一种聚合草叶蛋白的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种聚合草叶蛋白的提取方法，先用稀碱溶液使蛋白质溶解，分离出去不溶性高分子成分。再用酸调到等电点使蛋白质沉淀下来，除去非酸沉性可溶成分，进行洗涤，调pH值至中性，经均质，冷冻干燥等工艺制备成纯度较高的蛋白质。结果表明：该方法效果较好，蛋白提取率高达63.42％。最佳提取条件是：NaOH溶液浓度为0.15mol/L，固液比为1∶40，浸提时间为100min，浸提温度为60℃，提取率达63.42％。同时调节pH值在2.55～3.51之间沉淀聚合草中粗蛋白的效果最佳。
【专利说明】一种聚合草叶蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业【技术领域】，涉及一种聚合草叶蛋白的提取方法。
【背景技术】
[0002]叶蛋白是从绿色植物的新鲜茎叶直接提取出来的蛋白质制品，是一种无毒无害的天然高级营养品，其产品的蛋白质含量在50% -80%之间。叶蛋白富含18中氨基酸，其中8种人体必需氨基酸的含量较高，是优良的蛋白质饲料，国内外大量动物饲喂实验结果表明，叶蛋白完全可以代替豆柏和鱼粉。此外，叶蛋白的制品中叶黄素的含量高达1000mg/kg-1300mg/kgo而叶黄素是禽、肉、皮、蛋黄的天然着色剂,在养禽业生产中意义重大。在国际市场上，叶蛋白中叶黄素的价格比叶蛋白中蛋白质的价格高出50%。叶蛋白制品还含有糖、脂肪、多种维生素、胡萝卜素、及铁、镁、钙、锌、铜等矿物质元素，这些营养成分具有防病、治病、强身健体、防衰老等多种生理功能，是优良的添加剂。叶蛋白进入膳食结构后，将会降低胆固醇对身体的危害，符合食物结构回归大自然的发展趋势。无论对于饲料，还是对于食品或药品都有极其广阔的市场于效益空间，是一个极具开发价值的新兴产业。
[0003]聚合草产量大，易于存活和栽培，成本低廉，又称神奇草，还有许多生物学功能，可以用于治疗皮肤病、胃溃疡、便秘综合症、呼吸系统疾病等疾病，富含蛋白质，经氨基酸组分分析，聚合草蛋白质由18种氨基酸组成。其中，必需氨基酸8种，非必需氨基酸10种，氨基酸种类齐全，且必需氨基酸占总氨基酸含量的39.5%，高于淮山药蛋白。具有很高的营养价值，是制备植物叶蛋白的优良植物原料，也是制备生物活性肽的良好蛋白来源。现有技术中关于聚合草叶蛋白的提取方法尚未发现有关报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种聚合草叶蛋白的提取方法，将对本地产的聚合草的基本营养成分进行测定，然后采用“碱溶酸沉”原理，通过对影响蛋白质提取率的料液比、浸提温度、浸提时间及浸提液PH值进行单因素试验，采用L9(34)正交试验对聚合草叶蛋白的提取工艺条件进行优选，并对聚合草蛋白的氨基酸组成进行分析和氨基酸评分，以便为聚合草的深度和综合开发利用提供数据支持，并为聚合草生物活性肽的制备奠定基础。其具体技术方案为:
[0005]一种聚合草叶蛋白的提取方法，包括以下步骤:
[0006](I);试验选取聚合草的茎和叶，用蒸馏水进行清洗，洗涤后经37°C恒温烘干，经研磨进行粉碎；
[0007](2)按照固液比为I: 40 (g/mL)比加入浓度为0.1~0.15mol/L的NaOH溶液在为60°C下浸提IOOmin ；
[0008](3)在5000r/min下低温离心，离心后取上清液调ρΗ2.55~3.51之间，至聚合草蛋白质等电点进行蛋白质沉淀，再次在5000r/min下低温离心取沉淀，沉淀经低温冷冻干燥得蛋白质。[0009]优选地，所述pH值应控制在2.55~3.51之间。
[0010]优选地，所述NaOH溶液浓0.1~0.15mol/L。
[0011]优选地，所述聚合草粗蛋白的固液比为1: 40(g/mL)。
[0012]优选地，所述聚合草粗蛋白的浸提温度为60°C。
[0013]优选地，所述聚合草粗蛋白的浸提时间为lOOmin。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0015]聚合草是优良的叶蛋白和膳食纤维提取原料，可作优质蛋白源，传统的“碱溶酸沉”法提取聚合草叶蛋白，设备、工艺简单可行，适应工业化生产的需求。
【专利附图】
【附图说明】[0016]图1为定氮蒸馏装置图。
[0017]图2为聚合草粗蛋白等电点的确定。
[0018]图3为NaOH溶液浓度对粗蛋白提取率的影响。
[0019]图4为固液比对粗蛋白提取率的影响。
[0020]图5为浸提温度对粗蛋白提取率的影响。
[0021]图6为浸提时间对粗蛋白提取率的影响。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0023]材料与方法
[0024]材料
[0025]聚合草采自山西农业大学家属院，将鲜草洗净，经60°C恒温箱烘干后粉碎。
[0026]主要仪器与设备
[0027]酸度计(PHS-3C)，上海虹益仪器仪表有限公司；旋涡震荡仪，上海精科实业有限公司；冰箱(BCD-183)，中国重庆五洲实业公司；台式高速冷冻离心机，上海力中科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅(HH-4)，金坛市科析仪器有限公司；可见风光光度计(WFJ2100)，龙尼柯(上海)仪器有限公司；电子天平(BS224S)，北京赛多利斯仪器系统有限公司；以及凯式定氮装置、氨基酸自动分析仪、真空泵、马福炉、索氏提取器、恒温干燥箱，DF205电热鼓风干燥箱等仪器设备。
[0028]主要生化试剂和溶液配置
[0029]试剂
[0030]本研究所使用的试剂均为分析纯，主要有盐酸、氢氧化钠、氯化钠、乙醇(95% )、磷酸、考马氏亮蓝G-250、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、无水乙醚、石油醚、丙酮、重铬酸钾、蛋白酶、苯酚、柠檬酸钠、茚三酮、乙酸锂、二甲基亚铜、TRIS (三羟甲基氨基甲烷)、MES:2-(N-吗啉代)乙烷磺酸等。
[0031]溶液
[0032]热稳定α -淀粉酶溶液:于0°C _5°C冰箱储存；
[0033]蛋白酶:用MES-TRIS缓冲液配成浓度为50mg/ml的蛋白酶溶液，现用现配，于0°C -5°c储存；[0034]淀粉葡萄糖苷酶溶液:于0°C _5°C储存；
[0035]酸洗娃藻土:取200g娃藻土于600ml的2mol/L盐酸中，浸泡过夜,过滤,用蒸懼水洗至滤液为中性，置于525°C ±5°C马福炉中灼烧灰分后备用；
[0036]0.05mol/L MES-TRIS 缓冲液:称取 19.52gMES 和 12.2gTRIS,用 1.7L 蒸馏水溶解，用6mol/L氢氧化钠调PH至8.2，加水稀释至2L ；
[0037]3mol/L乙酸溶液:取172ml乙酸，加入700ml水，混匀后用水定容至IL ；
[0038]0.4g/L溴甲酚绿溶液:称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加入1.4ml0.lmol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
[0039]考马斯亮兰G-250蛋白显色液:称IOOmg考马斯亮兰G-250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至I升。
[0040]方法
[0041]聚合草干叶中蛋白质含量的测定
[0042]参照GB5009.5-2010第一法凯氏定氮法测定[12]。其原理为食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
[0043]试样处理
[0044]称取充分混匀的聚合草干叶0.2g~2g(约相当于30mg~40mg氮)，精确至
0.0Olg,移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h~lh。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入IOOmL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
[0045]测定
[0046]按图1装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液及I滴~2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL~10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以IOmL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏IOmin后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏lmin。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，PH5.4 ;1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，PH5.1。同时作试剂空白。
[0047]结果计算
[0048]聚合草干叶中的蛋白质的含量按式(I)进行计算。
[0049]
【权利要求】
1.一种聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: (1);试验选取聚合草的茎和叶，用蒸馏水进行清洗，洗涤后经37°c恒温烘干，经研磨进行粉碎； (2)按照固液比为1: 40(g/mL)比加入浓度为0.1~0.15mol/L的NaOH溶液在为60°C下浸提 IOOmin ； (3)在5000r/min下低温离心，离心后取上清液调pH2.55~3.51之间，至聚合草蛋白质等电点进行蛋白质沉淀，再次在5000r/min下低温离心取沉淀，沉淀经低温冷冻干燥得蛋白质。
2.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述pH值应控制在2.55~3.51之间。
3.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述NaOH溶液浓0.1 ~0.15mol/L。
4.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的固液比为1: 40(g/mL)。
5.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的浸提温度为60°C。
6.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的浸提时间为IOOmin 。
【文档编号】C07K14/415GK103897049SQ201410153957
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】李宝霞, 霍乃蕊, 董双涛, 宋金玉, 杜月连, 刘精婵, 贾文雅 申请人:李宝霞