一种海马活性糖蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种海马活性糖蛋白的制备方法，特点是包括以下步骤：a.将冷冻干燥后的海马粉粹，采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸；配置0～0.25mol/L的NaCl浸提液，与脱脂海马按照1:10～1:35（mL/g）的比例混合于锥形瓶中，摇匀后首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30℃～80℃下热水浸提1～6h，最后滤纸过滤，上清液即为糖蛋白混合溶液；b.海马糖蛋白的纯化：采取Sevage法和乙醇分级沉淀法。将粗纯品用蒸馏水复溶，3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品，优点是省时、高效，全程无有毒有害试剂的残留和污染，并确保了制取糖蛋白的活性。
【专利说明】一种海马活性糖蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种糖蛋白的制备方法，尤其是涉及一种海马活性糖蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]海马为海龙科动物，性温、味甘、归肝、肾经，属于药食同源类生物，是名贵的海洋滋补药物，在我国素有“北方人参，南方海马”之称，具有极高的经济价值。2005《中国药典》收载原动物主要有五种..钱致海马Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder、刺海马/Zhistrix Kaup、大海马/Z kuda Bleeker、三斑海马/Z trimaculatus Leach 或小海马(海蛆)汉japonicus Kaup的干燥体。夏、秋二季捕捞,洗净,晒干；或除去皮膜及内脏,晒干。
[0003]海马药用历史悠久，历代古医籍及我国药典历次版本一部(中药部分)均有收载。公元739年，《本草拾遗》古医籍中陈藏器首次使用海马之名；《神农本草》古医籍中记载--海马性温、味甘、无毒，具有强身补肾、舒筋活络、止痛止血、退热生肌、强心明目、祛疾止喘、夫人催生等功能；明代《本草纲目》记载:海马雌雄成对，其性温暖，有交感之意，故难产及阳虚房中方术多用之，具有暖水脏、壮阳道之功能。现代医学已经证明海马具有较高的营养价值和化 学活性成分，含有大量的镁、钙，其次为锌、铁、锶、锰，少量的钴、镍、铜和铬，还含有大量的硬脂酸、胆留醇、胆留二醇，其不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例较高，其中多烯不饱和脂肪酸EPA (二十碳五烯酸)和DHA (二十二碳六烯酸)较为丰富。海马具有补肾壮阳、调气活血等功效，临床上主要用于治疗阳痿、遗尿、虚喘、症积等。目前对海马化学成分的研究主要集中在氨基酸、微量元素、磷脂、脂肪酸和留体类等，对水溶性组分的研究较少，所以海马水溶性组分的研究有利于人们对海马的认识更加完整。
[0004]海洋拥有特殊的生态环境，赋予了海洋生物异于陆生生物所特有的化学成分和结构，具有特异的高活性、高药效。近年来对海洋药物的研究越发深入，越来越多的研究发现糖蛋白具有很好的医疗保健功效，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、提高免疫力等活性。糖蛋白涉及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物选择性地集中到病灶，提高药效，而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能，降低不良反应。海马蛋白质含量丰富，闻达70%左右。现代科学已证明80%以上的蛋白质都是糖蛋白，包括许多酶、激素、毒素、载体蛋白、免疫球蛋白、结构蛋白、凝集素、受体、粘液组分等，甚至过去人们一直认为是“纯”的多糖，如糖原和纤维素，亦含有少量共价结合的蛋白质。目前，国内外对海马糖蛋白的制备的研究还未见相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高效、快速并能保持糖蛋白活性的海马糖蛋白制备方法。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种海马活性糖蛋白的制备方法，包括以下步骤:(1)海马前处理:将海马洗净冻好后，于-40°c下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；
(2)海马糖蛋白提取:将步骤(1)得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为O~0.25mol/L的浸提液按(10~35) g =ImL的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30°C~80°C下浸提I~6h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液；
(3)海马糖蛋白粗纯化:将步骤(2)得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4°C静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液，进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品。
[0007]步骤(1)中所述的CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为:载气为高纯度CO2,萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58°C、分离釜温度80°C、CO2流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取IOmin和静态萃取125min组成。
[0008]步骤(2)中所述的超声波辅助提取的条件为:超声功率500W，超声时间20min。
[0009]步骤(2)中所述的浸提液中NaCl浓度为0.08mol/L，所述的浸提温度为72.77°C,所述的浸提时间为4.27h，所述的脱脂海马粉与所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g:lmL。此条件为海马糖蛋白提取的最佳工艺参数。
[0010]步骤(3)中所述的Sevage法除游离蛋白的条件为:糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1，所述的Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成。
[0011]步骤(3)中所述的乙醇分级沉淀条件为:将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
[0012]步骤(3)得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化的过程为:取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45 μ m滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05,0.1,0.5mol/L NaHC03进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置，280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明首次公开了一种海马活性糖蛋白的制备方法，采用NaCl浓度为O~0.25mol/L的浸提液浸提并超声波辅助提取，省时、高效，且工艺简单、操作方便，并避免了酸碱及酶解对原始糖蛋白结构的破坏，全程无有毒有害试剂的残留和污染，确保了制取海马糖蛋白的活性；Sevage法脱蛋白一次并静置过夜能够有效的脱除游离蛋白质，且避免了脱蛋白次数过多导致的糖蛋白损失；乙醇分级沉淀法能够有效的将不同分子量阶段的糖 蛋白纯化出来，保证了制取糖蛋白种类的完整性；透析法能够有效的脱除盐分，并且去除了小分子杂质；糖蛋白的检测技术采取分别测定糖和蛋白质含量，通过响应面法进行糖和蛋白质得率的共同优化工艺，以达到糖蛋白的最优提取条件。在此最优提取工艺条件下，进行了三次提取验证，海马糖蛋白粗纯品的理论得率为7.037%,实际得率平均为6.977%，具有较好的重复性。【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为浸提时间对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响；
图2为浸提液中NaCl浓度对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响；
图3为浸提温度对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响；
图4为液料比对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响；
图5为纤维素DEAE-52阴离子交换柱对海马糖蛋白粗品的纯化效果。
【具体实施方式】
[0015]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016]一、实验测定方法
(I)糖蛋白中糖含量的测定
海马糖蛋白中的糖含量测定采用苯酚-硫酸法。配置0.lmg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖标准溶液，加蒸馏水补足至2mL，然后加入ImL质量分数为5%的苯酚溶液，充分振荡混匀后沿比色管壁迅速加入5mL浓硫酸，让硫酸能均匀地沿壁流下，室温下充分反应30min ;取适量反应液在20(T600nm下进行扫描，蒸懼水做空白样，确定其最大吸收波长为488nm ;在488nm处测样品吸光度,绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程y = 0.7434 x -0.0012，R2 = 0.9995，其中x为吸光度值，y为糖的质量浓度μ g/mL。样品液稀释到适当倍数，以同样的方法进行测定，根据标准曲线求得样品液中糖含量。
[0017](2)糖蛋白中蛋白质含量的测定
海马糖蛋白中的蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。将0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL的95%乙醇中，再加入IOOmL 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000mL,抽滤，棕色瓶保存备用。用牛血清配置0.lmg/mL的蛋白标准溶液，分别取O、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL蛋白质标准溶液，加蒸馏水补足至lmL，再加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀，室温下静置IOmin后于595nm处测各样品的吸光度，绘制蛋白质标准曲线，得回归方程y =
0.5932 X +0.0017，R2 = 0.9997，其中x为吸光度值，y为蛋白质的质量浓度μ g/mL。样品液稀释到适当倍数，以同样的方法进行测定，根据标准曲线求得样品液中蛋白质含量。
[0018]二、具体实施例 实施例1
一种海马活性糖蛋白的制备方法，包括以下步骤:
(1)海马前处理:将海马洗净冻好后，于-40V下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；其中CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为:载气为高纯度CO2，萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58°C、分离釜温度80°C、CO2流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取IOmin和静态萃取125min 组成；
(2)海马糖蛋白提取:将步骤(1)得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0.08mol/L的浸提液按21.41:1 (g / mL)的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先于超声功率500W的条件下进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于72.77°C下浸提4.27h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液；此条件为海马糖蛋白提取的最佳工艺参数；
(3)海马糖蛋白粗纯化:将步骤(2)得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4°C静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，分别用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品，其中Sevage法除游离蛋白的条件为:糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1, Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成；乙醇分级沉淀条件为:将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%,90%时于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
[0019]实施例2
基本同上述实施例1，其区别在于:步骤(2)中浸提液为蒸馏水(即NaCl浓度为0)，且浸提液与脱脂海马粉按照1:10 (mL/g)的比例混合于锥形瓶中，超声20min后于30°C水浴锅中热水浸提6h，最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
[0020]实施例3
基本同实施例1，其区别在于:步骤(2)中的浸提液的NaCl浓度为0.25mol/L，且浸提液与脱脂海马按照1:35 (mL/g)的比例混合于锥形瓶中，超声20min后于80°C水浴锅中热水浸提lh，最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
[0021]实施例4
基本同实施例1，其区别在于:步骤(2)中的浸提液的NaCl浓度为0.01mol/L，且浸提液与脱脂海马按照1:10 (mL/g)的比例混合于锥形瓶中，超声20min后于40°C水浴锅中热水浸提2h，最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
[0022]实施例4
基本同实施例1，其区别在于:将步骤(3)得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化，其过程具体为:取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中，过
0.45 μ m滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05,0.1,0.5mol/L NaHC03进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置，280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
[0023]三、对比试验
最佳提取条件的确定:海马前处理和提取操作如实施例1，分别对影响海马糖蛋白提取得率的浸提时间、浸提液盐浓度、浸提温度和液料比进行单因素实验。
[0024]对浸提时间进行单因素设计:设置浸提时间分别为l、2、3、4、5、6h，其他条件分别控制为浸提液盐浓度0.lmol/L、浸提温度50°C、液料比1:25 (mL/g)。结果如图1所示，由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提时间为4h。
[0025]对浸提液盐浓度进行单因素设计:配置不同NaCl浓度的浸提液，分别为0、0.05、
0.10,0.15,0.20,0.25mol/L，其他条件分别控制为浸提时间4h、浸提温度50°C、液料比l:25(mL/g)0结果如图2所示，由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提液盐浓度为0.05 mol/L0[0026]对浸提温度进行单因素设计:调节浸提温度分别为3o°c、4o°c、5(rc、6(rc、7(rc、80°C，其他条件控制:浸提时间4h、盐浓度0.05 mol/L、液料比l:25(mL/g)。结果如图3所示，由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提温度为70°C。
[0027]对液料比进行单因素设计:浸提液与海马的液料比(单位mL/g)分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，其他条件控制:浸提时间4h、盐浓度0.05mol/L、温度70°C。结果如图4所不，由图可知制备海马糖蛋白的最佳液料比为1:20 (mL/g)。
[0028]运用Design-Expert 7.0.0软件进行响应面法设计试验,在单因素实验的基础上，选择浸提时间、盐浓度、温度、液料比四个因素的较优水平进行响应面设计，设计方案及结果分析如表1、表2、表3所不。
[0029]表1海马糖蛋白提取工艺因素响应面设计表
【权利要求】
1.一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)海马前处理:将海马洗净冻好后，于-40°c下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉； (2)海马糖蛋白提取:将步骤(1)得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为O~0.25mol/L的浸提液按(10~35) g =ImL的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30°C~80°C下浸提I~6h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液； (3)海马糖蛋白粗纯化:将步骤(2)得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4°C静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液，进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品。
2.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于:步骤(1)中所述的CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为:载气为高纯度CO2，萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58 V、分离釜温度80 V、CO2流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取IOmin和静态萃取125min组成。
3.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的超声波辅助提取的条件为:超声功率500W，超声时间20min。
4.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的浸提液中NaCl浓度为0.08mol/L，所述的浸提温度为72.77°C，所述的浸提时间为4.27h，所述的脱脂海马粉与所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g:lmL。
5.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的Sevage法除游离蛋白的条件为:糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1,所述的Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成。
6.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的乙醇分级沉淀条件为:将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
7.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤(3)得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化的过程为:取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45 μ m滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05,0.1,0.5mol/L NaHC03进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
【文档编号】C07K1/34GK103923201SQ201410129587
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】徐永健, 宿宇婷, 姜展志 申请人:宁波大学