沼泽红假单胞菌菌株、菌剂及菌剂的制备方法、胞外蛋白及其提取方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了沼泽红假单胞菌菌株、菌剂及菌剂的制备方法、胞外蛋白及其提取方法和应用，其中沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-6（ Rhodopseudomonaspalustris LY-6），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCCM2014525，其菌剂采用沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。本发明还提供了从沼泽红假单胞菌菌剂中提取的胞外蛋白，其提取方法包括硫酸铵沉淀-盐析、离心、SephadexG-25脱盐、SephadexG-75柱层析分离等步骤。胞外蛋白的提取方法简易、流程短、提取效率高，可对烟草花叶病毒具有体外钝化作用。CCTCC NO: M 201452520141029
【专利说明】
沼泽红假单胞菌菌株、菌剂及菌剂的制备方法、胞外蛋白及其提取方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物农药【技术领域】，尤其涉及一种沼泽红假单胞菌菌株、及其菌剂和菌剂的制备方法；还涉及由其菌剂中提取的胞外蛋白及胞外蛋白的提取方法及在烟草花叶病毒防治中的应用。
【背景技术】
[0002]植物病毒病是“植物癌症”，对农业生产造成严重损失。植物病毒普遍具有系统侵染性和专性寄生性，因此造成抗病毒药剂的研发难度大、效果稳定性低等。在烟草的种植过程中，烟草花叶病毒(TMV)危害尤其严重。烟草花叶病毒病是世界性的重要烟草病害之一，分布范围广、发病危害严重，造成烟叶品质下降、产量降低等。
[0003]对于烟草花叶病毒病的防治，目前还以化学防治为主。但化学农药的投入，影响了农田生态系统的结构，破坏了农田生态系统平衡，从而影响农田生产的可持续性，降低了农产品的质量，且化学农药的不合理投入，对非靶标毒害及农产品残留超标，越来越受到人们关注。为了开发理想的抗植物病毒药剂，研究者们进行了大量的定向合成和筛选工作，但至今没有开发出像杀虫剂和除草剂、杀菌剂等类似的超高效而环境友好的商品化品种。目前发现的具有抗病毒活性的化合物主要包括:杂环类化合物、核苷酸、生物碱、取代苯、醛及其缩合物、有机磷、氨基酸衍生物、维生素、植物激素、抗生素、植物诱导抗病激活剂等。这些化合物中，已有开发成功且在植物病毒防控中起到一定的作用。但是，蛋白类的抗病毒药剂却仍未见。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种沼泽红假单胞菌菌株、菌剂及菌剂的制备方法，从沼泽红假单胞菌中提取的胞外蛋白，对烟草花叶病毒具有体外钝化作用，可应用于烟草花叶病毒病的防治，其胞外蛋白的提取方法简易、流程短、提取效率高。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种沼泽红假单胞菌菌株，沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY_6 {Rhodopseudomonas palustris LY-6),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014525。
[0006]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种沼泽红假单胞菌菌剂，采用前述的沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。
[0007]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述的沼泽红假单胞菌菌剂的制备方法，具体包括以下步骤:
(1)活化:将沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
(2)种子培养:将步骤(I)培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30°C?32°C、光照条件为2500Lx?4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液；
(3)生产培养:将步骤(2)种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为光合细菌菌株生产培养基总体积的5%，在温度为30°C?32°C、光照条件为2500Lx?4000Lx、pH=7.0条件下，培养至对数生长期；
(4)离心:将步骤(3)生产培养得到的菌液进行8000rpm、4°C、15min离心后，收集上清，然后用0.22 μ m滤膜进行抽滤得到滤液，即制得沼泽红假单胞菌菌剂。
[0008]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种胞外蛋白，胞外蛋白从前述的沼泽红假单胞菌菌剂或前述制备方法制备得到的沼泽红假单胞菌菌剂中提取得到。
[0009]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述胞外蛋白的提取方法，具体包括以下步骤:
(1)硫酸铵沉淀-盐析:向沼泽红假单胞菌菌剂中加入硫酸铵至70%饱和度，使沼泽红假单胞菌菌剂中的蛋白析出，得到混合液；
(2)离心:将步骤(I)中得到的混合液以IlOOOrpm转速离心30min得到沉淀,将沉淀重悬于PBS缓冲液中得到蛋白重悬液；
(3)Sephadex G_25脱盐:将步骤(2)中制备得到的蛋白重悬液低温冷冻浓缩后，采用Sephadex G-25柱进行脱盐得到蛋白粗品；
(4)SephadexG_75柱层析分离:将步骤(3)制得的蛋白粗品采用Sephadex G_75柱进行层析分离得到胞外蛋白。
[0010]前述的提取方法，进一步的，步骤(2)中，PBS缓冲液的浓度为0.01M, pH为7.0。
[0011]前述的提取方法，进一步的，步骤(3)中，蛋白重悬液以15%的上样比例进行Sephadex G-25柱脱盐得到蛋白粗品，将蛋白粗品稀释至10mg/mL。
[0012]前述的提取方法,进一步的,步骤(4 )中，蛋白粗品按2%的上样比例进行SephadexG-75柱层析分离。
[0013]前述的提取方法，进一步的，步骤(4)中层析分离后，获得的各个蛋白组分，然后进行活性测定，合并活性组分，低温冷冻浓缩即得到胞外蛋白。
[0014]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述的胞外蛋白或前述提取方法提取得到的胞外蛋白在烟草花叶病毒病防治中的应用。
[0015]与现有技术相比，本发明的优点在于:
(I)本发明从沼泽红假单胞菌LY-6菌剂可以分泌出对烟草花叶病毒具有钝化作用的胞外蛋白，从而起到对烟草花叶病毒的抑制作用。
[0016](2)本发明首次从从沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的胞外产物中提取胞外蛋白，其提取工艺简单、流程短、成本低，提取过程对环境无污染。
[0017](3)本发明从沼泽红假单胞菌LY-6菌剂中提取获得的蛋白组分分子量在15kD?25kD之间，热稳定性高、耐储藏、对烟草花叶病毒的体外钝化作用效果好。
[0018]本发明的沼泽红假单胞菌，其名称为沼泽红假单胞菌LY-6 {Rhodopseudomonaspalustris LY-6)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014525 ;保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2014年10月29日。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0020]图1为本发明实例I中沼泽红假单胞菌LY-6菌株的菌落图片。
[0021]图2为本发明实施例4中沼泽红假单胞菌LY-6菌株发酵液中胞外提取蛋白组分对烟草花叶病毒的体外钝化作用效果图。
[0022]图3为本发明实例4中沼泽红假单胞菌LY-6菌株发酵液中胞外提取蛋白组分对烟草花叶病毒的体外钝化作用效果树状图。
【具体实施方式】
[0023]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0024]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0025]实施例1:
一种沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-6 {Rhodopseudomonas palus trisLY-6)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014525，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2014年10月29日，该菌株被命名为沼泽红假单胞菌LY-6{.Rhodopseudomonas palustris LY-6)。
[0026]参见图1:本发明的沼泽红假单胞菌菌株LY-6，为革兰氏阴性菌，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌，主要生物学特征有:双层固体平板培养基上培养4d?8d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm?0.60mm ;液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30°C?32°C，pH=7。
[0027]实施例2:
一种沼泽红假单胞菌菌剂，采用实施例1的沼泽红假单胞菌菌株LY-6为原料，经活化、种子培养、生产培养、离心制备得到，其具体制备方法包括以下步骤:
(O活化:将沼泽红假单胞菌LY-6菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为:0.1被％的(NH4) 2S04、
0.02wt% 的 MgS04、0.5wt% 的 NaHC03、0.05wt% 的 K2HP04、0.02wt% 的 NaCl、0.15wt% 的酵母膏和 1.5wt% 的琼脂，pH=7.0。
[0028](2)种子培养:将步骤(I)培养的红色单菌落接入至120mL血清瓶中，在温度为30°C?32°C、光照条件为2500Lx?4000Lx、pH=7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液。光合细菌液体培养基的配方为:0.lwt%的(NH4) 2S04、0.02wt%的MgS04、0.5wt% 的 NaHCO3>0.05wt% 的 K2HP04、0.02wt% 的 NaCl、0.15wt% 的酵母膏，ρΗ=7.0。
[0029](3)生产培养:将步骤(2)种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基(培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致)进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5%，在温度为30°C?32°C、光照条件为2500Lx?4000Lx、pH=7.0条件下，培养至对数生长期得到菌剂；
(4)离心:将步骤(3)生产培养得到的菌剂进行8000rpm、4°C、15min离心后,弃上清,然后用0.22 μ m滤膜进行抽滤去除上清中残留的具体，收集滤液，即制得菌剂。
[0030]实施例3:
一种沼泽红假单胞菌胞外蛋白，从实施例2的沼泽红假单胞菌菌剂中提取得到，蛋白组分分子量在15kD?25kD之间，其具体的提取方法为:
(I)硫酸铵沉淀-盐析:在4°C条件下，向沼泽红假单胞菌菌剂中加入硫酸铵至70%饱和度；待蛋白沉淀从发酵液中析出得到混合液。
[0031](2)离心、蛋白沉淀收集:将步骤(I)中制备得到的混合液以I100rpm离心30mins(离心温度为4°C )，弃上清，收集沉淀。将沉淀重悬于0.01M、pH=7.0的PBS缓冲液中得到蛋白重悬液。
[0032](3) Sephadex G-25脱盐:将步骤(2)中制备得到的蛋白重悬液低温冷冻浓缩后，按15%的上样比例，采用S^hadex G_25柱进行脱盐。收集脱盐后的蛋白进行低温冷冻浓缩，并用考马斯亮蓝法测定浓缩后蛋白浓度，将浓缩后的蛋白稀释至10mg/mL。
[0033](4)Sephadex G-75柱层析分离:将步骤(3)中制备得到的浓度为10mg/mL的蛋白粗品按2%的上样比例，采用S印hadex G-75柱进行层析分离。将获得的各个蛋白组分进行活性测定(活性测定的方法参照半叶法测定)，合并活性组分，将活性组分低温冷冻浓缩后获得胞外蛋白。
[0034]实施例4:
一种实施例3的胞外蛋白在烟草花叶病毒病防治中的应用，具体的应用方法为:
将胞外蛋白配制成 400 μ g/mL >200 μ g/mL > 100 μ g/mL >50 μ g/mL >25 μ g/mL的溶液，并将400 μ g/mL进行100 V处理15min灭活，然后采用半叶法测定活性。
[0035]半叶法测定各蛋白组分的抗病毒活性:将纯化的烟草花叶病毒(TMV)提取液稀释至10 μ g/mL，与稀释成各个浓度的蛋白组分按1:1混合后，24°C条件下保存12h，然后摩擦接种于第6、7、8心叶烟叶片上，24°C培养3d后计算蛋白液对TMV抑制率。
[0036]抑制率=(对照枯斑数-蛋白处理枯斑数)/对照枯斑数X 100%。
[0037]参见图2和图3，图2中编号1、2、3、4、5分别表示浓度为400 μ g/mL、200 μ g/mL > 100 μ g/mL >50 μ g/mL >25 μ g/mL的胞外蛋白组分处理,柱上不同小写字母表不差异显著性(P〈0.05)，从图中2和图3中可以知道:胞外蛋白液在浓度为50 μ g/mL仍具有一定活性，当浓度为12.5 μ g/mL时，与对照无显著差异；高温处理后的蛋白失去对TMV的体外钝化效果。当浓度达到200 μ g/mL以上时，对烟草花叶病毒的体外钝化作用达到89%。
0.01M、pH=7.0的PBS缓冲液为空白对照。
[0038]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【权利要求】
1.一种沼泽红假单胞菌菌株，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌V1-^Rhodopseudomonas palustris LY_6),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC Μ 2014525。
2.一种沼泽红假单胞菌菌剂，其特征在于，采用权利要求1所述的沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。
3.—种权利要求2所述的沼泽红假单胞菌菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)活化:将沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现； (2)种子培养:将步骤(1)培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30°C?32°C、光照条件为2500Lx?4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液； (3)生产培养:将步骤(2)种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5%，在温度为30°C?32°C、光照条件为2500Lx?4000Lx、pH=7.0条件下，培养至对数生长期； (4)离心:将步骤(3)生产培养得到的菌液进行8000rpm、4°C、15min离心后，收集上清，然后用0.22 μ m滤膜进行抽滤得到滤液，即制得沼泽红假单胞菌菌剂。
4.一种胞外蛋白，其特征在于，所述胞外蛋白从权利要求2所述的沼泽红假单胞菌菌剂或权利要求3所述制备方法制备得到的沼泽红假单胞菌菌剂中提取得到。
5.一种权利要求4所述胞外蛋白的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)硫酸铵沉淀-盐析:向沼泽红假单胞菌菌剂中加入硫酸铵至70%饱和度，使所述沼泽红假单胞菌菌剂中的蛋白析出，得到混合液； (2)离心:将所述步骤(1)中得到的混合液以llOOOrpm转速离心30min得到沉淀，将所述沉淀重悬于PBS缓冲液中得到蛋白重悬液； (3)Sephadex G_25脱盐:将所述步骤(2)中制备得到的蛋白重悬液低温冷冻浓缩后，采用Sephadex G_25柱进行脱盐得到蛋白粗品； (4)SephadexG_75柱层析分离:将步骤(3)制得的蛋白粗品采用Sephadex G_75柱进行层析分离得到胞外蛋白。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述PBS缓冲液的浓度为0.01M, pH为7.0。
7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述蛋白重悬液以15%的上样比例进行S印hadex G_25柱脱盐得到蛋白粗品，将所述蛋白粗品稀释至10mg/mL。
8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述蛋白粗品按2%的上样比例进行Sephadex G_75柱层析分离。
9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中层析分离后，获得的各个蛋白组分，然后进行活性测定，合并活性组分，低温冷冻浓缩即得到胞外蛋白。
10.一种权利要求4所述的胞外蛋白或权利要求5至9任一项所述提取方法提取得到的胞外蛋白在烟草花叶病毒病防治中的应用。
【文档编号】C07K1/30GK104403978SQ201410750073
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】刘勇, 张德咏, 苏品, 谭新球, 张松柏, 冯推紫, 彭静, 张卓 申请人:湖南省植物保护研究所