一种rhNGF成熟肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种rhNGF成熟肽的制备方法。步骤为表达载体及工程菌的构建；包涵体表达，收集菌体；包涵体裂解、洗涤、溶解、复性，得到pro-rhNGF复性液；阳离子交换层析初步纯化pro-rhNGF复性液；疏水作用层析二次纯化pro-rhNGF；胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前导肽获得rhNGF成熟肽；rhNGF成熟肽的第三次纯化得到纯化的rhNGF成熟肽。本发明的方法可进行产业化生产rhNGF成熟肽，纯度高，得率高。
【专利说明】—种rhNGF成熟肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及rhNGF成熟肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]神经生长因子(NGF)作用广泛，其中β亚单位是NGF的活性区。目前商品化的β -mNGF如恩经复? CN0BEX),是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化获得。广泛应用眼科、神经外科、骨科、神经内科、儿科、内分泌科神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗。
[0003]正因为注射用鼠神经生长因子的需求不断扩大，而现今的NGF产品存在两个潜在的瑕疵:第一，因为是鼠源颌下腺中提取的蛋白质，具有潜在的免疫原性。第二，随着需求的扩大，需要大量的合格的小鼠颌下腺，成为扩大规模的瓶颈。因此，重组人神经生长因子的开发迫在眉睫。近年来，已有大量的重组表达β-hNGF的报道，包括在原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统里的表达，但仍未有研究成果应用于产业化。究其原因，其中大部分表达策略是直接将编码IlSaa的成熟肽基因直接进行重组表达，而没有考虑到成熟肽形成过程中，N端上游的导肽在成熟肽的表达过程中具有促进其正确折叠的作用，从而影响其产业化的进程。
[0004]通常所说的β-hNGF是118个氨基酸成熟肽。在人体内，从编码基因到成熟肽经历下列过程:①prepro-hNGF编码序列(723bp)翻译成prepro-hNGF (241aa),prepro-hNGF 包括信号妝(prepeptide, aa:1-18)、导妝(propeptide, aa:19-121)、妝(peptide, aa: 122-241)；②prepro-hNGF在内质网上被信号肽酶水解形成pro-hNGF,pro-hNGF包括导肽和肽 。导肽末端带有4个氨基酸残基(aa: 118-121)Arg-Ser-Lys_Arg,该4个氨基酸序列为哺乳动物前体蛋白加工酶(proprotein convatases)的识别位点，导肽可被高尔基体中的前体蛋白加工酶-弗林蛋白酶(fur in)识别并切除，形成hNGF (120aa)；③hNGF在7S hNGF中的Y -亚基作用下切除C端的ArgAla形成hNGF成熟肽(118aa)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种能够产业化生产hNGF成熟肽的方法。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种rhNGF成熟肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
[0007]I)表达载体及工程菌的构建:
[0008]人工合成SEQ ID NO:3序列，NdeI和BamHI双酶切后克隆入pETlla空载体中得到构建好的融合表达载体pETlla-pro-hNGF ;将所述融合表达载体pETlla-pro-hNGF转化到大肠杆菌Rosetta (DE3)得到表达工程菌；
[0009]2) pro-rhNGF的包涵体表达,收集菌体；
[0010]3) pro-rhNGF的包涵体裂解、洗涤、溶解、复性，得到pro-rhNGF复性液；
[0011]4)阳离子交换层析初步纯化pro-rhNGF ；
[0012]5)疏水作用层析二次纯化pro-rhNGF ；[0013]6)胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前导肽获得rhNGF成熟肽；
[0014]7)阳离子交换层析第三次纯化得到rhNGF成熟肽。
[0015]所述步骤2)为将步骤1)所得表达工程菌划线于琼脂板上，在37°C恒温箱中倒置培养过夜，活化菌株；挑取单菌落接种于100mL液体含50 μ g/mL Amp的LB培养基中，37°C，180rpm条件下振荡培养约10_12h ;按1:50的比例转接于新鲜的液体LB培养基中，37°C，250rpm条件下振荡培养至0D600 ^ 1.0-1.2 ;立即加入IPTG至终浓度为ImM，37°C，250rpm条件下诱导表达4h, 8000rpm, 4°C离心20min收集菌体。
[0016]所述步骤3)的裂解为将步骤2)所得菌体添加Lysis buffer,重悬菌体；再分别按照终浓度为10 μ g/mL、3mM/L添加DNase和MgCl2 ;在冰水浴中进行超声波破碎菌体，超声波处理Is,停止2s,共处理IOmin,收集沉淀；所述Lysis buffer为0.1M Tris-HCl, ImMEDTA, pH7.0 ；Lysis buffer 添加量按照 5ml Lysis buffer/g 菌体的比例添加；
[0017]所述步骤3)的洗漆为加入步骤2)中Lysis buffer的1/2体积的Triton buffer到上述沉淀即包涵体中，室温振荡30min ;12000rpm4°C离心10min,去上清；用等体积的Lysis buffer 重悬沉淀，添加 1/2 体积 Triton buffer,室温振荡 30min ; 12000rpm4°C离心lOmin,去上清；用等体积的IB wash buffer重悬沉淀，12000rpm4°C离心10min,去上清；重复洗涤包涵体3-4次，洗涤后的包涵体可保存于_80°C中；
[0018]所述Triton buffer 为 6%Triton X-100,1.5M NaCl,60mM EDTA,所述 IB washbuffer 为 0.1M Tris-HCl,20mM EDTA,pH7.0 ；
[0019]所述步骤3)的溶解为按5mL/g洗涤后的包涵体的比例添加溶解buffer，室温溶解包涵体；待沉淀全部溶后，12000rpm，4°C离心10min，取上清；
[0020]所述溶解buffer为6M盐酸胍，IOOmM DTT ；
[0021]所述步骤3)的复性为使用6M盐酸胍溶液透析溶解步骤所得上清，室温透析3h后更换透析缓冲液，于4°C透析过夜；再将其添加至复性液中，逐滴添加，每30min添加500 yL ;直至蛋白样品中盐酸胍终浓度降至200mM;将复性液于4°C过夜得到复性液，所述复性液为 0.1M Tris-HCl, IM L-Arginine, 5mM EDTA, 0.61g/L OxidizedGlutathione, 1.53g/L Reduced Glutathione。
[0022]所述步骤4)为使用buffer A透析步骤3)所得复性液，更换buffer A3-4次；Akta PuriferlOO 层析系统色谱柱为 SP Sepharose Fast Flow5mL ;A1 泵为 buffer A, BI泵为buffer B ;更换之前,先用纯水洗泵,换上buffer A、B后，Al、BI分别进行洗泵,管路走100%A1相；基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min，上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；设置梯度洗脱，0-100%buffer B，梯度长度为20个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分；洗脱缓冲液流速设置为5mL/min ；
[0023] 所述buffer A 为 50mM PBS，pH=7, buffer B 为 50mM PBS，IM NaCl，pH=7。
[0024]所述步骤5)为使用Akta PuriferlOO层析系统进行疏水层析纯化，色谱柱为:HiTrapCapto Phenyl Sepharose6Fast Flow High SubSmT, ；A1 泵为 buffer AMS, BI 泵为buffer A ;更换之前,先用纯水洗泵,换上buffer AMS、buffer A后，Al、BI分别进行洗泵，管路走100%A1相；添加硫酸铵至步骤4)分离收集得到的蛋白样品中，使其终浓度为IM ;基线冲平后，buffer AMS至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min，上完样后，buffer AMS冲洗至无紫外吸收；设置梯度洗脱，0_100%，梯度长度为6个柱体积；收集相应吸收峰下的馏分；
[0025]所述buffer AMS 为 50mM PBS，IM 硫酸铵，pH=7，buffer A 为 50mM PBS，pH=7。
[0026]所述步骤6)为使用buffer A透析疏水层析分离得到的蛋白样品，或使用3KD的超滤浓缩管置换样品缓冲液为buffer A，使样品浓度约为0.5mg/mL ;按25011^ hpro_NGF添加Img Trypsin的比例,添加Trypsin, 4°C处理14_16h,可缓慢搅拌,50rpm ;得到rhNGF成熟肽；
[0027]所述buffer A 为 5OmM PBS，pH=7。
[0028]所述步骤7)为使用AKTA PuriferlOO层析系统来进行步骤6)所得rhNGF成熟肽的再次纯化，色谱柱为SP Sepharose Fast Flow5mL ；A1泵为buffer A, BI泵为bufferB ;更换之前，先用纯水洗泵，换上buffer A、B后，Al、BI分别进行洗泵，管路走100%A1相；基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min，上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；设置梯度洗脱，0-100%buffer B，梯度长度为20个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分即可；洗脱缓冲液流速设置为5mL/min ；
[0029]还可以使用buffer A透析分离得到的馏分，或使用3KD的超滤浓缩管置换样品buffer A ；
[0030]所述buffer A 为 50mM PBS, pH=7，buffer B 为 50mM PBS, IM NaCl, pH=7。
[0031]本发明包括了导肽序列，在最后的切除步骤时才去掉导肽序列；导肽对hNGF成熟肽的正确折叠起到辅助作用，在复性过程中能大大提高得率。与此同时，重组表达时引入导肽可在下游纯化中增加一个纯化步骤，提高纯度。
[0032]从实施例可以看出，本发明最后得到的rhNGF纯度可达99% ;得率为70%。本发明的方法可进行产业化生产rhNGF成熟肽。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1SDS-PAGE检测pro-rhNGF重组菌破碎产生的上清及包涵体的电泳图。
[0034]图2 AKTA PuriferlOO层析系统阳离子交换纯化pro-rhNGF (第一步纯化)图。
[0035]图3SDP-PAGE分析AKTA PuriferlOO层析系统阳离子交换纯化收集的pro-rhNGF样品电泳图。
[0036]图4 AKTA PuriferlOO层析系统疏水层析纯化pro-rhNGF (第二步纯化)。
[0037]图5SDP-PAGE分析AKTA PuriferlOO层析系统疏水层析纯化收集的pro-rhNGF样品电泳图。
[0038]图6SDP-PAGE分析胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前导肽的电泳图。
[0039]图7 AKTA PuriferlOO层析系统阳离子交换层析纯化rhNGF成熟肽(第三次纯化)。
[0040]图8SDP-PAGE分析?ΚΤΑ PuriferlOO层析系统阳离子交换层析纯化rhNGF成熟肽的电泳图。
[0041]图9鸡胚背 根神经节法检测rhNGF的生物活性光学显微镜图(200倍)。
【具体实施方式】[0042]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0043]实施例1:pETlla-pro-rhNGF表达载体及工程菌的构建和包涵体表达
[0044]1.表达载体及工程菌的构建
[0045]pro-hNGF的编码序列如SEQ ID N0.1所示，翻译所得的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。通过化学合成的办法合成SEQ ID N0.3序列，序列的上下游分别引入NdeI酶切位点和BamHI酶切位点及保护碱基。其中，CATATG为NdeI酶切位点，GGAATTC为保护碱基。GGATCC为BamHI酶切位点，CG为保护碱基，利用限制性内切酶NdeI和BamHI分别对合成的SEQ ID N0.3序列和pETlla空载体(novagen)分别进行双酶切；然后将酶切产物分别用乙醇沉淀纯化；用T4DNA Ligase将纯化后的酶切产物和原核表达载体进行连接反应得到构建好的融合表达载体(pETlla-pro-hNGF);将构建好的融合表达载体(pETlla-pro-hNGF)转化到E.coli TOPlO (novagen)中，经菌液PCR鉴定和测序鉴定后，将鉴定正确的pET-1 la-pro-hNGF 的重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta (DE3)(或 Rosetta (DE3) pLysS)(novagen)表达菌株中，工程菌保存于_80°C。
[0046]2.pro-rhNGF的包涵体表达
[0047](I)用灭菌接菌环刮取_80°C冻存的甘油菌(步骤I所得)，划线于琼脂板上，在37°C恒温箱中倒置培养过夜，活化菌株； [0048](2)挑取单菌落接种于IOOmL液体LB培养基(含50 μ g/mL Amp)中，37°C, 180rpm条件下振荡培养约10_12h ；
[0049](3)按1:50的比例转接于新鲜的液体LB培养基中，37°C，250rpm条件下振荡培养至 0D600 ^ 1.0-1.2 (约 3hr)；
[0050](4)立即加入IPTG至终浓度为ImM，37°C，250rpm条件下诱导表达4h，8000rpm, 4 V离心20min收集菌体，菌体可保存于-80°C冰箱中。
[0051]实施例2:pro-rhNGF包涵体的复性
[0052]1.pro-rhNGF 包涵体裂解
[0053](I)按5ml buffer/g菌体(实施例1所得)的比例添加Lysis buffer (0.1MTris-HCl, ImM EDTA, ρΗ7.0)，重悬菌体；
[0054](2)分别按照终浓度为10 μ g/mL、3mM/L添加DNase和MgCl2 ；
[0055](3)在冰水浴中进行超声波破碎菌体，超声波处理ls，停止2s，共处理lOmin，SDS-PAGE检测上清及包涵体(沉淀)，泳道I和泳道2为菌体超声破碎后的上清，泳道3和泳道4为菌体超声破碎后的沉淀，可以看出裂解的沉淀中可见pro-rhNGF，大小约为30KDa。
[0056]2.pro-rhNGF 包涵体洗漆
[0057](I)加入 I (I)中添加的 Lysis buffer 的 1/2 体积的 Triton buffer (6%TritonX-100,1.5M NaCl,60mM EDTA)到上述沉淀即包涵体中，室温振荡30min ；
[0058](2) 12000rpm4°C离心 lOmin,去上清；
[0059](3)用等体积的 Lysis buffer (0.1M Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ7.0)重悬沉淀(可使用超声波破碎仪进行)，添加 1/2 体积 Triton buffer(6%Triton X-100,1.5M NaCl,60mMEDTA)，室温振荡30min ；
[0060](4) IZOOOrpmfC离心 lOmin,去上清；
[0061](5)用等体积的 IB wash buffer (0.1M Tris-HCl, 20mM EDTA，ρΗ7.0)重悬沉淀，12000rpm4°C离心 lOmin,去上清；
[0062](6)重复步骤(1) - (5)洗涤包涵体3-4次，洗涤后的包涵体可保存于_80°C中。
[0063]3.pro-rhNGF 包涵体溶解
[0064](1)按5mL/g洗涤后的包涵体的比例添加溶解buffer (6M盐酸胍，IOOmM DTT),室温溶解包涵体，可使用超声波破碎仪辅助溶解；
[0065](2)待沉淀全部溶(浑池状)，12000rpm,4°C离心10min,取上清(会有白色沉淀)；
[0066](3)使用6M盐酸胍溶液透析包涵体溶液，可室温透析3h后更换透析缓冲液，于4°C透析过夜。
[0067]4.pro-rhNGF 包涵体复性
[0068]缓慢添加包涵体溶解液(上述步骤3 (3)所得)至复性液(0.1M Tris-HCl, IML-Arginine, 5mM EDTA, 0.61g/L Oxidized Glutathione, 1.53g/L Reduced Glutathione)中，逐滴添加,每30min添加500 μ L ;直至蛋白样品中盐酸胍终浓度降至200mM。将复性液于4°C中过夜得到复性液。
[0069]实施例3:pro-rhNGF的分离纯化
[0070]1.阳离子交换层析初步纯化pro-rhNGF
[0071](I)使用buffer A (50mM PBS, pH=7)透析复性液，更换bufTer3_4次；每次透析2h。
[0072](2)使用AKTA PuriferlOO层析系统来进行(I)所得的初步纯化，色谱柱为SPSepharose Fast Flow5mL ；
[0073](3)仪器操作完全按照 protocol 进行,Al 泵为 buffer A (50mM PBS,pH=7),BI 泵为buffer B (50mM PBS, IM NaCl, pH=7);更换之前，先用纯水洗泵(每次换buffer均要进行此操作)，换上buffer A、B后，Al、BI分别进行洗泵,管路走100%A1相；
[0074](4)基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min,上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；
[0075](5)设置梯度洗脱，0_100%buffer B，梯度长度为20个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分。洗脱缓冲液流速设置为5mL/min。
[0076]该步骤纯化色谱图见图2，SDS-PAGE检测图见图3。其中泳道I为纯化前样品，泳道2为流穿液，泳道3为峰形I收集样，泳道4为峰形2收集样；从色谱图可知，所获得收集样，对称性较好，经过SDS-PAGE检测，泳道3、4中的主带大小与pro-rhNGF预期的大小相符，可确定为pro-rhNGF。
[0077]2.疏水作用层析二次纯化pro-rhNGF
[0078](I)使用AlCTA PuriferlOO层析系统进行疏水层析纯化,色谱柱为:HiTrapCaptoPhenyl Sepharose6Fast Flow(High Sub)5mL ；
[0079](2) Al 泵为 buffer AMS (50mM PBS, IM 硫酸铵，pH=7)，BI 泵为 buffer A (50mMPBS，pH=7);更换之前，先用纯水洗泵(每次换buffer均要进行此操作)，换上buffer AMS、buffer A (50mM PBS, pH=7)后，Al、BI 分别进行洗泵，管路走 100%A1 相；
[0080](3)添加硫酸铵至步骤I分离收集得到的蛋白样品中，使其终浓度为1M。基线冲平后,buffer AMS至少平衡5个柱体积后开始上样,流速设置:上样为10mL/min,上完样后，buffer AMS冲洗至无紫外吸收；
[0081](4)设置梯度洗脱，0-100%，梯度长度为6个柱体积。收集相应吸收峰下的馏分。
[0082]该步骤纯化色谱图见图4，SDS-PAGE检测图见图5。其中泳道I为收集样品1，泳道2为收集样品2，从图中可以看出，经疏水层析后获得纯度较高的pro-rhNGF。
[0083]实施例4:rhNGF成熟肽的分离纯化及生物学活性检测
[0084]1.胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前导肽获得rhNGF成熟肽
[0085](1)使用buffer A (50mM PBS, pH=7)透析疏水层析分离得到的蛋白样品，或使用3KD的超滤浓缩管置换样品缓冲液为buffer A，使样品浓度约为0.5mg/mL。使用紫外吸收法测定蛋白浓度，计算公式为1.45*A280-0.74*A260 ；
[0086](2)按 250mg hpro-NGF 添加 Img Trypsin 的比例，添加 Trypsin, 4°C处理 14_16h,可缓慢搅拌(50rpm)。Trypsin可切割去除Mature-NGF上游的导肽。酶切的结果见图6,其中泳道I为酶切前的pro-rhNGF，泳道2为酶切后的获得的样品，如图中箭头所示。理论预测的pro-hNGF大小为24.7KD，理论预测的hNGF大小为13.2KD，图中所示大小与之相符，可确定所获样品为rhNGF。
[0087]2.rhNGF成熟肽的制备
[0088](1)使用AKTA PuriferlOO层析系统来进行rhNGF成熟肽(也即上述所得酶切后的rhNGF)进行再次纯化，色谱柱为SP Sepharose Fast Flow5mL ；
[0089](2)仪器操作完全按照 protocol 进行,Al 泵为 buffer A (50mM PBS,pH=7),BI 泵为buffer B (50mM PBS, IM NaCl, pH=7);更换之前，先用纯水洗泵(每次换buffer均要进行此操作)，换上buffer A、B后，Al、BI分别进行洗泵,管路走100%A1相；
[0090](3)基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min,上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；
[0091](4)设置梯度洗脱，0-100%buffer B，梯度长度为20个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分。洗脱缓冲液流速设置为5mL/min。收集相应吸收峰下的馏分。
[0092](5)使用buffer A透析分离得到的蛋白样品(即(4)所收集到的馏分)，或使用3KD的超滤浓缩管置换样品buffer为buffer A,紫外吸收法测定浓度，冷冻离心浓缩并保存于-20 °C。
[0093]该步骤纯化色谱图见图7，SDS-PAGE检测图见图8。泳道I为蛋白marker，泳道I即为rhNGF成熟肽。从图中可以看出经过三步纯化获得的rhNGF纯度可达99%。得率为70%。
[0094]3.rhNGF成熟肽生物学活性检测
[0095]取9d龄鸡胚(白壳蛋鸡)，显微解剖镜下，剥离背根神经节，分散接种在无血清的DMEM培养基中，实验组中加入纯化的rhNGF成熟肽，37°C培养48h，倒置显微镜下观察突起生长。检测结果见图9，其中1为6ng-恩经复原液处理(厦门北大之路生物工程有限公司上市产品)的神经节，2为6ng-rhNGF处理的神经节，3为阴性对照(PBS);结果表明利用本方案表达、纯化获得的rhNGF成熟肽与恩经复具有相当的生物活性。1，2均为神经纤维长满四周，按照评价标准是一致的。
[0096]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范 围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种rhNGF成熟肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤， 1)表达载体及工程菌的构建: 人工合成SEQ ID NO:3序列，NdeI和BamHI双酶切后克隆入pETlla空载体中得到构建好的融合表达载体pETlla-pro-hNGF ;将所述融合表达载体pETlla-pro-hNGF转化到大肠杆菌Rosetta (DE3)得到表达工程菌； 2)pro-rhNGF的包涵体表达，收集菌体； 3)pro-rhNGF的包涵体裂解、洗涤、溶解、复性，得到pro-rhNGF复性液； 4)阳离子交换层析初步纯化pro-rhNGF； 5)疏水作用层析二次纯化pro-rhNGF； 6)胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前导肽获得rhNGF成熟肽； 7)阳离子交换层析第三次纯化得到rhNGF成熟肽。
2.权利要求1所述rhNGF成熟肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)为将步骤O所得表达工程菌划线于琼脂板上，在37°C恒温箱中倒置培养过夜，活化菌株；挑取单菌落接种于IOOmL液体含SOyg/mL Amp的LB培养基中，37 °C，180rpm条件下振荡培养约10-12h ;按1:50的比例转接于新鲜的液体LB培养基中，37°C，250rpm条件下振荡培养至0D600 ^ 1.0-1.2 ;立即加入IPTG至终浓度为ImM，37°C，250rpm条件下诱导表达4h，8000rpm, 4°C离心20min收集菌体。
3.权利要求1所述rhNGF 成熟肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的裂解为将步骤2)所得菌体添加Lysis buffer,重悬菌体；再分别按照终浓度为10 μ g/mL、3mM/L添加DNase和MgCl2 ;在冰水浴中进行超声波破碎菌体，超声波处理ls，停止2s，共处理lOmin，收集沉淀；所述 Lysis buffer 为 0.1M Tris-HCl, ImM EDTA, pH7.0 ；Lysis buffer 添加量按照5ml Lysis buffer/g菌体的比例添加； 所述步骤3)的洗漆为加入步骤2)中Lysis buffer的1/2体积的Triton buffer到上述沉淀即包涵体中，室温振荡30min ;12000rpm4°C离心10min,去上清；用等体积的Lysisbuffer 重悬沉淀，添加 1/2 体积 Triton buffer,室温振荡 30min ; 12000rpm4°C离心 IOmin,去上清；用等体积的IB wash buffer重悬沉淀，I^OOOrpmfC离心10min,去上清；重复洗漆包涵体3-4次，洗涤后的包涵体可保存于_80°C中；
所述Triton buffer 为 6%Triton X-100,1.5Μ NaCl,60mM EDTA,所述 IB wash buffer为 0.1M Tris-HCl,20mM EDTA, pH7.0 ； 所述步骤3)的溶解为按5mL/g洗漆后的包涵体的比例添加溶解buffer,室温溶解包涵体；待沉淀全部溶后，12000rpm，4°C离心10min，取上清； 所述溶解buffer为6M盐酸胍，IOOmM DTT ； 所述步骤3)的复性为使用6M盐酸胍溶液透析溶解步骤所得上清，室温透析3h后更换透析缓冲液，于4°C透析过夜；再将其添加至复性液中，逐滴添加，每30min添加500 μ L ;直至蛋白样品中盐酸胍终浓度降至200mM ;将复性液于4°C过夜得到复性液，所述复性液为 0.1M Tris-HCl, IM L-Arginine, 5mM EDTA, 0.61g/L Oxidized Glutathione, 1.53g/LReduced Glutathione。
4.权利要求1所述rhNGF成熟肽的制备方法,其特征在于,所述步骤4)为使用bufferA透析步骤3)所得复性液,更换buffer A3-4次；AKTA PuriferlOO层析系统色谱柱为SPSepharose Fast Flow5mL ;A1 泵为 buffer A,BI 泵为 buffer B ;更换之前,先用纯水洗泵,换上buffer A、B后，Al、BI分别进行洗泵，管路走100%A1相；基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min，上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；设置梯度洗脱，0-100%bufTer B,梯度长度为20个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分；洗脱缓冲液流速设置为5mL/min ；
所述 buffer A 为 50mM PBS，pH=7，buffer B 为 50mM PBS，IM NaCl，pH=7。
5.权利要求1所述rhNGF成熟肽的制备方法，其特征在于，所述步骤5)为使用AKTAPuriferlOO层析系统进行疏水层析纯化,色谱柱为:HiTrapCapto Phenyl Sepharose6FastFlow High Sub5mL ；A1泵为buffer AMS,BI泵为buffer A ;更换之前,先用纯水洗泵，换上buffer AMS、buffer A后，Al、BI分别进行洗泵,管路走100%A1相；添加硫酸铵至步骤4)分离收集得到的蛋白样品中，使其终浓度为IM ;基线冲平后，buffer AMS至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min，上完样后，buffer AMS冲洗至无紫外吸收；设置梯度洗脱，0-100%，梯度长度为6个柱体积；收集相应吸收峰下的馏分； 所述 buffer AMS 为 50mM PBS，IM 硫酸铵，pH=7，buffer A 为 50mM PBS，pH=7。
6.权利要求1所述rhNGF成熟肽的制备方法,其特征在于,所述步骤6)为使用bufferA透析疏水层析分离得到的蛋白样品，或使用3KD的超滤浓缩管置换样品缓冲液为bufferA,使样品浓度约为0.5mg/mL ;按250mg hpro-NGF添加Img Trypsin的比例，添加Trypsin,4°C处理14-16h,可缓慢搅拌，50rpm ;得到rhNGF成熟肽； 所述 buffer A 为 50mM PBS，pH=7。
7.权利要求1所述rhNGF成熟肽的制备方法，其特征在于，所述步骤7)为使用AKTAPuriferlOO层析系统来进行步骤6)所得rhNGF成熟肽的再次纯化,色谱柱为SP SepharoseFast Flow5mL ;A1泵为buffer `A, BI泵为buffer B ;更换之前,先用纯水洗泵,换上bufferA、B后，A1、B1分别进行洗泵，管路走100%A1相；基线冲平后，buffer A至少平衡5个柱体积后开始上样，流速设置:上样为10mL/min，上完样后，buffer A冲洗至无紫外吸收；设置梯度洗脱，0-100%bUffer B，梯度长度为20个柱体积，收集相应吸收峰下的馏分即可；洗脱缓冲液流速设置为5mL/min ； 还可以使用buffer A透析分离得到的馏分，或使用3KD的超滤浓缩管置换样品bufferA；
所述 buffer A 为 50mM PBS，pH=7，buffer B 为 50mM PBS，IM NaCl，pH=7。
【文档编号】C07K1/18GK103880943SQ201410024115
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】张文宇, 章永垒, 陈星 , 黄奋飞, 白羊, 阮卡, 陈胜亮 申请人:厦门北大之路生物工程有限公司