牛分枝杆菌cfp-10的迟发型变态反应抗原表位多肽及其应用的制作方法

文档序号:3498095阅读:530来源:国知局
牛分枝杆菌cfp-10的迟发型变态反应抗原表位多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽及其应用。本发明利用重叠短肽分段表达技术,对CFP-10进行迟发型变态反应抗原肽的鉴定,最终鉴定出具有迟发型变态反应性的抗原肽为C-PC和C-PB7。将鉴定出的抗原肽C-PC和C-PB7与M-P11通过基因工程手段以Linker进行连接,基因优化后获得串联肽基因CCM,同时构建了含有多个CCM的多拷贝串联肽基因。对鉴定出的抗原肽及串联肽进行迟发型变态反应鉴定,结果显示,C-PB7、C-PC、CCM、2CCM均能产生较强的迟发型变态反应。本发明的提出改善了结核菌素皮内试验(TST)法诊断中PPD特异性差的问题,此外,通过增加串联肽的种类提高了诊断的敏感性。因此,本发明为牛结核皮试诊断制剂的研制提出了新的思路,具有良好的应用前景。
【专利说明】牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽及其 应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗原表位多肽,特别涉及牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原 表位多肽,还涉及该表位多肽在检测牛分枝杆菌感染中的应用。本发明属于生物【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis) 引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病,其特点是在多类器官或组织中形成结核结节、肉 芽肿、干酪样坏死和钙化病灶。牛结核病的潜伏期长短不一,通常为慢性,感染早期一般无 典型症状,主要表现为精神和食欲不振,逐渐消瘦,被毛凌乱无光泽,皮肤无弹性,产奶量逐 渐降低,由于感染部位和被感染组织损伤的程度不同,因而病畜表现出的临床症状也不尽 相同。
[0003] 该病全年均可发生,流行范围遍布全世界,并且能通过奶液及奶制品传染给人和 犊牛,这给食品安全和公共卫生带来了重大的危害。近年来调查研究显示,该病发病率呈上 升趋势,给养牛业和畜牧业的发展造成了巨大的阻碍。世界卫生组织将结核病列为全球重 点防控的三大疫病之一,我国将牛结核病列为二类动物疫病。牛型结核菌的易感动物种类 繁多,几乎可以感染所有的温血动物,可感染包括有蹄动物、灵长类等在内的50多种哺乳 动物,其中奶牛最易感。同时,人结核病的重要病因之一为牛分枝杆菌感染,研究表明,野生 动物是牛分枝杆菌的一类重要保藏宿主。因而牛分枝杆菌的存在,一直威胁着人类的健康, 调查显示,人结核病例中,有10%患者的病因是牛分枝杆菌感染。结核病已成为当前世界上 成年人传染病中的主要杀手,因而防制牛结核病对人类健康具有重要意义。
[0004] 牛分枝杆菌,革兰氏染色与抗酸染色阳性,与结核分枝杆菌、卡介苗、非洲分枝杆 菌、田鼠分枝杆菌和卡耐提分枝杆菌共同组成结核分枝杆菌复合群,菌体形态细长,略带弯 曲,长度大约1?4X0. 4 μ m,无鞭毛和芽孢、不产生内外毒素,属专性需氧型,培养要求条 件苛刻,生长周期长。研究发现,结核分枝杆菌复合群由同一个祖先进化而来,它们在核苷 酸水平上的相似度达到99. 95%,且某些基因序列完全一致,但是在进化过程中赋予了不同 的宿主偏好、表型和致病性。由于其菌体成分中脂质含量较高,导致其疏水性较强,这增强 了结核菌对外界环境的抵抗力。而且研究表明,结核菌的毒力强弱与其所含糖脂成分密切 相关。
[0005] 1996 年 Maheira 等(Mahairas G G,Sabo P J,Hickey M J,et al. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis [J] · Journal of bacteriology, 1996, 178 (5) : 1274-1282),利用基因缺失杂交技 术,比较卡介苗BCG和致病性牛分枝杆菌,以此来研究卡介苗减毒机制的基因基础,研究结 果表明:与牛分枝杆菌相比,卡介苗上缺失3个基因区,分别命名为删除区域(RD)RD1、RD2、 RD3。其中一个为称为Ihp的基因区,表达产物即被称为培养滤液蛋白-10,即CFP-10,其编 码基因为300bp,可编码100个氨基酸的多肽。CFP-10是重要的T细胞抗原,能诱导机体产 生细胞免疫和记忆性免疫应答,并且CFP-IO能诱导刺激高水平IFN- γ的产生和强烈的DTH 反应,CFP-10在T、B细胞免疫应答过程中具有如此重要的作用,而且BCG菌株基因组中又缺 失这种蛋白的编码基因,基于此点,CFP-10在预防和诊断试剂的开发研究中,成为了当前的 热点。MPT64,相对分子量为24000,是结核分枝杆菌在培养早、中期分泌释放于菌体外而游 离于培养基中的一种蛋白,只有结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和某些BCG菌株能表达MPB64, 而其他一些BCG菌株则缺失此基因。RD2区基因包含11个ORF(Rvl978-Rvl988),分别编 码 11 个蛋白,Rvl980c,也即MPT64(Mycobacterium protein tuberculosis 64,MPT64),是 RD2区的重要T细胞抗原,可以引起的细胞免疫应答水平较高,有研究证明,其可引起结核 阳性豚鼠皮内较强的迟发型变态反应,其在疫苗和诊断试剂方面表现出来的应用潜能引起 大量研究者的兴趣,是皮试诊断的优选抗原之一。MPT64中具有迟发性变态反应的抗原肽 M-P11 (NYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEA)已在研究中得到鉴定。
[0006] 目前,对CFP-10和MPT64的应用研究,主要集中在诊断试剂的研制、新型疫苗的 研制及两种蛋白在流行病调查方面的应用。DavincDillon设计并获得了 CFP10-ESAT6融 合蛋白,研究其引起的20例TST+健康者和20例TST-健康者的T细胞增殖和IFN- γ释 放量的情况,研究结果表明,PPD(+)者发生T细胞的增殖反应的比例为70%,而在PPD(-) 者中未见增殖反应的发生,研究还发现,IFN-Y的释放量也与T细胞增殖反应呈明显相关 性。Vordermeier H M等人,合成了来源于CFP-10的短肽,并应用MTT法对各段短肽进行了 增殖活性的测定。Sandra比较了多种结核患者和包括BCG免疫的无结核对照组T细胞对 ESAT-6和CFP-10反应的差异,发现大多数活动性或经治疗的结核患者对ESAT-6 (92% )和 CFP-10 (89% )有反应,而在PPD阴性的对照组中则均不反应。体外T细胞分泌IFN-γ实 验过程复杂,限制了其在牛结核诊断中的应用,而仅作为该病的辅助诊断手段之一。
[0007] 酶联免疫吸附试验(ELISA)方法虽具有简单,快速等特点,而且是近年来众多研 究者在诊断结核病方面的研究热点,但如前所述,该方法仅能作为结核病的辅助诊断方法, 其原因在于CFP-10并不是结核体液免疫的靶抗原,因此,其作为诊断试剂而应用于结核病 血清诊断方法(如ELISA)的意义不大。
[0008] 目前,临床上最常用的结核菌感染的诊断方法是PH)皮内TST法,而且也是OIE唯 一推荐的牛结核诊断标准方法,但是,由于Pro是一种含有许多分枝杆菌蛋白抗原的混合 物,因此,其诊断结核的特异性较差。鉴于CFP-10和MPT64是结核分枝杆菌和致病分枝杆 菌相对特异的抗原,并且其在结核菌感染早期即出现,这在众多研究中都得到了验证,说明 其在皮试诊断中具有良好的特异性,若将其联合使用,开发出一种新的牛结核皮试诊断试 剂来代替牛结核诊断中的PPD,必将有良好的应用前景。


【发明内容】

[0009] 本发明的目的在于在通过原核表达方式,采用重叠短肽分段技术,筛选出CFP-10 的迟发性变态反应性抗原表位,然后,将筛选出的表位基因与经验证具有较强迟发型变态 反应性的 MPT64 抗原表位肽 M-P11 基因(NYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEA,SEQ ID NO. 5 所示) 串联,并进行基因优化与表达,以获得在大肠杆菌中高效表达的新型DTH皮试诊断抗原,以 此替代目前牛结核皮试诊断中使用的结核菌素(PH)),在致敏豚鼠皮内检验其迟发型变态 反应效力。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术手段实现的:
[0011] 本发明以牛分枝杆菌C68001基因组DNA为模板,经PCR获得CFP-10基因,连 入pET32a(+)载体,并将构建的重组质粒pET32a-CFP-10转化大肠杆菌Rosetta感受态 中,经IPTG诱导5h后得到可溶性表达的目的蛋白,纯化后的重组蛋白在致敏豚鼠皮内 检验其迟发型变态反应性(DTH),试验结果表明,重组蛋白rCFP-ΙΟ具有较强的迟发型 变态反应性。然后,利用重叠短肽分段表达技术,对CFP-10进行迟发型变态反应抗原 肽的鉴定,共进行了 3轮鉴定,每轮鉴定均在致敏豚鼠皮内完成,最终鉴定出CFP-10具 有迟发型变态反应性的抗原肽为C-Pe(AQAAVVRFQEAANKQKQELD,SEQ ID NO. 1所示)和 C-PB7(EISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALS,SEQ ID NO. 2 所示)。将鉴定出的两抗原肽(:-?。和 C-Pb7与M-P11通过基因工程手段以Linker序列(GGGGS)进行连接,基因优化以使其在大 肠杆菌中高效表达,串联肽基因命名为CCM基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示,构建 了表达单拷贝及多拷贝串联肽基因的重组质粒pET30a-CCM、pET30a-2CCM、pET30a-4CCM、 pET30a-6CCM、pET30a-8CCM、pET30a-12CCM,分别转入大肠杆菌 Rosetta 感受态中,经 IPTG 诱导5h后,通过SDS-PAGE分析发现,2CCM的表达量最高且为可溶性表达,因而选取2CCM作 为皮试诊断抗原,并在致敏豚鼠皮内检验其迟发型变态反应性,结果表明,串联抗原肽2CCM 组的迟发型变态反应反应性强于单个抗原肽组,2CCM组与CCM相比,无明显差异。
[0012] 在上述研究的基础上,本发明提出了一种牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应 抗原表位多肽,其特征在于所述抗原表位多肽命名为C-P。或C-P b7,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 或 SEQ ID NO. 2 所示。
[0013] 编码所述的迟发型变态反应抗原表位多肽的核苷酸序列,优选的,所述的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示,更优选的,所述的核苷酸序列为经过旨在提高表 达宿主特异性的密码子利用率的基因优化改造后得到的核苷酸序列。
[0014] 进一步的,本发明还提出了所述的牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表 位多肽及其编码核苷酸序列在制备牛结核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。
[0015] 在上述研究的基础上,本发明的另一个目的是提供一种牛结核迟发型变态反应皮 试诊断抗原(单拷贝,命名为CCM),其特征在于所述的皮试诊断抗原是通过将所述的牛分 枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽C-P。和C-P b7与经验证具有较强迟发型变 态反应性的MPT64抗原表位肽M-P11经Linker序列串联后得到的。
[0016] 在本发明中,优选的,所述的MPT64抗原表位肽M-P1J^氨基酸序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0017] 在本发明的一个具体实施例中,所述皮试诊断抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6 所示。
[0018] 进一步的,本发明还提出了所述的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原在制备牛 结核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。
[0019] 在上述研究的基础上,本发明的再一个目的是提供一种多拷贝的牛结核迟发型变 态反应皮试诊断抗原,其特征在于所述多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原是由 2-12个以上所述的单拷贝皮试诊断抗原(CCM)经Linker序列串联后得到。
[0020] 在本发明中,优选的,所述的多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原,其特 征在于所述皮试诊断抗原由2个单拷贝皮试诊断抗原(CCM)经串联后得到,所述串联肽的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示(命名为2CCM)。
[0021] 进一步的,本发明还提出了所述的多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原 在制备牛结核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。
[0022] 相较于现有技术,本发明的优点在于:
[0023] 1、选择CFP-10、MPT64作为牛结核DTH皮试诊断抗原表位来源
[0024] CFP-10和MPT64为牛结核分枝杆菌介导细胞免疫的主要优势抗原,在牛结核分枝 杆菌培养早期分泌到培养滤液中,大量动物试验表明,在牛结核感染早期,两种蛋白均具有 出现时间早,分泌量大,持续时间长,介导细胞免疫水平高等特点,因而具有较好的疫苗开 发及诊断试剂研发的潜力。而且由于在BCG和非典型分枝杆菌中该两种蛋白基因缺失,因 而可以解决pro存在的特异性差的问题,以达到鉴别牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的 目的;
[0025] 2、通过构建串联肽提高诊断的敏感性
[0026] 将筛选出的2个具有DTH反应性的抗原肽C-Pc、C_PB7及经验证具有DTH反应性的 抗原肽M-P 11,采用Linker(GGGGS)串联构建的皮试诊断抗原,具有活动性好,易于折叠等优 点。利用某些特定限制性内切酶酶切消化后具有相同的粘性末端,即同尾酶原理,构建多拷 贝串联肤,提1? 了诊断的敏感性,同时,为了提1?表达量,对其进行基因优化,使其在大肠杆 菌中更加高效的表达,便于未来大量生产;
[0027] 3、采用原核表达方式制备新型皮试诊断抗原
[0028] 采用原核表达方式制备新型皮试诊断抗原,生产周期短,仅需几天就可获得大量 蛋白,而且操作简便,易于大量生产,这解决了 pro的生产周期长等方面的问题,更重要的 是避免了生产过程中工作人员受到病原菌威胁的风险,这对诊断试剂的生产提供很大的方 便,具有良好的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 图1为第一轮筛选时的CFP-10短肽分段设计图;
[0030] 图2为第二轮筛选时的CFP-10短肽分段设计图;
[0031] 图3为串联肤CCM设计不意图;
[0032] 图4为融合蛋白rCFP-ΙΟ表达及纯化后的SDS-PAGE分析;
[0033] M.蛋白质分子量标准;I. Rosetta-pET_32a IPTG 诱导 5h 后;2.
[0034] Rosetta-pET-32a-CFP_10 诱导前;3. Rosetta-pET_32a-CFP-10IPTG 诱导沾后; 4.
[0035] Rosetta-pET-32a IPTG 诱导 5h 后;5.未纯化的 rCFP-ΙΟ ;6·纯化的 rCFP-10
[0036] 图5为重组蛋白rCFP-10致敏豚鼠 DTH皮试;
[0037] A. 2 μ g rCFP-10 ;B. 1 μ g rCFP-10 ;C. 0. 5 μ g rCFP-10 ;
[0038] D. 4 μ g rCFP-10 ;E. IOIU PPD ;F. 4 μ g pET32a 空载体蛋白对照
[0039] A. 2 μ g rCFP-10 ;B. I μ g rCFP-10 ;C. 0. 5 μ g rCFP-10 ;
[0040] D.4 μ g rCFP-10 ;E.IOIU PPD ;F. Negative control of 4 μ g pET32a
[0041] 图6为重组蛋白rCFP-10致敏豚鼠 DTH皮试;
[0042] 图7为融合蛋白C-Pai?Pm的表达及纯化后的SDS-PAGE分析;
[0043] Μ·蛋白质分子量标准;1 ?4. Rosetta-pET-32a-C_PA1 ?PmIPTG 诱导 5h ;5·
[0044] Rosetta-pET_32a IPTG 诱导沾;6 ?9·纯化的 C-Pai ?ΡΑ4
[0045] 图8为重组蛋白C-Pai?Pm在致敏豚鼠的DTH皮试;
[0046] 图9为融合蛋白C-Pbi?Pb8的表达及纯化后的SDS-PAGE分析;
[0047] Μ.蛋白质分子量标准;I. Rosetta-pET_32a IPTG 诱导 5h ;
[0048] 2 ?9. Rosetta-pET-32a-C_PB1 ?Pb8IPTG 诱导 5h ;10 ?17.纯化的 C-Pbi ?Pb8
[0049] 图10为重组蛋白C-Pm?Pb8在致敏豚鼠的DTH皮试;
[0050] 图11为融合蛋白C-Pc的表达及纯化后的SDS-PAGE分析;
[0051] M.蛋白质分子量标准;I. Rosetta-pET-32a-C-P。IPTG 诱导 5h ;2·纯化的 C-Pc
[0052] 图12为重组蛋白C-Pc在致敏豚鼠的DTH皮试;
[0053] 图13为5段合成肽在致敏豚鼠的DTH皮试;
[0054] 图14为融合串联肽的表达及纯化后的SDS-PAGE分析;
[0055] M.蛋白质分子量标准;I. Rosetta-pET_30a IPTG 诱导 5h ;
[0056] 2· Rosetta-pET_3〇a-CCM IPTG 诱导沾;3· Rosetta-PET-3Oa-2CCM IPTG 诱导沾; 4.
[0057] Rosetta-pET_3〇a-4CCM IPTG诱导沾;5· Rosetta-PET-3Oa-6CCM IPTG诱导沾;6·
[0058] Rosetta-PET-3Oa-8CCM IPTG 诱导沾;7· Rosetta-PET-3Oa-I2CCM IPTG 诱导沾; 8.
[0059] pET30a_2CCM诱导后裂解上清;9. pET30a_2CCM诱导后裂解沉淀;10.
[0060] pET30a-4CCM诱导后裂解上清;11. pET30a-4CCM诱导后裂解沉淀
[0061] 图15为重组蛋白CCM、2CCM在致敏豚鼠的DTH皮试。

【具体实施方式】
[0062] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0063] 本发明实施例所涉及的实验材料:
[0064] 1、质粒、载体、菌种
[0065] 牛分枝杆菌68001基因组由哈药集团生物疫苗有限公司惠赠、表达载体 pET-30a(+)和 pET-32a(+)、Ecoli. TGl 及 Ecoli. Rosetta (DE3)pLysS 均由本实验室保存。
[0066] 2、实验动物
[0067] 豚鼠(250g_300g)购自哈药集团生物疫苗有限公司。
[0068] 3、工具酶
[0069] ExTaq DNA 聚合酶,rTaq DNA 聚合酶,T4DNA Ligase 购自 New England BioLabs (NEB),限制性内切酶类 EcoR I、Hind III、BamH I、Bgl II、Xho I 等购自宝生物 工程(大连)有限公司。
[0070] 4、分子生物学试剂
[0071] Trans2K Plus II DNA Marker>Trans2K DNA Marker>Uist Protein Marker>dNTP 等购自北京全式金生物科技有限公司;His蛋白纯化填料介质购自南京金斯瑞生物技术有 限公司;质粒小量提取及小量胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)和蛋白纯化柱均 购自北京百泰克生物公司。
[0072] 5、其他试剂
[0073] IPTG购自宝生物工程(大连)有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自德美生物有 限公司;氨节青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、十二烧基磺酸钠(SDS)为Sigma公司进口分 装;丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸氨、Tris-base、 Tris-Cl、四甲基乙二胺(TEMED)等购自哈尔滨宝泰克生物科技公司;考马斯亮蓝R250购自 哈尔滨万太生物科技公司。
[0074] 磷酸氢二钾、EDTA、磷酸氢二钠、甲醇磷酸二氢钠均购自天津光复精细化工研究 所;氯化钠、氯化钾、氯仿、无水乙醇均购自天津市天力化学试剂有限公司;琼脂粉购自万 太生物有限公司;所有化学试剂均属于分析纯。
[0075] 6、主要实验仪器设备
[0076] 超净工作台:DL-CJ-2N型,北京东联哈尔滨有限公司
[0077] 电泳仪:Savant PS4000 型,LINE VOLTAGE 公司
[0078] 凝胶分析仪:Multi Image? Light Cabinet Alpha Innotech Corporation
[0079] PCR 仪:Eppendorf mastercyclerep gradients
[0080] 纯水仪:MiIlipore Milli-QII
[0081] 电热恒温培养箱:LTI-700型,上海爱朗仪器有限公司
[0082] 离心机:5418 型,eppendorf
[0083] pH 计:METTER TOLEDO MP 22〇
[0084] 电热恒温水槽:DK_8D型,上海精宏实验设备有限公司
[0085] 电子天平:METTER AE260 型,Deltalange 公司
[0086] 微量移液器:Eppendorf、GILSON
[0087] 高压灭菌器:HICLAVE HVE-50型,日本Hirayama公司
[0088] 实施例1牛分枝杆菌CFP-IO的迟发型变态反应抗原表位的鉴定
[0089] 方法:
[0090] 1、牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应性鉴定
[0091] I. 1牛分枝杆菌CFP-10基因的扩增的引物设计
[0092] 根据GenBank中登录的牛分枝杆菌H37Rv株(NC_000962. 3) CFP-10基因序列设计 1对引物,在正向上游引物5'端引入保护性碱基及EcoRI酶切位点,反向下游引物5'端引 入保护性碱基、Hind III酶切位点及终止密码子(见表1),下划线部分为引入的限制性内切 酶的酶切位点,引物由北京华大基因公司合成。
[0093] 表1牛分枝杆菌CFP-10基因扩增引物
[0094]

【权利要求】
1. 牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽,其特征在于所述抗原表位多 肽,命名为C-P。或C-PB7,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
2. 编码权利要求1所述的迟发型变态反应抗原表位多肽的核苷酸序列,优选的,所述 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示。
3. 权利要求1所述的牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽及权权利要 求2所述的核苷酸序列在制备牛结核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。
4. 一种牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原,其特征在于所述的皮试诊断抗原是通过 将权利要求1所述的牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽C-P。以及C-PB7与经验证具有较强迟发型变态反应性的MPT64抗原表位肽M-Pn经Linker序列串联后得到 的。
5. 如权利要4所述的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原,其特征在于所述的MPT64 抗原表位肽M-Pn的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所不。
6. 如权利要求4或5所述的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原,其特征在于所述皮 试诊断抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
7. 权利要求4-6任一项所述的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原在制备牛结核迟 发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。
8. -种多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原,其特征在于含有2-12个权利 要求4-6任一项所述的皮试诊断抗原。
9. 如权利要求8所述的多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原,其特征在于所 述多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原由2个权利要求4-6任一项所述的皮试诊 断抗原串联后得到,所述串联肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
10. 权利要求8或9所述的多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原在制备牛结 核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。
【文档编号】C07K19/00GK104371013SQ201410549030
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】王君伟, 刘洪涛, 高明春 申请人:东北农业大学
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