一种徳舍瑞林的合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种徳舍瑞林的合成方法，属于化学制药【技术领域】。本发明以2-氯三苯甲基氯树脂为原料，在碱性条件下与芴甲氧羰基保护脯氨酸的羧基相连，得到芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂，再通过接肽反应依次接入徳舍瑞林剩余氨基酸，用全保护切割试剂裂解获得全保护9肽片段，再通过乙胺化获得全保护徳舍瑞林片段，最后裂解全保护徳舍瑞林片段获得徳舍瑞林粗品。本发明通过固液结合合成德舍瑞林，收率可达84.1％。同时，避免了纯固相合成从树脂上切割不安全，不方便，缩短了合成时间，简化了纯液相片段合成的繁琐，使生产成本大大降低，适于产业化推广。
【专利说明】一种徳舍瑞林的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种徳舍瑞林的合成方法，属于化学制药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]德舍瑞林又称LHRH-Hydrogel implant, RL0903,分子式是=C64H83N17O12,分子量是:1282.47，结构式如图1所示。德舍瑞林是一种人工合成的九肽，用于治疗中枢性性早熟症。
[0003]德舍瑞林是一种促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂，美国学者Shore等报告，对于晚期前列腺癌患者，每年一次给予德舍瑞林长效埋植剂皮下埋植，能长期稳定地抑制睾酮，使其保持去势水平。
[0004]现有的合成方法均存在着一定的缺点，每一次脱保护均需用三氟乙酸，故三废污染多，接肽收率低，生产成本高，限制了德舍瑞林的大规模生产和应用。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术中徳舍瑞林合成接肽收率低,三废污染多的技术问题,本发明提供了一种徳舍瑞林的合成方法，采取的技术方案如下:
[0006]一种徳舍瑞林合成的方法，是以2-氯三苯甲基氯树脂为原料，在碱性条件下与芴甲氧羰基保护脯氨酸的羧基相连，得到芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂，再通过接肽反应依次接入徳舍瑞林剩余氨基酸，用全保护切割试剂裂解获得全保护9肽片段，再通过乙胺化获得全保护徳舍瑞林片段，最后裂解全保护徳舍瑞林片段获得徳舍瑞林粗品O
[0007]所述方法的步骤如下:
[0008]I)制备芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂；
[0009]2)在步骤I)所得的芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂上依次接入徳舍瑞林的剩余氣基酸，获得9妝树脂；
[0010]3)用全保护切割试剂裂解步骤2)所得的9肽树脂，获得全保护9肽片段；
[0011]4)乙胺化步骤3)所得全保护9肽片段，获得全保护徳舍瑞林片段；
[0012]5)裂解步骤4)所得全保护徳舍瑞林片段，获得徳舍瑞林粗品。
[0013]所述方法步骤I)所述制备芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂，具体为用二氯甲烷浸泡2氯三苯甲基氯树脂，充分溶胀后吹干，加入接肽试剂溶解的芴甲氧羰基保护脯氨酸，反应后吹干，再分别用N，N- 二甲基甲酰胺和甲醇洗涤吹干，获得芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氯树脂；
[0014]所述接肽试剂是由N，N- 二异丙基乙胺、N，N- 二甲基甲酰胺按体积比=1:15混合得到，2-氯三苯甲基氯树脂的体积浓度为5-20ml/g，参与反应的芴甲氧羰基保护脯氨酸摩尔数为2-氯三苯甲基氯树脂的1.5-2倍。
[0015]方法2)所述中依次接入徳舍瑞林的剩余氨基酸，具体为按照徳舍瑞林9肽序列，从脯氨酸端依次接入除脯氨酸以外的剩余8个氨基酸:精氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、组氨酸和焦谷氨酸，每次接入氨基酸均经过脱保护反应和接肽反应。
[0016]所述方法中脱保护反应的条件为:脱保护剂为哌啶、N, N- 二甲基甲酰胺按体积比=1:4混合，脱保护剂相对于被接肽树脂的添加量为5-20ml/g树脂，反应温度为20_25°C，反应时间为5-15min ；
[0017]所述接肽反应的条件为:接肽试剂为N，N- 二异丙基乙胺和N，N- 二甲基甲酰胺按体积比=1:15混合，被接物体积浓度为5-20ml/g，接入物摩尔数为被接物的2_3倍，反应温度为20-25°C，反应时间为1-1.5h。
[0018]方法3)所述用全保护切割试剂裂解，具体为向步骤2)所得的9肽树脂中加入按体积比1:99混合的三氟乙酸和二氯甲烷，反应1-3小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得全保护的9肽片段。
[0019]方法4)所述的乙胺化，具体为将1-羟基苯并三唑加入到方法3)所得的全保护9肽片段中，再加入二异丙基碳二亚胺，20-25°C下反应24小时后减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段。
[0020]方法5)所述的裂解全保护的德舍瑞林片段，具体为将步骤4)所得的全保护的德舍瑞林片段加入预冷至0-10°C的切肽试剂中，反应2-3小时，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得德舍瑞林粗品。
[0021]所述切肽试剂是三氟乙酸、三异丙基硅烷和水按体积比95:2.5:2.5组成的混合物。 [0022]所述合成方法的具体步骤如下:
[0023]I)取150g2_氯三苯甲基氯树脂，用1000ml 二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀，再取91.1g芴甲氧羰基保护脯氨酸，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，20-25°C反应1.5小时后吹干，分别用N，N- 二甲基甲酰胺和甲醇洗涤吹干，获得芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氯树脂；
[0024]2)以步骤I)所述的芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氯树脂为被接物，按照徳舍瑞林9肽序列，从脯氨酸端依次接入精氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、组氨酸和焦谷氨酸；
[0025]每次接入前，向被接物中加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤3次，吹干，再取540mmol接入物，用173.4g 0_(苯并三唑-1-氧)-N, N, N, N-四甲基脲鎗六氟硼酸盐，72.9gl-羟基苯并三唑，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，20-25°C反应1.5h，吹干后再分别用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤3次，吹干，接完焦谷氨酸后获得9肽树脂；
[0026]3)将512.3g步骤2)所的9肽树脂转移至5000ml的容器中，加入3500ml预先配制好的体积比为1:99的三氟乙酸和二氯甲烷中反应2.5小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得361.2g全保护的9肽片段；
[0027]4)将26.1gl-羟基苯并三唑和27.2g乙胺盐酸盐加入到512.3g步骤3)所得全保护的9肽片段中，再加入39ml 二异丙基碳二亚胺，20-25°C下反应24h，减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段；
[0028]5)向步骤4)所得的全保护的德舍瑞林片段中加入到3500ml预冷至0_10°C的切肽试剂，反应2-3小时，加入1000Oml乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得德舍瑞林粗品。
[0029]本发明的有益效果是:通过固液结合合成德舍瑞林，避免了纯固相合成从树脂上切割不安全，不方便，缩短了合成时间，简化了纯液相片段合成的繁琐，使生产成本大大降低，提高了市场竞争力。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为徳舍瑞林的结构式。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0032]实施例1
[0033]1.制备 Fmoc-Pro-CTC 树脂
[0034]Fmoc-Pro-CTC树脂的制备，按照以下步骤进行:
[0035]I).取 Ig CTC树脂(Loading: 1.2mmol/g, 1.2mmol)，用 15ml DCM浸泡，使树脂充分溶胀；
[0036]2).取0.607g Fmoc-Pro-OH(FW:337.4，1.8mmol)，用 15ml 接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小 时；
[0037]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0038]2.徳舍瑞林氨基酸的连接
[0039]2.1 制备 Fmoc-Arg (pbf)-Pro-CTC 树脂
[0040]I).加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干，
[0041]2)取 2.4gFmoc-Arg(pbf)-OH(FW:648.8，3.6mmol), 1.2gTBTU(FW:321，3.6mmol)，
0.5gH0BT (Fff: 135，3.6mmol)，用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5h，
[0042]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0043]2.2 制备 Fmoc-Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0044]I).加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0045]2).取 1.27g Fmoc-Leu-OH(FW:353.4，3.6mmol)，1.2gTBTU(FW:321，
3.6mmol)，0.5gH0BT (Fff: 135，3.6mmol)用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0046]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0047]2.3 制备 Fmoc-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0048]I)加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0049]2)取 1.68gFmoc-D-His (Bzl)-OH(Fff:467, 3.6mmol) , 1.2gTBTU (Fff: 321,
3.6mmol)，0.5gH0BT (Fff: 135，3.6mmol)，用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0050]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。[0051 ] 2.4 制备 Fmoc-Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0052]I)加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干;
[0053]2)取 1.65gFmoc-Tyr(tbu)-OH(FW:459，3.6mmol), 1.2gTBTU(FW:321，3.6mmol)，
0.5gH0BT (Fff: 135，3.6mmol)，用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0054]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0055]2.5 制备 Fmoc-Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂 [0056]I)加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0057]2)取 1.38gFmoc-Ser (tbu)-OH (Fff:383.4,3.6mmol), 1.2gTBTU (Fff: 321,
3.6mmol)，0.5gH0BT (Fff: 135，3.6mmol)，用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0058]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0059]2.6 制备 Fmoc-Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC树脂
[0060]I)加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0061]2)取 1.9gFmoc-Trp (Boc)-OH (FW: 526.5,3.6mmol), 1.2gTBTU (Fff: 321,
3.6mmol)，0.5gH0BT (Fff: 135，3.6mmol)，用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0062]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0063]2.7 制备 Fmoc-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0064]I)加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0065]2)取 2.23gFmoc-His(Trt)-OH(Fff:619.7,3.6mmol), 1.2gTBTU (Fff: 321,
3.6mmol)，0.5gH0BT (Fff: 135，3.6mmol)，用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0066]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0067]2.8 制备 Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0068]I)加15ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0069]2)取 0.46g Pyr (Fff: 129, 3.6mmol), 1.2gTBTU (Fff: 321, 3.6mmol)，0.5gHOBT (Fff: 135，3.6mmol)，用15ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0070]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0071]3.全保护切割:
[0072]将3.5g Pyr-His(Trt) -Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf) -Pro-CTC树脂转移至50ml的容器中，加入预先配制好的溶剂TFA和DCM (体积比1/99) 30ml室温搅拌2.5小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得2.5g全保护的Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro 片段。
[0073]4.乙胺化
[0074]0.2g HOBT, 0.2g 乙胺盐酸盐加入 2.5g 全保护的 Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro 片段中，再加入 DIC0.3ml,室温反应过夜(24小时)，减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段。
[0075]5.裂解全保护德舍瑞林片段
[0076]全保护德舍瑞林片段中加入预冷至0-10°C的切肽试剂(TFA/TIS/H20体积比为95:2.5:2.5) 30ml，反应2_3小时，加入120ml乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得1.1g(8.3mmol)德舍瑞林粗品，收率70.2%。
[0077]实施例2
[0078]1.制备 Fmoc-Pro-CTC 树脂
[0079]Fmoc-PiO-CTC树脂的制备按照如下步骤进行:
[0080]I).取 IOg CTC 树脂(Loading: 1.2mmol/g, 12mmol)，用 100mL DCM 浸泡，使树脂充分溶胀；
[0081]2).取 6.1g Fmoc-Pro-OH(Fff:337.4, 18mmol)，用 100mL 接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0082]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0083]2.徳舍瑞林氨基酸的连接
[0084]2.1 制备 Fmoc-Arg (pbf)-Pro-CTC 树脂
[0085]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0086]2)取 23.3gFmoc-Arg(pbf)-OH(FW:648.8，36mmol), 11.6gTBTU(FW:321，36mmol)，
4.8H0BT(FW:135，36mmol，用100mL接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5h ；
[0087]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0088]2.2 制备 Fmoc-Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0089]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0090]2)取 12.7g Fmoc-Leu-OH(FW:353.4，36mmol)，11.6gTBTU(FW:321，36mmol)，
4.8gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用100mL接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0091]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0092]2.3 制备 Fmoc-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0093]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0094]2)取 16.8gFmoc-D-Trp(Boc)-OH(FW:467，36mmol)，11.6gTBTU(FW:321，36mmol)，
4.8gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用100mL接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0095]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0096]2.4 制备 Fmoc-Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0097]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0098]2)取 16.5gFmoc-Tyr(tbu)-OH(FW:459，36mmol), 11.6gTBTU(FW:321，36mmol)，
4.8gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用100ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0099]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0100]2.5 制备 Fmoc-Ser (tbu)-Tyr (tbu)-D-Trp (Boc)-Leu-Arg (pbf)-Pro-CTC 树脂
[0101]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0102]2)取 13.8gFmoc-Ser(tbu)-OH(Fff:383.4,36mmol), 11.6gTBTU(Fff:321,36mmol),
4.8gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用100mL接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0103]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0104]2.6 制备 Fmoc-Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC树脂
[0105]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干； [0106]2)取 18.9gFmoc-Trp(Boc)-OH(FW:526.5，36mmol), 11.6gTBTU(FW:321，36mmol)，
4.8gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用100mL接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0107]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0108]2.7 制备 Fmoc-His (Trt)-Trp (Boc)-Ser (tbu)-Tyr (tbu)-D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-CTC 树脂
[0109]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0110]2)取 22.3gFmoc-His(Trt)-OH(FW:619.7，36mmol), 11.6gTBTU(FW:321，36mmol)，
4.8gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用100mL接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0111]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0112]2.8 制备 Pyr-His (Trt)-Trp (Boc)-Ser (tbu)-Tyr (tbu)-D-Trp (Boc)-Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0113]I)加100mL脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0114]2)取 4.6gPyr (Fff: 129，36mmol), 11.6gTBTU (FW: 321，36mmol)，4.8g HOBT (Fff: 135，36mmol)，用100mL接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0115]3.)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0116]3.全保护切割
[0117]将34.5g Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-CTC树脂转移至500ml的容器中，加入预先配制好的溶剂TFA和DCM(体积比1/99) 350ml室温搅拌2.5小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得24.5g全保护的Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro 片段。
[0118]4.乙胺化
[0119]1.7g Η0ΒΤ, 1.8g 乙胺盐酸盐加入 24.5g全保护的 Pyr-His (Trt)-Trp (Boc)-Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro 片段中，再加入 DIC2.5ml,室温反应过夜(24小时)，减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段。
[0120]5.裂解全保护德舍瑞林片段:
[0121]全保护德舍瑞林片段中加入预冷至0-10°C的切肽试剂(TFA/TIS/H20体积比为95:2.5:2.5) 350ml，反应2_3小时，加入1000ml乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得12g(9mmol)德舍瑞林粗品，收率75%。
[0122]实施例3
[0123]1.制备 Fmoc-Pro-CTC 树脂
[0124]Fmoc-Pro-CTC树脂的制备按照如下步骤进行:
[0125]I).取 150g CTC树脂(Loading: 1.2mmol/g, 180mmol)，用 1000ml DCM浸泡，使树脂充分溶胀；
[0126]2).取 91.1g Fmoc-Pro-OH(FW: 337.4，270mmol)，用 1000ml 接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0127]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0128]2.徳舍瑞林氨基酸的连接
[0129]2.1 制备 Fmoc-Arg (pbf)-Pro-CTC 树脂
[0130]I).加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0131]2)取 350.1gFmoc-Arg (pbf)-OH (FW: 648.8，540mmol), 173.4gTBTU(FW: 321，540mmol)，72.9H0BT (Fff: 135，540mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5h ；
[0132]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0133]2.2 制备 Fmoc-Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0134]I).加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0135]2)取 190.8g Fmoc-Leu-OH(FW:353.4，540mmol)，173.4gTBTU(FW:321，540mmol)，72.9gH0BT (Fff: 135，540mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0136]3)吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0137]2.3 制备 Fmoc-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0138]I)加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0139]2)取 252.1gFmoc-D-Trp (Boc)-OH (FW: 467，540mmol)，173.4gTBTU(FW: 321，36mmol)，72.9gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0140]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0141]2.4 制备 Fmoc-Tyr (tbu)-D-Trp (Boc)-Leu-Arg (pbf)-Pro-CTC 树脂
[0142]I)加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0143]2)取 247.8gFmoc-Tyr(tbu)-OH(FW:459，540mmol), 173.4gTBTU(FW:321，540mmol)，72.9gH0BT (Fff: 135，540mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0144]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0145]2.5 制备 Fmoc-Ser (tbu)-Tyr (tbu)-D-Trp (Boc)-Leu-Arg (pbf)-Pro-CTC 树脂
[0146]I)加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0147]2)取 207gFmoc-Ser(tbu)-OH(FW:383.4，540mmol), 173.4gTBTU(FW:321，540mmol)，72.9gH0BT (Fff: 135，540mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0148]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0149]2.6 制备 Fmoc-Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC树脂
[0150]I)加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0151]2)取 284.3gFmoc-Trp(Boc)-OH(FW:526.5，540mmol), 173.4gTBTU(FW:321，540mmol)，72.9gH0B T (Fff: 135，540mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0152]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0153]2.7 制备 Fmoc-His (Trt)-Trp (Boc)-Ser (tbu)-Tyr (tbu)-D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-CTC 树脂
[0154]I)加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0155]2)取 334.6gFmoc-His(Trt)-OH(FW:619.7，540mmol), 173.4gTBTU(FW:321，540mmol)，72.9gH0BT (Fff: 135，540mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应
1.5小时；
[0156]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0157]2.8 制备 Pyr-His (Trt)-Trp (Boc)-Ser (tbu)-Tyr (tbu)-D-Trp (Boc)-Leu-Arg (pbf) -Pro-CTC 树脂
[0158]I)加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干；
[0159]2)取 69gPyr (FW: 129，540mmol)，173.4gTBTU (FW: 321，36mmol)，72.9gH0BT (Fff: 135，36mmol)，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，室温反应1.5小时；
[0160]3).吹干，分别用DMF和甲醇洗涤3次，吹干。
[0161]3.全保护切割
[0162]将512.3g Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-CTC树脂转移至5000ml的容器中，加入预先配制好的溶剂TFA和DCM(体积比1/99) 3500ml室温搅拌2.5小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得361.2g全保护的Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro 片段。
[0163]4.乙胺化
[0164]26.1g Η0ΒΤ, 27.2g 乙胺盐酸盐加入 512.3g 全保护的 Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser (tbu) -Tyr (tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (pbf) -Pro 片段中，再加入 DIC39ml,室温反应过夜(24小时)，减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段。
[0165]5.裂解全保护德舍瑞林片段
[0166]全保护德舍瑞林片段中加入到3500ml预冷至0_10°C的切肽试剂(TFA/TIS/H20体积比为95:2.5:2.5)，反应2-3小时，加入1000Oml乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得202g(151mmOl)德舍瑞林粗品，收率84.1%。
[0167]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书 所界定的为准。
【权利要求】
1.一种徳舍瑞林的合成方法，其特征在于，以2-氯三苯甲基氯树脂为原料，在碱性条件下与芴甲氧羰基保护脯氨酸的羧基相连，得到芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂，再通过接肽反应依次接入徳舍瑞林剩余氨基酸，用全保护切割试剂裂解获得全保护9肽片段，再通过乙胺化获得全保护徳舍瑞林片段，最后裂解全保护徳舍瑞林片段获得徳舍瑞林粗品。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下: 1)制备芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂； 2)在步骤1)所得的芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂上依次接入徳舍瑞林的剩余氨基酸，获得9肽树脂； 3)用全保护切割试剂裂解步骤2)所得的9肽树脂，获得全保护9肽片段； 4)乙胺化步骤3)所得全保护9肽片段，获得全保护徳舍瑞林片段； 5)裂解步骤4)所得全保护徳舍瑞林片段，获得徳舍瑞林粗品。
3.权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤I)制备所述芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂，具体为用二氯甲烷浸泡2氯三苯甲基氯树脂，充分溶胀后吹干，加入接肽试剂溶解的芴甲氧羰基保护脯氨酸反应后吹干，再分别用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤吹干，获得芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氯树脂； 所述接肽试剂由N，N-二异丙基乙胺，N，N-二甲基甲酰胺按体积比1:15混合得到，2-氯三苯甲基氯树脂的体积浓度为5-20ml/g，芴甲氧羰基保护脯氨酸摩尔数为2-氯三苯甲基氯树脂的1.5-2倍。
4.权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤2)所述向芴甲氧羰基保护脯氨酸-2氯三苯甲基氯树脂依次接入徳舍瑞林的剩余氨基酸时，每次接入氨基酸均经过脱保护反应和接肽反应。
5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述脱保护反应，条件为脱保护剂哌啶:N，N-二甲基甲酰胺体积比=1:4，脱保护剂相对于被接肽树脂的添加量为5-20ml/g树脂，反应温度为20-25°C，反应时间为5-15min ； 所述接肽反应，条件为接肽试剂N，N-二异丙基乙胺:N，N-二甲基甲酰胺体积比=I: 15，被接物体积浓度为5-20ml/g，接入物摩尔数为被接物的2_3倍，反应温度为20_25°C，反应时间为1-1.5h。
6.权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤3)所述用全保护切割试剂裂解，具体为向步骤2)所得的9肽树脂中加入体积比为1:99的三氟乙酸和二氯甲烷中反应1-3小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得全保护的9肽片段。
7.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述乙胺化，具体为将1-羟基苯并三唑加入到步骤3)所得的全保护9肽片段中，再加入二异丙基碳二亚胺室温下反应24小时后减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段。
8.权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤5)所述裂解全保护的德舍瑞林片段，具体为将步骤4)所得的全保护的德舍瑞林片段加入预冷至0-10°C的切肽试剂中，反应2-3小时，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得德舍瑞林粗品。
9.权利要求8所述方法，其特征在于，所述切肽试剂，是三氟乙酸，三异丙基硅烷和水按体积比95:2.5:2.5组成的混合物。
10.权利要求1或2所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)取150g2-氯三苯甲基氯树脂，用1000ml二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀，再取.91.1g芴甲氧羰基保护脯氨酸，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，20_25°C反应1.5h后吹干，分别用N，N- 二甲基甲酰胺和甲醇洗涤吹干，获得芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氣树脂； 2)以步骤I)所的芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氯树脂为被接物，按照徳舍瑞林9肽序列，从脯氨酸端依次接入精氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、组氨酸和焦谷氨酸； 每次接入前，用向被 接物中加1000ml脱保护试剂，室温下反应15分钟，吹干，分别用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤3次，吹干，再取540mmol接入物，用173.4g 0_(苯并三唑-1-氧)-N, N, N, N-四甲基脲鎗六氟硼酸盐，72.9gl-羟基苯并三唑，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，20-25°C反应1.5h，吹干后再分别用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤3次，吹干，接完焦谷氨酸后获得9肽树脂； 3)将512.3g步骤2)所的9肽树脂转移至5000ml的容器中，加入3500ml预先配制好的体积比为1:99的三氟乙酸和二氯甲烷中反应2.5小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得361.2g全保护的9肽片段； 4)将26.1gl-羟基苯并三唑和27.2g乙胺盐酸盐加入到512.3g步骤3)所得全保护的9肽片段中，再加入39ml 二异丙基碳二亚胺，20-25°C下反应24h，减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段； 5)将步骤4)所得的全保护的德舍瑞林片段中加入到3500ml预冷至0_10°C的切肽试剂，反应2-3小时，加入1000Oml乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得德舍瑞林粗品。
【文档编号】C07K1/06GK104004054SQ201410184663
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】张旭光, 汪国兴 申请人:安徽瀚海博兴生物技术有限公司