一种固相树脂及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种固相树脂及其制备方法和用途。所述方法涉及的固相树脂结构如式Ⅰ所示；HMPA-AAn-AM树脂Ⅰ，其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸：Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、Glu、Pro、Gly；n为0-8的整数。所述固相树脂可用于胸腺法新的固相合成。
【专利说明】一种固相树脂及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽固相合成领域，尤其涉及胸腺法新的固相合成方法。
【背景技术】
[0002]胸腺法新是一种由28个氨基酸组成的多肽，其序列为=Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-GIu-Ala-Glu-Asn。它的分子式为=C129H215N33O55，分子量 3108.37。
[0003]胸腺法新原名胸腺肽α 1，又称胸腺素α I或Ta I。胸腺法新是胸腺肽中的一种。胸腺肽是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽，能促进淋巴细胞转化，增强巨噬细胞吞噬活性，可用于治疗多种免疫缺陷病。临床研究表明，胸腺肽a I是胸腺素中最重要、生物活性最强的组分。胸腺法新具有显著的双向免疫调节作用，被认为是一个化学成分明确、刺激作用适中的理想的免疫调节剂。
[0004]胸腺法新可以用以治疗慢性乙肝、慢性丙肝、肝炎后肝硬化(包括代偿期和失代偿期)、原发性肝癌、病毒性重型肝炎。中内外的临床研究表明，单用胸腺法新治疗慢性乙肝，持续应答率与单用干扰素相近，但没有干扰素的毒副作用。虽然胸腺法新的治疗效果并不显著，但在停止治疗后，病毒清除率反而有上升的趋势，也就是说胸腺法新在抑制乙肝病毒上有很强的后续效应。
[0005]目前胸腺法新的合成方法主要是用多肽固相合成法，虽然多肽固相合成技术已经相当成熟，但是在合成 胸腺法新时，其粗品纯度往往不高(低于50%)。这主要是由于胸腺法新形成了 β折叠，使得某些氨基酸的偶联及去保护非常困难。另外，合成过程中使用的王树脂或者CTC树脂容易发生DKP副反应，这也是纯度下降的重要的原因。CN201110069876公开了一种合成胸腺法新的方法，该方法使用PEG Wang树脂，能有效的减少胸腺法新的β折叠，使得粗品的纯度大大提高。但是，DKP还是没能控制得很好，而且PEG王树脂的成本非常高，不利于大生产。
[0006]因此，本领域迫切需要找到一种有效合成胸腺法新的新方法。
【发明内容】
[0007]本发明旨在提供一种多肽固相合成胸腺法新的制备方法。
[0008]在本发明的第一方面，提供了一种结构如式I所示的固相合成树脂；
[0009]HMPA-AAn-AM 树脂 I
[0010]其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg、Lys、Asn、Gin、Asp、Glu、Pro λ Gly ；
[0011]n 为 0-8 的整数；例如 η 为 O、1、2、3、4、5、6、7 或 8。
[0012]在另一优选例中，所述AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg、Lys、Proλ Gly0
[0013]在另一优选例中，所述η为0-4的整数；例如η为O、1、2、3或4。[0014]在另一优选例中，所述侧链保护基团选自Pbf、Boc、Trt、OtBu。
[0015]在另一优选例中，所述AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg (Pbf)、Lys (Boc)、Asn (Trt)、Gln (Trt)、Asp (OtBu)、Glu (OtBu)、Pro、Gly。
[0016]在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的固相合成树脂的制备方法，所述方法包括步骤:
[0017](I)将 Fmoc-AAn-OH 和 AM 树脂缩合，得到 Fmoc-AAn-AM 树脂；
[0018](2)将Fmoc-AAn-AM树脂和去保护剂混合、洗涤得到AAn-AM树脂；
[0019](3)将HMPA-Linker和AAn-AM树脂缩合，得到如上所述的本发明提供的固相合成树脂；
[0020]其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg(Pbf)、Lys (Boc)、Asn (Trt)、Gln (Trt)、Asp (OtBu)、Glu (OtBu)、Pro、Gly ；
[0021]η 为 0-8 的整数；例如 η 为 O、1、2、3、4、5、6、7 或 8。
[0022]在另一优选例中，所述的去保护剂以其总体积计，其中含有3%_20%哌啶，0.5%-10% 二环脒(DBU)JP 0.1Μ-0.5Μ1 —羟基苯并三唑(HOBt)。
[0023]在另一优选例中，所述的去保护剂以其总体积计，其中含有1%_10%哌啶和0.1M-0.5M1 —羟基苯并三唑(HOBt)。 [0024]在另一优选例中，步骤(1)和(3)中所述的氨基酸和树脂的缩合在选自下述的一种或多种缩合剂的存在下进行:N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)、0-(苯并三唑-1-基)-N, N, N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、三羟甲基丙烷(TMP)、二异丙基乙胺(DIPEA)、1 一羟基苯并三唑(HOBt);更佳地，所述的缩合剂中含有N，N’- 二异丙基碳二亚胺(DIC)U 一羟基苯并三唑(H0Bt)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N, N, N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和三羟甲基丙烷TMP);最佳地，所述的缩合剂中含有N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)U -羟基苯并三唑(HOBt)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)。
[0025]在另一优选例中，步骤(1)和(3)中所述的Fmoc-氨基酸和树脂的缩合在缩合剂的存在下进行，所述缩合剂由N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)、I 一羟基苯并三唑(HOBt)和N，N-二甲基吡啶(DMAP)组成。
[0026]在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的固相合成树脂的用途，用于结构如式II所示的胸腺法新的固相合成；
[0027]Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-1le11-Thr12-Thr13-Lys14-AsP15-Leul6-Lys17-Glul8-Lys19-Lys20-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH II
[0028]
[0029]在本发明的第四方面，提供了一种如式II所示的胸腺法新的固相合成制备方法，以如上所述的本发明提供的固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽，获得保护的二十八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用缩合剂进行接肽反应，得保护的二十八肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得胸腺法新。
[0030]在另一优选例中，所述的制备方法包括步骤:
[0031 ] (i )连接 Fmoc-Asn (Trt) -OH,得到 Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 树脂；[0032](ii )将 Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 树脂与去保护试剂混合，脱除 Fmoc ；
[0033](iii)按照Fmoc固相合成法重复步骤(i)中氨基酸与树脂偶联的操作与步骤
(ii)中脱保护操作，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得结构如式III所示的 Fmoc保护的二十八肽树脂；和
[0034](iv) Fmoc保护的二十八肽树脂经裂解液裂解得到胸腺法新；
[0035]FmocSer (tBu) Asp (OtBu) AlaAlaValAsp (OtBu) Thr (tBu) Ser (tBu)IIISer(tBu)Glu(OtBu)IleThr(tBu)Thr(tBu)Lys(Boc)Asp(OtBu)LeuLys(Boc)Glu (OtBu)Lys (Boc)Lys(Boc)Glu(0tBu)ValValGlu(0tBu)Glu(0tBu)AlaGIu(0tBu)Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 树脂
[0036]在另一优选例中，所述的去保护剂以其总体积计，其中含有1%_50%哌啶，
0.5%-10% 二环脒(DBU)，1%-10% 哌嗪，0.5%-10%1 一羟基苯并三唑(HOBt)，0.1%_10%1，4- 二硫代苏糖醇(DTT)，5%-50%乙醇胺，5%-50%叔丁基胺(TBA)，1%-10%环己亚胺，和/或3%-30%N-甲基吡咯烷。
[0037]在另一优选例中，连接或偶联具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽时的缩合剂为下述的一种或一种以上的混合:DIC、HATU, TBTU、HBTU, PyBop, HOBt、Cl-HOBt, DIEA、NMM。
[0038]在另一优选例中，所述裂解液中含有下述一种或一种以上的混合:三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水、苯甲硫醚、苯甲醚。
[0039]据此，本发明提供了一种有效合成胸腺法新的新方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1显示了本发明提供的制备胸腺法新的合成工艺流程图。
[0041 ] 图2显示了实施例制备得到的胸腺法新产品的HPLC图。
[0042]图3显示了实施例制备得到的胸腺法新产品的LC-MS图。
[0043]图 4 显示了用王树脂(Wang resin)的 Fmoc-[20_28] ,Fmoc-[20-22] ,Fmoc-[20-23]、Fmoc-[20-24]和 Fmoc-[20-25]的 LCMS 图。
[0044]图 5 显示了用 HMPA-AM 树脂的 Fmoc-[20-28]、Fmoc-[20-22]、Fmoc-[20-23]、Fmoc-[20-24]和 Fmoc-[20-25]的 LCMS 图。
【具体实施方式】
[0045]发明人经过广泛而深入的研究，发现使用一种特定的树脂可以有效控制胸腺法新固相合成过程中的DKP。在此基础上，完成了本发明。
[0046]本文中所使用的化合物、化学基团和试剂等的表示方法均为所属领域公认的表示方法。为了方便查阅，下表将列出本文中所用到的缩略语及其具体名称:
【权利要求】
1.一种结构如式I所示的固相合成树脂； HMPA-AAn-AM 树脂 I 其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、Glu、Pro、Gly ； η为0-8的整数。
2.如权利要求1所述的固相合成树脂，其特征在于，所述侧链保护基团选自Pbf、Boc,Trt、OtBu。
3.—种如权利要求1或2所述的固相合成树脂的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (1)将Fmoc-AAn-OH和AM树脂缩合，得到Fmoc-AAn-AM树脂； (2)将Fmoc-AAn-AM树脂和去保护剂混合、洗涤得到AAn-AM树脂； (3)将HMPA-Linker和AAn-AM树脂缩合，得到如权利要求1或2所述的固相合成树脂； 其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸:Arg (Pbf)、Lys (Boc)、Asn (Trt)、Gln (Trt)、Asp (OtBu)、Glu (OtBu)、Pro、Gly ；
η为0-8的整数。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(3)中所述的Fmoc-氨基酸和树脂的缩合在缩合剂的存在下进行，所述缩合剂由N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)U -羟基苯并三唑(HOBt)和N，N-二甲基吡啶(DMAP)组成。
5.一种如权利要求1或2所述的固相合成树脂的用途，其特征在于，用于结构如式II所示的胸腺法新的固相合成；
Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Sers-Ser9-Glu10-1le11-Thr12-Thr13-Lys14-Asp15-Leul6-Lys17-Glul8-Lys19—Lys20—Glu21—Val22—Val23—Glu24—Glu25—Ala26—Glu27—Asn28—0H。 II
6.一种如式II所示的胸腺法新的固相合成制备方法，以如权利要求1或2所述的固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽，获得保护的二十八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用缩合剂进行接肽反应，得保护的二十八肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得胸腺法新。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括步骤:
(i )连接 Fmoc-Asn (Trt) -OH,得到 Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 树脂； (ii )将Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM树脂与去保护试剂混合,脱除Fmoc ； (iii)按照Fmoc固相合成法重复步骤(i)中氨基酸与树脂偶联的操作与步骤(ii)中脱保护操作，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得结构如式III所示的Fmoc保护的二十八肽树脂； (iv)Fmoc保护的二十八肽树脂经裂解液裂解得到胸腺法新； FmocSer(t B u) Asp (OtBu)AlaAlaValAsp (OtBu)Thr (t Bu)Ser (t B u)Ser (tBu)Glu (OtBu) IIeThr (tBu)Thr (tBu)Lys (Boc) Asp (OtBu)LeuLys (Boc)Glu (OtBu)Lys(Boc)Lys(Boc)Glu (OtBu)ValValGlu(OtBu)Glu(OtBu)AlaGlu(OtBu)Asn(Trt)-HMPA-AAn-AM 树脂。III
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的去保护剂以其总体积计，其中含有 1%-50% 哌啶，0.5%- 10% 二环脒(DBU)，1%-10% 哌嗪，0.5%-10%1 一羟基苯并三唑(HOBt)，.0.1%-10%1，4- 二硫代苏糖醇(DTT)，5%-50% 乙醇胺，5%-50% 叔丁基胺(TBA)，1%_10% 环己亚胺，和/或3%-30%N-甲基吡咯烷。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，连接或偶联具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽时的缩合剂为下述的一种或一种以上的混合:DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIEA、NMM。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述裂解液中含有下述一种或一种以上的混合:三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水、苯甲硫醚、苯甲醚。
【文档编号】C07K1/06GK103951744SQ201410105039
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】张巍, 袁剑琳, 张成广, 谭松暖, 陈超 申请人:海南双成药业股份有限公司