分离组蛋白h4-k16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制作方法

分离组蛋白h4-k16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制作方法
【专利摘要】一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方法，包括如下步骤：首先在硅胶表面接枝双官能团戊二醛，然后在硅胶表面键合印迹分子，最后合成分子印迹聚合物微球。本发明的优点是：该分子印迹聚合物微球对于含有乙酰化K16的组蛋白H4水解后的标记肽段GGAKacR具有很好的识别能力及选择性，可以用于组蛋白H4水解样品中含有乙酰化K16的标记肽段的选择性富集及测定；同时由于印迹位点在材料表面，该分子印迹聚合物微球也能够对于C端具有GGAKacR序列的长链肽段进行选择性提取，在加标组蛋白水解样品的提取实验中，这种分子印迹微球对于肽段的回收率达到80％以上，可以在组蛋白H4-K16乙酰化的测定中发挥作用。
【专利说明】分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球

【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子印迹材料的制备，特别是一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多 肽的分子印迹微球及其制备方法。

【背景技术】
[0002] 组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，在染色体组装方面起到了重要 作用，目前已发现组蛋白具有多种翻译后修饰，这些翻译后修饰在调控基因动态表达方面 有着重要的意义。组蛋白H4(Hist 〇ne H4)是四种核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4)之一，研 究发现，组蛋白H4的N端第十六位的赖氨酸（简称为H4-K16)的乙酰化修饰对于染色体 中的组装有着重要作用，这种修饰不但与染色质折叠缺陷相关，也影响细胞的周期调控。因 此，对于组蛋白H4-K16乙酰化的分析具有重要的意义。由于蛋白翻译后修饰经常处于动态 变化中，而且丰度较低，其分析鉴定比较困难，因此，应用具有选择性的富集材料进行提取 分离十分必要，但另一方面，具有选择性的生物抗体存在价格昂贵、环境的耐受能力差的问 题，因此，制备能够对于组蛋白H4-K16乙酰化的标记肽进行选择性富集的人工合成材料很 有意义。
[0003] 分子印迹（molecular imprinting)是一种制备具有识别能力的聚合物的技术， 非共价分子印迹是印迹技术常用的方法。在非共价分子印迹中，模板分子（也称印迹分 子）与功能单体通过相互作用形成复合物，在交联剂存在下聚合形成印迹聚合物，在洗脱 除去材料中的印迹分子后得到分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer,缩写为 MIP)。MIP中具有尺寸及作用基团与印迹化合物相匹配的孔穴，这些孔穴形成了对于印迹 分子的识别位点。由于MIP的识别能力类似于生物抗体，分子印迹技术也被称为制备人工 抗体的技术。在蛋白等大分子印迹材料的合成中，为了减少传质阻力，限于表面的印迹方法 (Surface-confined imprinting)被应用于分子印迹，其中一种方法是将印迹分子固载于介 质表面，在印迹聚合后，除去固载介质，得到结合位点限于表面的印迹材料。这种印迹聚合 物具有易于进入的结合位点，而且能够结合含有印迹分子链段且尺寸大于印迹分子的蛋白 或多肽，在蛋白印迹中具有很强的优越性。选择蛋白分子中的能够和抗体结合的部分肽段 作为印迹分子进行印迹，以合成的MIP用于整个蛋白的结合，称为抗原决定簇印迹法。
[0004] 本发明合成了一种对组蛋白H4-K16乙酰化（标记为H4-K16ac)具有识别能力 的分子印迹聚合物微球，由于含有乙酰化K16的组蛋白H4水解后肽段（GGAKacR)可以作 为H4-K16ac的标记物，合成中以GGAKacR为印迹模板分子，将其固载于娃胶表面；以三氟 代甲基丙烯酸为功能单体，Ν' N-乙烯基双丙烯酰胺为交联剂，在印迹分子固载硅胶表面 进行分子印迹合成；合成后除去GGAKacR固载硅胶，得到GGAKacR分子印迹微球（标记为 GGAKacR-MIP)。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种多肽分子印迹微球及其 制备方法，该分子印迹聚合物微球对组蛋白H4-K16乙酰化（标记为H4-K16ac)的标记肽段 (GGAKacR)具有很好的识别能力及选择性，可以用于组蛋白H4水解样品中含有乙酰化K16 的标记肽段的选择性富集及测定。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] -种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球，是以三氟代甲基丙烯 酸为单体、Ν' N-乙烯基双丙烯酰胺为交联剂的交联高分子聚合物，粒径约为20微米，聚 合物表面带有识别GGAKacR以及C端含有GGAKacR肽段的长链多肽的结合位点；微球材 料对于GGAKacR有很好的选择性，作为吸附材料，分子印迹聚合物微球在磷酸盐缓冲液 中对于GGAKacR的吸附容量为50 μ mol · g4左右；微球材料对于印迹分子的印迹因子为 2. 5,印迹因子由IF = QMIP/QNIP计算，其中Qmip是分子印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量 (μ mol · g4), Qnip为非印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量（μ mol · g4);以分子印迹聚 合物微球作为色谱固定相，以磷酸盐缓冲液（20mM，pH = 7. 0)为流动相，印迹分子GGAKacR 的保留因子为5. 9左右，由液相色谱法测定的分子印迹材料的选择性因子α > 1. 7,选择性 因子由α =1ν\计算，其中，Ic1为印迹分子的保留因子，kx为其类似物的保留因子。
[0008] -种所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球制备方法，包括如 下步骤：
[0009] 1、硅胶表面接枝双官能团戊二醛；
[0010] 1)将硅胶微球与盐酸溶液混合，120°c下回流7h后过滤洗涤，先用蒸馏水洗至中 性，再用丙酮清洗1次，最后于90°C真空干燥12h，得到活化后硅胶；
[0011] 2)将上述活化后硅胶与干燥甲苯混合，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气 保护下回流12h，反应完成后依次用甲苯、丙酮、蒸馏水、丙酮洗涤，最后于60°C下真空干燥 12h，得到氨丙基键合硅胶（Sil-NH 2);
[0012] 3)将氨丙基键合硅胶（Sil-NH2)和戊二醛溶液加入磷酸盐缓冲溶液中并混合均 匀，在30°C下反应6h，反应完成后抽滤，先用蒸馏水清洗至完全去除未反应的戊二醛，再用 丙酮清洗1次，将得到微球于60°C下真空干燥12h，得到醛基键合硅胶（Sil-CHO);
[0013] 2、在硅胶表面键合印迹分子
[0014] 1)将多肽（GGAKacRpbf)溶于新配制的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入醛基键合硅 胶（Sil-CHO)，在振荡器中25°C下震荡24h，反应完成后用缓冲溶液和蒸馏水洗涤各清洗1 次，真空干燥后，得到多肽固载硅胶；
[0015] 2)将上述多肽固载硅胶与三氟乙酸（TFA)溶液混合并于室温搅拌以脱去精氨酸 的保护基团，经砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗至中性，最后无水乙醇清洗后于60°C下真空 干燥备用，得到GGAKacR固载硅胶（Sil-GGAKacR);
[0016] 3、分子印迹聚合物微球的合成
[0017] 1)将功能单体、交联剂和引发剂溶于磷酸盐缓冲液中，配置成预聚合溶液；
[0018] 2)将GGAKacR固载硅胶（Sil-GGAKacR)浸入预聚合溶液中，室温下静置3_4h，取 出后用乙醇快速冲洗后转移至锥形容器中，通氮气除氧后密封，置于烘箱中在45°C下反应 24h，将得到的微球转移到锥形容器中，加入IOmL丙酮，再加入40wt %的HF溶液I. 5mL，冰 浴条件下放置Ih后室温震荡12h，得到溶解硅胶后的印迹聚合物；
[0019] 3)将溶解硅胶后的印迹聚合物通过抽滤收集，依次用丙酮、蒸馏水清洗至中性后 干燥，然后用乙腈-乙酸-水混合溶液进行索氏提取，再以甲醇索提，真空干燥后得到目标 产物分子印迹聚合物微球（GGAKacR-MIP)。
[0020] 所述硅胶微球的粒径为10-80微米，孔径为100-300A;硅胶活化所用的盐酸溶液中 蒸馏水与盐酸的体积比为1 :1 ;硅胶微球与盐酸溶液的用量比为0. Ig :lmL。
[0021] 所述活化后硅胶与3-氨丙基三乙氧基硅烷反应中，活化后硅胶、甲苯与3-氨丙基 三乙氧基硅烷的用量比为4. 5g :45mL :5. 3mL。
[0022] 所述戊二醛溶液的浓度为2. 6mol/L ;磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mmol，pH为7. 0 ; 氨丙基键合硅胶、戊二醛溶液与磷酸盐缓冲溶液的用量比为4. 5g :2. OmL :25mL。
[0023] 所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mmol，pH为7. 0 ;多肽、磷酸盐缓冲溶液与醛基键 合硅胶的用量比为80. Omg :20mL :2. 0g。
[0024] 所述TFA溶液的浓度为80v%，多肽固载硅胶与TFA溶液的用量比为2. Og :15mL。
[0025] 所述功能单体为三氟代甲基丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺；交联剂为Ν' N-乙烯 基双丙烯酰胺或Ν' N-亚甲基双丙烯酰胺；引发剂为过硫酸铵；磷酸盐缓冲溶液的浓度为 20mmol，pH为7.0 ;以Ν' N-亚乙基双丙烯酰胺为交联剂时，功能单体、交联剂、引发剂与磷 酸盐缓冲液的用量比为126mg :219mg :10. 3mg :1. 5mL，以Ν' N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂 时，功能单体、交联剂、引发剂与磷酸盐缓冲液的用量比为126mg :30mg :6. Omg :1. 5mL。
[0026] 所述GGAKacR印迹硅胶、丙酮与HF溶液的用量比为0. 5g : IOmL :1. 5mL。
[0027] 所述乙腈-乙酸-水混合溶液中乙腈、乙酸与蒸馏水的体积比为5 :5 :90。
[0028] 本发明的优点是：该分子印迹聚合物微球对于含有乙酰化K16的组蛋白H4水解后 的肽段（GGAKacR)具有很好的识别能力及选择性，可以用于组蛋白H4水解样品中含有乙酰 化K16的标记肽段的选择性富集及测定；同时由于印迹位点在材料表面，该分子印迹聚合 物微球也能够对于C端含有GGAKacR序列的长链肽段进行选择性提取，在加标组蛋白水解 样品的提取实验中，这种分子印迹微球对于GGAKacR的回收率达到80%以上，可以在组蛋 白H4-K16乙酰化的测定中发挥作用。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 图1为印迹聚合物微球的扫描电镜图。
[0030] 图2为印迹聚合物微球及非印迹微球对于印迹分子GGAKacR的平衡吸附等温线。
[0031] 图3为印迹聚合物微球对印迹分子GGAKacR及其类似物的吸附量比较图。
[0032] 图4为印迹聚合物微球对印迹分子GGAKacR及其类似物的液相色谱分离图。
[0033] 图5为加标组蛋白酶解液及经过印迹聚合物微球吸附后的洗脱液的质谱图。
[0034] 图6为加标组蛋白酶解液及经过印迹聚合物微球吸附后的洗脱液的液相色谱图， 图中：H4-K12/16Ac 代表 GLGKacGGAKacR。

【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所采用试剂均为分析纯；药品为标准品或对照品。
[0036] 实施例：
[0037] 一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球，是以三氟代甲基丙烯 酸为单体、Ν' N-乙烯基双丙烯酰胺为交联剂的交联高分子聚合物，粒径为20微米，聚合物 表面带有识别GGAKacR以及C端含有GGAKacR肽段的长链多肽的结合位点；微球材料对 于GGAKacR有很好的选择性，作为吸附材料，分子印迹聚合物微球在磷酸盐缓冲液中对于 GGAKacR的吸附容量约为50 μ mol · g4左右；微球材料对于印迹分子的印迹因子为2. 5， 印迹因子由IF = QMIP/QNIP计算，其中Qmip是分子印迹聚合物对于印迹分子的饱和吸附容量 (μ mol ?g4) ,Qnip为非印迹聚合物对于印迹分子的饱和吸附容量（μ mol ;以分子印迹 聚合物微球作为色谱固定相，以浓度为20mM、pH = 7. 0的磷酸盐缓冲液为流动相，印迹分子 GGAKacR的保留因子为5. 9,由液相色谱测定分子印迹材料的选择性因子α彡1. 7,选择性 因子由α =1ν\计算，其中，Ic1为印迹分子的保留因子，kx为其类似物的保留因子。
[0038] -种所述识别分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹聚合物微球的制备 方法，包括如下步骤：
[0039] 1、硅胶表面接枝双官能团戊二醛
[0040] 1)将粒径为20微米、平均孔径为170 A，比表面为232m2/g的硅胶微球4.5g加入 至Ij IOOmL圆底烧瓶中，加入盐酸水溶液（盐酸/水体积比为1:1)，120°C下回流7h后过滤洗 涤，先用蒸馏水洗至中性，再用丙酮清洗1次，最后于90°C真空干燥12h，得到活化后硅胶；
[0041] 2)将4. 5g上述活化后硅胶与45mL干燥甲苯混合，然后加入3-氨丙基三乙氧基 硅烷5. 3mL，在氮气保护下回流12h，反应完成后依次用甲苯、丙酮、蒸馏水、丙酮洗涤，最后 于60°C下真空干燥12h，得到氨丙基键合硅胶（Sil-NH 2),通过元素分析中氮元素含量的增 加计算，氨丙基的接枝密度为5. 1 μ mol · πΓ2 ;
[0042] 3)将4. 5g氨丙基键合硅胶（Sil-NH2)和2. OmU浓度为2. 6mol/L的戊二醛溶液 加入25m L新配制的20mM、pH 7. 0的磷酸盐缓冲溶液中并混合均匀，30°C下水浴6h，反应 完成后抽滤，先用蒸馏水清洗至完全去除未反应的戊二醛，再用丙酮清洗1次，将得到铁锈 红色微球于60°C下真空干燥12h，得到醛基键合硅胶（Sil-CHO)，通过元素分析中碳元素含 量的增加计算，醛基的接枝密度为3. 6 μ mol · πΓ2 ;
[0043] 2、在硅胶表面键合印迹分子
[0044] 1)将80. Omg带有保护基团的多肽（GGAKacRpbf)溶于20mL新配制的20mM、pH 7. 0的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入2. Og醛基键合硅胶（Si 1-CH0)，在振荡器中25°C下震荡 24h，反应完成后用缓冲溶液和蒸馏水洗涤各1次，真空干燥后，得到多肽固载硅胶；
[0045] 2)将上述2. Og多肽固载硅胶与15mL、80vt%的三氟乙酸（TFA)溶液混合并于室 温搅拌以脱去精氨酸的保护基团，经砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗至中性，最后无水乙醇 清洗后于60°C下真空干燥备用，得到GGAKacR固载硅胶（Sil-GGAKacR);
[0046] 3、分子印迹聚合物微球的合成
[0047] 1)将功能单体三氟代甲基丙烯酸、交联剂Ν' N-乙烯基双丙烯酰胺和引发剂过硫 酸铵溶于磷酸盐缓冲液中，配置成预聚合溶液，功能单体、交联剂、引发剂与磷酸盐缓冲液 的用量比为 126mg :219mg :10. 3mg :1. 5mL ;
[0048] 2)将GGAKacR固载硅胶浸入预聚合溶液中，室温下静置3h，取出后用乙醇快速冲 洗后转移至锥形容器中，通氮气除氧后密封，置于烘箱中在45°C下反应24h，将得到的微球 转移到锥形容器中，加入IOmL丙酮，再加入40wt %的HF溶液I. 5mL，冰浴条件下放置Ih后 室温震荡12h，得到溶解硅胶后的印迹聚合物；
[0049] 3)将溶解硅胶后的印迹聚合物通过抽滤收集，依次用丙酮、蒸馏水清洗至中性后 干燥，然后用体积比为5 :5 :90的乙腈-乙酸-水混合溶液进行索氏提取，再以甲醇索提，真 空干燥后得到目标产物分子印迹聚合物微球（GGAKacR-MIP)。
[0050] 图1为印迹聚合物的扫描电镜图，在扫描电镜图中，印迹聚合物为球形，粒径约为 20微米，与硅胶形貌相近，说明以硅胶为牺牲介质的聚合取得成功。
[0051] 非印迹聚合物微球（NIP)的合成除了采用醛基键合硅胶（Sil-CHO)取代GGAKacR 固载硅胶外，其他条件同印迹聚合物微球的合成。
[0052] 4、分子印迹聚合物微球（GGAKacR-MIP)的评价：
[0053] 1)平衡吸附法评价分子印迹聚合物GGAKacR-MIP的亲和能力
[0054] 以平衡吸附法测定印迹聚合物对于印迹多肽GGAKacR的吸附能力。通过比较印迹 及非印迹聚合物对于GGAKacR的吸附量（Q)及计算印迹因子（IF),评价印迹聚合材料对于 印迹多肽及与其结构类似的多肽的亲合力及印迹效果。
[0055] 称取5mg实施例中所得GGAKacR-MIP 10份置于吸附瓶中，分别加入不同浓度 (0· I - 2. Ommol ·〇 的 GGAKacR 溶液，溶液以 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（20mM，pH 7. 0)为溶 剂配制，吸附混合物置于水浴振荡器中，室温下震荡吸附24h。离心分离，取上清液进行液 相色谱检测，液相色谱条件为：色谱柱=Phenomenex C18, 10 μ m，250 X 4. 6mm，流动相：乙腈 /水（7/93,体积比），含0. 1 % TFA水溶液，流速：I. OmL/min，检测波长：205nm。聚合物对于 多肽的吸附容量以Q = (Ctl-C) V/W计算，式中Q:吸附量；Q1:吸附前溶液中多肽的浓度；C: 吸附后溶液中多肽的浓度；W :GGAKacR-MIP的质量；V:吸附液加入的体积。
[0056] 图2为为印迹及非印迹聚合物微球对于印迹分子GGAKacR的平衡吸附等温线， 结果表明：印迹聚合物对于GGAKacR的吸附量明显高于非印迹聚合物，GGAKacR-MIP对于 GGAKacR的饱和吸附量是非印迹聚合物（NIP)的2. 5倍，即印迹因子IF = 2. 5,说明印迹聚 合物的结合来自于印迹效果。
[0057] 2)平衡吸附法评价分子印迹聚合物GGAKacR-MIP的选择性
[0058] 选取 GGVKacR，GGAKR，GGAK，GLGKacGGAKacR，和 GGKacGLGKacGGAKacR 作为印迹分 子GGAKacR的结构类似物进行选择性评价。以GGAKacR和其结构类似物分别配置吸附溶液 [浓度均为I. Omm0l/L，Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（20mM，pH 7. 0)为溶剂]。分别称取5mg实 施例3中所得GGAKacR-MIP (或NIP)置于吸附瓶中，分别加入不同的多肽吸附溶液2. OmL， 密封后置于水浴振荡器中，室温下震荡吸附24h。吸附完成后，离心分离，取上清液进行液相 色谱检测，
[0059] 液相色谱条件为：色谱柱：Phenomenex C18, 10 μ m, 250X4. 6mm，流动相A :含 0· 1% TFA水溶液，流动相B :含0· 1% TFA乙腈溶液。梯度洗脱：0-6min，1-7% B ;6-8min， 7% B ;8-15min，7-15% B ;15-25min，15-35% B ;流速：1. OmL/min，检测波长：205nm。
[0060] GGAKacR-MIP对于各种多肽的吸附容量以Q = (Ctl-C) V/W计算，式中Q:吸附量；Ctl: 吸附前溶液中多肽的浓度；C:吸附后溶液中多肽的浓度；W :GGAKacR-MIP的质量；V:吸附 液加入的体积。多肽在NIP上的吸附量以相同方法进行测定。GGAKacR-MIP的印迹选择性 由IS = QMIP/QNIP计算，其中Qmip是多肽在MIP上的吸附量（μ mol · g-1)，Qnip为多肽在NIP 上的吸附量（μ mol · g_〇。图3为印迹聚合物对印迹分子GGAKacR及其类似物平衡吸附的 吸附容量比较图。图中表明：比较GGAKacR-MIP和NIP对于印迹分子及类似物的吸附量（图 3)可以看出，印迹材料对于印迹分子（GGAKacR)的吸附量和印迹选择性最高，其次是C端含 有GGAKacR肽段的长链多肽（GLGKacGGAKacR和GGKacGLGKacGGAKacR)。而对于其它的类似 物（GGVKacR，GGAKR，GGAK)，吸附量及印迹选择性都偏低。
[0061] 3)液相色谱法测定GGAKacR-MIP的选择性
[0062] 分别以GGAKacR-MIP和NIP作为色谱固定相，以色谱法对于印迹聚合物的性能进 行测定。
[0063] 将实施例中合成的分子印迹聚合物微球GGAKacR-MIP及非分子印迹聚合物微球 NIP在抽真空条件下，采用湿法装柱的方法分别填入规格为20 X 3. Omm的不锈钢色谱柱中， 用磷酸盐缓冲液（pH 7.0)平衡色谱柱后，分别测试GGAKacR及类似物在色谱柱上的保留。
[0064] 图4为印迹聚合物对印迹分子GGAKacR及其类似物的液相色谱分离图。
[0065] 液相色谱条件为：流动相：磷酸盐缓冲液（20mM，pH = 7. 0)，流速：0. lmL/min，检 测波长：205nm。样品为 GGAKacR, GGVKacR, GGAKR, GGAK, GLGKacGGAKacR, GGKacGLGKacGGAKa cRo
[0066] GGAKacR-MIP对于各个多肽的保留因子及选择性列于表1，保留因子由k = (VtciVtci计算，其中，&为被分析物的保留时间，h为死时间（用丙酮测定）。选择性因子 由 α = ki/kx计算，其中，ki为印迹分子的保留因子，1^为其类似物的保留因子。通过比 较GGAKacR及类似物多肽的保留因子，可以看出，GGAKacR-MIP对于印迹分子GGAKacR以及 含有 GGAKacR 肽段的 GLGKacGGAKacR, GGKacGLGKacGGAKacR 有很好的选择性。
[0067] 表1分子印迹聚合物对于GGAKacR及其类似物多肽的保留因子及选择性

【权利要求】
1. 一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球，其特征在于：是以三氟代 甲基丙烯酸为单体、N'N-乙烯基双丙烯酰胺为交联剂的交联高分子聚合物，粒径为20微 米，聚合物表面带有识别GGAKacR以及C端含有GGAKacR肽段的长链多肽的结合位点；微 球材料对于GGAKacR有很好的选择性，作为吸附材料，分子印迹聚合物微球在磷酸盐缓冲 液中对于GGAKacR的吸附容量为50ymol?g4左右；微球材料对于印迹分子的印迹因子 彡2. 5,印迹因子由IF=QMIP/QNIP计算，其中QMIP是分子印迹聚合物对于印迹分子的吸附容 量〇mol士1)，QNIP为非印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量〇mol^1);以分子印迹聚 合物微球作为色谱固定相，以磷酸盐缓冲液（20mM，pH= 7. 0)为流动相，印迹分子GGAKacR 的保留因子为5. 9,由液相色谱法测定的分子印迹材料的选择性因子a>1.7,选择性因子 由a=ki/kx计算，其中，ki为印迹分子的保留因子，kx为其类似物的保留因子。
2. -种如权利要求1所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备 方法，其特征在于包括如下步骤： 1、 硅胶表面接枝双官能团戊二醛； 1) 将硅胶微球与盐酸溶液混合，120°C下回流7h后过滤洗涤，先用蒸馏水洗至中性，再 用丙酮清洗1次，最后于90°C真空干燥12h，得到活化后硅胶； 2) 将上述活化后硅胶与干燥甲苯混合，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气保护 下回流12h，反应完成后依次用甲苯、丙酮、蒸馏水、丙酮洗涤，最后于60°C下真空干燥12h， 得到氨丙基键合硅胶（Sil-NH2); 3) 将氨丙基键合硅胶（Sil-NH2)和戊二醛溶液加入磷酸盐缓冲溶液中并混合均匀，在 30°C下反应6h，反应完成后抽滤，先用蒸馏水清洗至完全去除未反应的戊二醛，再用丙酮清 洗1次，将得到铁锈红色微球于60°C下真空干燥12h，得到醛基键合硅胶（Sil-CHO); 2、 在硅胶表面键合印迹分子 1) 将多肽（GGAKacRpbf)溶于新配制的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入醛基键合硅胶 (Sil-CHO)，在振荡器中25°C下震荡24h，反应完成后用缓冲溶液和蒸馏水洗涤各清洗1次， 真空干燥后，得到多肽固载硅胶； 2) 将上述多肽固载硅胶与三氟乙酸（TFA)溶液混合并于室温搅拌以脱去精氨酸的保 护基团，经砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗至中性，最后无水乙醇清洗后于60°C下真空干燥 备用，得到GGAKacR固载硅胶（Sil-GGAKacR); 3、 分子印迹聚合物微球的合成 1) 将功能单体、交联剂和引发剂溶于磷酸盐缓冲液中，配置成预聚合溶液； 2) 将GGAKacR固载硅胶（Sil-GGAKacR)浸入预聚合溶液中，室温下静置3-4h，取出后 用乙醇快速冲洗后转移至锥形容器中，通氮气除氧后密封，置于烘箱中在45°C下反应24h， 将得到的微球转移到锥形容器中，加入10mL丙酮，再加入40wt%的HF溶液1. 5mL，冰浴条 件下放置lh后室温震荡12h，得到溶解硅胶后的印迹聚合物； 3) 将溶解硅胶后的印迹聚合物通过抽滤收集，依次用丙酮、蒸馏水清洗至中性后干燥， 然后用乙腈-乙酸-水混合溶液进行索氏提取，再以甲醇索提，真空干燥后得到目标产物分 子印迹聚合物微球（GGAKacR-MIP)。
3.根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方 法，其特征在于：所述硅胶微球的粒径为10-80微米，孔径为100-300A，盐酸溶液中蒸馏水 与盐酸的体积比为1 :1 ;硅胶微球与盐酸溶液的用量比为0.lg:lmL。
4. 根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方 法，其特征在于所述活化后硅胶、甲苯与3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为4. 5g:45mL: 5. 3mL〇
5. 根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方 法，其特征在于所述戊二醛溶液的浓度为2. 6mol/L;磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mmol，pH 为7. 0 ;氨丙基键合硅胶、戊二醛溶液与磷酸盐缓冲溶液的用量比为4. 5g:2.OmL:25mL。
6. 根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方 法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为20mmol，pH为7. 0 ;多肽、磷酸盐缓冲溶液与 醛基键合硅胶的用量比为80.Omg:20mL:2. 0g。
7. 根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方 法，其特征在于：所述TFA溶液的浓度为80v%，多肽固载硅胶与TFA溶液的用量比为2.0g: 15mL〇
8. 根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备 方法，其特征在于：所述功能单体为三氟代甲基丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺；交联剂为 N'N-乙烯基双丙烯酰胺或N'N-亚甲基双丙烯酰胺；引发剂为过硫酸铵；磷酸盐缓冲溶液 的浓度为20mmol，pH为7.0 ;以N'N-亚乙基双丙烯酰胺为交联剂时，功能单体、交联剂、弓丨 发剂与磷酸盐缓冲液的用量比为126mg:219mg:10. 3mg:1. 5mL，以N'N-亚甲基双丙烯酰 胺为交联剂时，功能单体、交联剂、引发剂与磷酸盐缓冲液的用量比为126mg:30mg:6.Omg: 1. 5mL〇
9. 根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方 法，其特征在于：所述GGAKacR印迹硅胶、丙酮与HF溶液的用量比为0. 5g:10mL:1. 5mL。
10. 根据权利要求2所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方 法，其特征在于：所述乙腈-乙酸-水混合溶液中乙腈、乙酸与蒸馏水的体积比为5 :5 :90。 所述乙腈-乙酸-水混合溶液中乙腈、乙酸与蒸馏水的体积比为5 :5 :90。
【文档编号】C07K1/14GK104403043SQ201410771065
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】董襄朝, 杨芳芳 申请人:南开大学