一种从鳀鱼中分离的活性多肽的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种从鳀鱼发酵液中分离的活性多肽，本发明得到的抗神经细胞损伤多肽分子量为2,181Da；由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，是一种新型的具有活性活性的多肽。本发明获得的多肽在谷氨酸盐对神经细胞损伤模型中，本发明的活性多肽的加入可以显著提高PC12神经细胞的存活率，在终浓度为50μg/mL时，细胞存活率与损伤组比较提高了26.4％，有效地减轻了谷氨酸盐诱导的神经细胞损伤。另外，对其神经细胞保护作用的细胞机理研究发现，活性多肽的加入显著增加了胞内的总抗氧化能力，且对SOD活力的增加有一定促进作用。
【专利说明】一种从鍉鱼中分离的活性多肽
【技术领域】
[0001]本发明属于多肽分离【技术领域】，具体涉及一种从鍉鱼中分离的活性多肽，具有抗神经细胞损伤的功能。
【背景技术】
[0002]鍉鱼广泛分布于太平洋西北部、新西兰、澳大利亚、印度洋、非洲东岸及南非沿岸等南北半球的温带水域，是世界上单一渔业品种产量最高的鱼种，系集群性小型中上层鱼类，资源丰富。由于鍉鱼富含脂肪、酶活高、易被氧化而腐烂变质，因此不能长期储存，我国俗称“离水烂”。我国东海、黄海和渤海均产之，资源丰富，年渔获量可达几十万吨。长期以来由于对其利用价值认识不足，未被大规模的开发利用。而随着人们生活水平的提高，鍉鱼很少直接食用，大多仅被简单加工成养殖用的饲料、鱼糜；而且在加工过程中会产生大量鍉鱼副产物，这些副产物如果随意丢弃而不加以利用会带来极大的环境污染及资源浪费。鍉鱼有很高的营养价值，含有8种人体必须氨基酸、不饱和脂肪酸和牛磺酸，另外还富含维生素A、E等。此外，鍉鱼及其加工副产物作为一种重要的海洋蛋白资源，在氨基酸组成和序列上与陆地生物蛋白资源有很大差异，且在种类和数量上都远远大于陆地及淡水蛋白资源，然而这些资源并未得到充分利用。如果能将其进一步开发和利用，将大幅提高鍉鱼及其副产物的附加值，为充分利用这一海洋资源开辟新的途径。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种从鍉鱼发酵液中分离的活性多肽，从而弥补现有技术的不足。
[0004]本发明的活性多肽，是从鍉鱼中分离的，其制备方法包括如下的步骤:
[0005]I)将鍉鱼浓缩液加入2~6倍体积的水后，再加入鍉鱼浓缩液重量I~8%的蛋白酶，在40~70°C下酶解2~24h制成酶解液；
[0006]其中鍉鱼浓缩液将鍉鱼或鍉鱼加工的副产物粉碎，过滤除去杂质后，滤液在80~100°C加热0.5~IOh至粘稠半固态状得到的；
[0007]2)在步骤I)的酶解液中加入鍉鱼酶解液重量I %~10%的麸皮，灭菌后接入米曲霉发酵3~7d获得发酵液；
[0008]3)将步骤2)制备的发酵液过滤，滤液灭菌后得到鍉鱼发酵母液成品；
[0009]4)将步骤3)得到的鍉鱼发酵母液成品进行冷冻干燥成干粉后，再用超纯水溶解，溶解液通过滤膜过滤后，滤液用葡聚糖G-15进行分离，上样量为0.2~2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.2~2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱27~30min的洗脱液；
[0010]5)将步骤4)得到的洗脱液浓缩后用DEAE-S印harose FF离子交换柱层析进行分离纯化:浓缩后的样品上ρΗ7.5~8.5的5mM Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-S印harose FF离子交换柱，采用浓度为2mol/L NaCl梯度洗脱，流速为0.2~2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱3~6min的洗脱液；[0011]6)将步骤5)得到的组份进一步过SB-C18半制备柱，柱温25°C，上样量20~100 μ L，紫外波长220nm，流速0.5~2mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1~I %的三氟乙酸；分管收集12~13.5min的洗脱液，干燥后即为分离的抗神经细胞损伤活性多肽。
[0012] 本发明得到的抗神经细胞损伤多肽分子量为2，ISlDa0
[0013]上述方法制备的活性多肽，用4.6 X 250nm的XDB-C18分析柱测定分离多肽的纯度；流速为0.5~2mL/min，其中流动相A为甲醇，流动相B为水。
[0014]上述的蛋白酶包括各种来源的蛋白酶:植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶等)；以及各种条件的蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等)以及各种蛋白酶按照一定比例复配得到的复合蛋白酶(风味蛋白酶等)。
[0015]本发明的活性多肽分子量为2，181Da，由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，是一种新型的具有活性活性的多肽。本发明获得的多肽在谷氨酸盐对神经细胞损伤模型中，本发明的活性多肽的加入可以显著提高PC12神经细胞的存活率，在终浓度为50 μ g/mL时，细胞存活率与损伤组比较提高了 26.4%，有效地减轻了谷氨酸盐诱导的神经细胞损伤。另外，对其神经细胞保护作用的细胞机理研究发现，活性多肽的加入显著增加了胞内的总抗氧化能力，且对SOD活力的增加有一定促进作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:G_15凝胶柱层析洗脱图谱；
[0017]图2 =P2洗脱峰获得的多肽的DEAE-S印harose FF离子交换柱色谱图；
[0018]图3:峰A获得的多肽的反相高效液相色谱图；
[0019]图4:f3洗脱峰获得的多肽的纯度鉴定图谱；
[0020]图5:f3洗脱峰的一级和二级质谱图；
[0021]图6:f3洗脱峰获得的多肽对谷氨酸盐诱导的PC12细胞损伤的影响图；
[0022]图7:培养细胞形态学图片。
【具体实施方式】
[0023]本发明的活性多肽是把鍉鱼浓缩液进行酶解，加入麸皮后灭菌，接入米曲霉后发酵后，再依次经过G-15凝胶色谱柱、DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱柱以及SB-C18半制备柱分离纯化制得的，制备过程以抗神经细胞损伤活性的筛选为指标，制备步骤如下
[0024]I)将鍉鱼浓缩液加入鍉鱼浓缩液体积2~6倍的水后，同时加入鍉鱼浓缩液重量I~8%的蛋白酶，在40~70°C下酶解2~24h，温度升至85~100°C，加热5~20min使酶失活。
[0025]2)把步骤I制得的鍉鱼酶解液加入鍉鱼酶解液重量的I %~10%的麸皮，121 °C灭菌20min,冷却至室温后接入米曲霉发酵3~7d。
[0026]3)把步骤2得到的发酵液用纱布过滤、100°C灭菌20min后得到鍉鱼发酵母液成
品O
[0027]4)将步骤3得到的鍉鱼发酵母液成品用冷冻干燥机进行浓缩后，过膜后的样品首先用葡聚糖G-15进行分离，上样量为0.2~2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.2~2mL/min，检测波长为220nm，分管收集吸光值大于0.1且具有抗神经细胞损伤活性的组分。
[0028]抗神经细胞损伤活性的测定方法为:将PC12细胞按每孔5X103个左右接种于96孔板，当细胞生长汇合率达到70~80%时，用含8%胎牛血清DMEM培养液换液，加入收集的多肽样品，每个浓度设定3个平行，培养3h后，每孔加入最佳成模浓度的谷氨酸盐(lOmmol/L)，继续培养24h。另设空白、模型(损伤)组。用结晶紫染色法测定其吸光值。设定空白组的平均吸光度值为100%，其余组与之比较即得细胞存活率(细胞的存活率与其吸光度值呈正比)，细胞存活率大于模型(损伤)组的即为有抗神经细胞损伤活性的组分。
[0029]5)将步骤4得到的具有最高抗神经细胞损伤活性组份浓缩后进一步用DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析进行分离纯化。浓缩后的样品上5mM Tris-HClpH7.5~8.5缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF离子交换柱(18X80mm)，米用浓度为O~2mol/L NaCl梯度洗脱，流速为0.2~2mL/min，检测波长为220nm，分管收集吸光值大于0.1且具有抗神经细胞损伤活性的组分。
[0030]6)将步骤5得到的具有最高抗神经细胞损伤活性的组分进一步过SB-C18 (9.4 X 250mm)半制备柱，柱温25°C，上样量20~100 μ L，紫外波长220nm，流速0.5~2mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1~I %的三氟乙酸，按照一定的洗脱程序进行洗脱。
[0031]对步骤6得到的具有最高抗神经细胞损伤活性的组分用XDB-C18分析柱(4.6 X 250nm)进行纯化；流速为0.5~2mL/min，流动相A为甲醇，流动相B为水，洗脱至纯度达到95%以上。
[0032]步骤I中的蛋白酶包括各种来源的蛋白酶:植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶等)；以及各种条件的蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等)以及各种蛋白酶按照一定比例复配得到的复合蛋白酶(风味蛋白酶等)。
[0033]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0034]实施例1鍉鱼发酵母液的制备
[0035]将鍉鱼副产物用绞碎机绞碎后进行粗滤除杂，然后在80°C加热2h至粘稠半固态状得到鍉鱼浓缩液；将鍉鱼浓缩液按照(1:3，w/w)的比例加入水，混匀后加入鍉鱼浓缩液重量3%的风味蛋白酶，60°C酶解5h，得到鍉鱼酶解液。将得到的鍉鱼酶解液中加入酶解液重量5%的麸皮，121°C灭菌20min，接入米曲霉，30°C发酵，发酵周期为3d。发酵结束后将得到的发酵液用纱布过滤，100°C灭菌20min，得到鍉鱼发酵母液成品。
[0036]对鍉鱼发酵母液及发酵前的酶解液理化指标进行了测定，测定结果见表1:
[0037]表1:鍉鱼发酵前后各项指标的测定
[0038]
【权利要求】
1.一种活性多肽，其特征在于，所述的活性多肽的制备方法包括如下的步骤: 1)将鍉鱼浓缩液加入2~6倍体积的水后，再加入鍉鱼浓缩液重量I~8%的蛋白酶，在40~70°C下酶解2~24h制成酶解液； 2)在步骤I)的酶解液中加入鍉鱼酶解液重量1%~10%的麸皮，灭菌后接入米曲霉发酵3~7d获得发酵液； 3)将步骤2)制备的发酵液过滤，滤液灭菌后得到鍉鱼发酵母液成品； 4)将步骤3)得到的鍉鱼发酵母液成品进行冷冻干燥成干粉后，再用超纯水溶解，溶解液通过滤膜过滤后，滤液用葡聚糖G-15进行分离,上样量为0.2~2mL,以蒸懼水为洗脱液，流速为0.2~2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱27~30min的洗脱液； 5)将步骤4)得到的洗脱液浓缩后用DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析进行分离纯化:浓缩后的样品上ρΗ7.5~8.5的5mM Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-S印harose FF离子交换柱，采用浓度为2mol/L NaCl梯度洗脱，流速为0.2~2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱3~6min的洗脱液； 6)将步骤5)得到的洗脱液组份过SB-C18半制备柱，柱温25°C，上样量20~100μ L，紫外波长220nm，流速0.5~2mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1~1 %的三氟乙酸；分管收集12~13.5min的洗脱液，干燥后即为活性多肽。
2.如权利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的步骤1)中鍉鱼浓缩液是将鍉鱼或鍉鱼加工的副产物粉碎，过滤除去杂质后，滤液在80~100°C加热0.5~1Oh至粘稠半固态状得到的。
3.如权利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的步骤1)中的蛋白酶为植物蛋白酶、动物蛋白酶、微生物蛋白酶中的任一种或几种。
4.如权利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的植物蛋白酶为木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。
5.如权利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的动物蛋白酶为胃蛋白酶和/或胰蛋白酶。
6.如权利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的微生物蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶和/或链霉囷蛋白酶。
7.如权利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的多肽分子量为2，ISlDa0
8.权利要求1所述的活性多肽的纯度测定方法，其特征在于，所述的测定方法是将活性多肽用4.6X250nm的XDB-C18分析柱测定纯度；其流速为0.5~2mL/min，其中流动相A为甲醇，流动相B为水。
9.权利要求1所述的活性多肽在制备抗神经细胞损伤制品中的应用。
10.一种抗神经细胞损伤制品，其特征在于，所述的制品包含有药理有效浓度的权利要求I所述的活性多肽。
【文档编号】C07K1/18GK103937864SQ201410173125
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月26日 优先权日:2014年4月26日
【发明者】毛相朝, 于小航, 薛长湖 申请人:中国海洋大学