比例融合，洗涤后，新融合的杂交瘤细胞用含20%胎牛血清和2%次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷的改良Eagle’ s培养基培养3天后，分到96孔板中用含有20%胎牛血清和2%HAT的改良Eagle’s培养基培养14天，用ELISA检测筛选出阳性克隆细胞，再用含有20%胎牛血清的改良Eagle’ s培养基扩大培养。
[0017]实验表明，本发明单克隆抗体能与F蛋白反应，产生良好的阳性信号，灵敏度高达
0.lng，可以用于禽偏肺病毒感染检测。
[0018]进一步，本发明还提供包含上述单克隆抗体的检测试剂盒，用于禽偏肺病毒感染的检测，其还可进一步包括酶标二抗、标准品、底物显色液、终止液等等中的一种或多种。
[0019]本发明根据禽偏肺病毒F基因蛋白序列，设计的抗原短肽保守性高、抗原性强。利用此抗原短肽制备的单克隆抗体的灵敏度高且稳定。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是短肽的免疫反应结果，其对应于表1的数据，第6列和第12列为对照。
[0021]图2是杂交瘤细胞克隆后筛选结果，对应于表2中的数据，从左向右从上向下为I~7张96孔板。
[0022]图3是针对Peptide多肽第二次特异性ELISA筛选结果，对应于表3中的数据。
[0023]图4是针对Peptide多肽灵敏度检测结果，对应于表4中的数据。
[0024]图5是5株单克隆抗体株亚型鉴定结果，对应于表5中的数据。
[0025]图6是5株单克隆抗体用于F蛋白表达的IFA检测结果。
[0026]图7是单克隆抗体检测禽偏肺病毒感染的IFA (图7A)和WB (图7B)结果。
【具体实施方式】
[0027]以下实施例用于对本发明的进一步说明，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0028]实施例1禽偏肺病毒F蛋白抗原短肽的确定
[0029]根据禽偏肺病毒F基因蛋白序列，进行生物信息学分析比较，确定以下多肽:CTNAGSTAYYPNKDD作为抗原短肽，命名为F蛋白多肽。该抗原短肽保守性高、抗原性强，并由上海吉尔生化公司合成，偶联时依据顺丁烯二酰亚胺理论，即将多肽序列中的半胱氨酸残基与载体蛋白中的氨基偶联。因此，在设计多肽抗原时常在其N端或C端添加一个半胱氨酸残基以利于多肽与载体蛋白的偶联。
[0030]实施例2单克隆抗体的制备
[0031]1)多肽偶联和动物免疫[0032]多肽与KLH (Pierce Cat#77611)和 BSA (AMRESCO code0332)偶联。脱盐之后，KLH偶联的多肽与等量的CFA或IFA混合，作为免疫原，4度保存。3只BALB/c鼠在第O天用与CFA混合的免疫原免疫，然后再随后的几天内，用与IFA混合的免疫原多次加强免疫。在第14天抽取小鼠的尾血，包被未偶联的多肽和载体蛋白BSA偶联的多肽，用ELISA检测相应的滴度以观察针对抗原的免疫反应。
[0033]ELISA的检测方法是:100ng检测原加到96孔板(Corning, USA)的每孔中，4°C包板过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次之后，5%脱脂奶粉PBS室温封闭一小时，然后，加用5%脱脂奶粉PBS稀释的尾血(1:500tol:50000)室温I小时。PBS洗两次之后，用5%脱脂奶粉PBS稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的用羊抗鼠IgG Fe Y-specific 二抗(1:2000, Jackson Immune)室温1小时。PBST洗五次之后，加入HRP底物TMB显色。IOmin后，用 Microplate reader 读取 450nm 吸光度。
[0034]结果见表1和图1,从结果可以看出，观察到高滴度，信号分别是1#>2#。由于使用的二抗是鼠IgG Fe Y -specific,高滴度表明动物体内已经产生了大量的针对短肽的IgG，1#小鼠做进一步融合。
[0035]表1短肽的免疫反应结果
[0036]
【权利要求】
1.一种F蛋白多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列是CTNAGSTAYYPNKDD。
2.一种抗原，其是由权利要求1所述F蛋白多肽与载体蛋白偶联得到。
3.根据权利要去2所述的抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自:血清蛋白、卵清蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白。
4.一种单克隆抗体，其是由权利要求2或3所述的抗原作为免疫原制备获得。
5.—种检测试剂盒,其含有权利要求4所述的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其还包括选自酶标二抗、标准品、底物显色液和终止液中的一种或多种。
7.含有权利要求1所述的F蛋白多肽的生物制品。
8.权利要求1所述的F蛋白多肽在制备针对禽偏肺病毒F蛋白单克隆抗体上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤: O多肽偶联和动物免疫 权利要求1所述的多肽与钥孔虫戚血蓝素和牛血清白蛋白偶联，脱盐之后，钥孔虫戚血蓝素偶联的多肽与等量的福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂混合，作为免疫原，用与福氏完全佐剂混合的免疫原免疫小鼠，然后在随后的几天内，用与福氏不完全佐剂混合的免疫原多次加强免疫，酶联免疫吸附试验检测免疫反应； 2)杂交瘤细胞生产 从免疫滴度最高的小鼠身 上提取脾脏，分离出脾细胞，并利用PEG4000与鼠骨髓瘤细胞SP2/0按4:1比例融合，洗涤后，新融合的杂交瘤细胞用含20%胎牛血清和2%次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷的改良Eagle’s培养基培养3天后，分到96孔板中用含有20%胎牛血清和2%HAT的改良Eagle’ s培养基培养14天，用ELISA检测筛选出阳性克隆细胞，再用含有20%胎牛血清的改良Eagle’ s培养基扩大培养。
【文档编号】C07K19/00GK103739679SQ201410018287
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】王菁, 刘爵, 韦莉, 朱珊珊, 张春燕, 阎旭, 全荣, 李子璇 申请人:北京市农林科学院