专利名称：药用组合物及其制备和应用的制作方法
寻找具有抗病毒作用的药物的基础是在感染的有机体中存在病毒特有的代谢过程。包括HIV(人类免疫缺乏病毒)在内的逆转录病毒在感染过程中需要有依赖RNA的DNA聚合酶的作用，以便把该种酶以RNA形式编码的遗传信息转录成DNA，DNA能整合到宿主基因组中并可通过适当的宿主酶转变成有活性的基因产物。逆转录酶(RT)是感染病毒颗粒的成分，正常情况下在人和动物体内一般是找不到的。因此对逆转录病毒病和HIV感染晚期的获得性免疫缺乏综合症(AIDS)的化学治疗，RT是合适的攻击点。
已知硫酸酯化多糖可以抑制细胞培养物中逆转录病毒的生长(KlementandNicolsoninMormoroschandKoprowski，MethodsinVirologyⅥ，(1977)60～103)。这些物质是RT非常有效的抑制剂。这些物质的实例之一是戊聚糖多硫酸酯-每个糖单元有至多2个硫酸酯基团的1，4-连接的吡喃糖聚合物，即下式化合物
n为结构单元的数目上述化合物的副作用包括抑制血液凝固和损伤头发生长。
已知有许多其它物质能够抑制由RT催化反应的不同步骤(De Clerq and BalzariniAntiviral Research Suppl.l(1985)89～94)。有些上述物质迄今已经临床试验，但很少有成功的，这些物质中有苏拉明(具有下式的化合物)、多聚偶锑基钨酸(polyant imonotun gstic acid，(NH4)18(NaW21Sb9O86)17)和膦酰基甲酸((OH)2(O)PCOOH)。
在临床试验中证实具有治疗作用的第一个化合物是具有下式的合成核苷3′-叠氮基-3′-脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)Yarchoan等TheLancet575～580(1986))，
但缺点是与严重的副作用有关，它不能用于慢性治疗，而根据现有的知识认为慢性治疗是必需的。
现在惊奇地发现，与至少一种黄嘌呤衍生物并用可以明显地增加硫酸酯化多糖类的作用。
黄嘌呤是具有下式的化合物，
和黄嘌呤衍生物并用意指与不并用上述黄嘌呤衍生物相比，按较小的剂量服用硫酸酯化多糖就可以获得相同的效果。该类剂型具有使硫酸酯化多糖的副作用相应降低的优点。上述剂型适用于慢性治疗。
因此，本发明是关于含有下述成分的药用组合物a)至少有一种硫酸酯化多糖，和b)至少有一种黄嘌呤衍生物，或者由多种上述成分构成。在这方面，硫酸酯化多糖可以是游离酸的形式，即连接O-SO3H基团，或是生理上可以耐受的盐的形式，最好为铵盐或碱金属盐，即带有O-SO3A基团(A为铵或碱金属)。
为了实行本发明，原则上可以应用任何所需的硫酸酯化多糖作为成分a)。较好的化合物是葡聚糖多硫酸酯，果聚糖多硫酸酯和戊聚糖多硫酸酯，最好的是戊聚糖多硫酸酯。
硫酸酯化多糖的平均分子量可以在较大的范围。约为1，000～20，000道尔顿较好，最好为5，000～12，000道尔顿，尤其是约6，000道尔顿。
多糖OH基团硫酸酯化的程度，即每个单糖单元硫酸酯基团的平均数目可以在较大范围内变动。多糖OH基团硫酸酯化的程度以实有OH基团的大约20%～100%较好，最好为大约80%～95%，尤其是约90%。
原则上可以应用任何所需的黄嘌呤衍生物或它们的混合物作为本发明组合物的成分b)。最好的黄嘌呤衍生物来源于以下化合物b1)式Ⅰ化合物
式中基团R1和R3中之一代表含3～8个碳原子的(ω-1)-氧代烷基或(ω-1)-羟烷基、直链烷基，其它二个基团R2和R3或R1和R2代表在位置R1和R3上含有1～8个碳原子的直链或带支链的烷基，在位置R2上含有1～4个碳原子的直链或带支链的烷基，并且在上述二个烷基取代基中碳原子总数至多为10，b2)式Ⅱ化合物
式中R表示有1～4个碳原子的烷基，b3)式Ⅲ化合物，
式中基团R4和R6中至少一个代表下式叔羟烷基，
其中R7表示有至多3个碳原子的烷基，n表示整数2～5。如果基团R4或R6中只有一个代表上述式Ⅲa叔羟烷基，则另一个基团代表氢原子或有至多6个碳原子的脂肪族烃基R，并且基团R8的碳链可以被至多2个氧原子间隔，或被一个氧基或至多2个羟基取代(基团R8中的氧基或羟基最好以至少2个碳原子使其与氮分开)，R5表示有1～4个碳原子的烷基，b4)式Ⅰ～Ⅲ化合物的药物前体形式，和/或b5)式Ⅰ～式Ⅲ化合物的代谢物。
上述化合物中，特别好的式Ⅰ化合物在位置R1或R3上有己基、5-氧代己基或5-羟己基。这些化合物特别是包括1-己基-3，7-二甲基黄嘌呤，1-(5-羟己基)-3，7-二甲基黄嘌呤，3，7-二甲基-1-(5-氧代己基)黄嘌呤，7-(5-羟己基)-1，3-二甲基黄嘌呤，1，3-二甲基-7-(5-氧代己基)黄嘌呤，1-(5-羟己基)-3-甲基-7-丙基黄嘌呤和3-甲基-1-(5-氧代己基)-7-丙基黄嘌呤，特别是3，7-二甲基-1-(5-氧代己基)黄嘌呤(即己酮可可碱)其中以R5代表甲基或乙基的式Ⅲ化合物特别好。其中R4或R6二个基团中只有一个代表上述定义的叔羟烷基的式Ⅲ化合物同样是特别好的。较好的还有其中R7代表甲基和n为整数3～5，结果叔羟烷基Ⅲa或者代表[(ω-1)-羟基-(ω-1)-甲基]-戊基、[(ω-1)-羟基-(ω-1)-甲基]-己基或者代表[(ω-1)-羟基-(ω-1)-甲基]-庚基的化合物，尤其以其中R5代表甲基或乙基的化合物更好。
此外，特别需要强调的是式Ⅲ中R表示叔羟烷基，R表示在每种情况下均有1～4个碳原子的烷基、羟烷基或烷氧基烷基的化合物，例如7-乙氧基甲基-1-(5-羟基-5-甲基己基)-3-甲基黄嘌呤。
此外，本发明的具体内容还包括，从应用的式Ⅰ和Ⅱ的氧代烷基黄嘌呤或者式Ⅰ和Ⅲ的羟烷基黄嘌呤中，以药物前体形式而不是以其本身，在有机体内通过生物转化可以释放出治疗上有效的，具有在式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中所定义的取代基的黄嘌呤类化合物。适用于上述目的的有例如其中羰基由式Ⅳ结构取代的缩醛化的氧代烷基黄嘌呤，
以及其中羟基以式Ⅴ结构取代的O-酰化的羟烷基黄嘌呤，
并且R9和R10代表在每种情况下有至多4个碳原子的烷基，或者在一起共同代表二亚甲基、三亚甲基或四亚甲基，R11代表有至多4个碳原子的烷基或有选择取代的苯基或吡啶基。
在本发明的组合物中成分a)与成分b)的重量比可以在较大的范围内变动。成分a)与成分b)的重量比约为1∶100～100∶1较好，最好为1∶10～30∶1。
为了治疗或预防由病毒，尤其是逆转录病毒引起的疾病，本发明的组合物可以按多种方式服用。例如，它们可以按连续滴注的形式从静脉、肌内、腹膜内、皮下给药，或者口服给药。在急性病理的情况下，最好以连续滴注形式给药。对于慢性疗法，按口服给药。
将至少一种硫酸酯化多糖和至少一种黄嘌呤衍生物，如果合适还可以有添加剂和/或辅助剂转变成合适的剂型，从而制得本发明组合物。添加剂或辅助剂来自于载体、防腐剂和其他常用的辅助剂。可以用于口服剂型的辅助剂的实例有淀粉(例如马铃薯淀粉，玉米淀粉或小麦淀粉)、纤维素或其衍生物，尤其是微晶纤维素、二氧化硅、各种糖(例如乳糖)、碳酸镁和/或磷酸钙。将能够改进药物耐受性的辅助剂，例如分泌粘液剂或树脂加到口服剂型中更是有益的。以肠溶胶囊的形式给药，也可以改进服用者对药物的耐受性。此外，将缓释剂，如果合适可以将例如以纤维素或聚苯乙烯树脂或离子交换树脂为基础制得的渗透膜加到剂型中，或者加到组合物的一种成分中也是有益的。
本发明组合物应用的剂量随各种因素，例如药物的剂型、病人的疾病情况和体重而改变。但是对于短期给药，按每天约800mg硫酸酯化多糖和约800mg黄嘌呤衍生物的剂量可能是过剩的。在各种情况下每天的剂量最好为约100～600mg硫酸酯化多糖和约75～600mg黄嘌呤衍生物。通过试验来研究组合物和具体组合的有效成分的剂量更为合适。这些试验可以按体外试验(例如参见后面叙述的效果试验Ⅰ)和体内试验(例如参见后面叙述的效果试验Ⅱ)进行。
本发明组合物所需的有效成分可以按下述方法制备1)硫酸酯化多糖成分a)有些硫酸酯化多糖是可以买得到的(例如戊聚糖多硫酸酯(SP54)，平均分子量约为600道尔顿，硫酸酯化的程度约为90%，由benechemieGmbH，8000Munich71，Herterichstrasse1制备)，硫酸酯化多糖还可以按下述方法制备(R，L，Whistler，Meth.Carbohydr.Chem.Ⅳ，426～429(1972))例如于约15℃～17℃将三氧化硫滴加到搅拌的约4倍体积的DMSO中，首先制备DMSO/三氧化硫配合物。然后加入溶剂，最好为二氯甲烷(最好为三氧化硫体积的4倍)。将产生的固体配合物滤出，然后干燥。需要硫酸酯化的多糖(例如可以按Meth.Carbohydr.Chem.Ⅳ(1972)[1]-[4]，[7]中的叙述制备)溶于溶剂(例如DMSO)中，将以上制得的配合物最好于大约15℃～17℃加入。各个多糖进行特定程度硫酸酯化所需要配合物的数量可以由试验决定。在加入冰水并且溶液用碱金属氢氧化物中和之后，例如通过加入甲醇，可以使硫酸酯化产物析出。进一步纯化生成的产物是方便的;特别有利的纯化方法是层析分离和凝胶过滤，这些纯化方法还具有区分硫酸酯化程度以及分子量的作用。
2)黄嘌呤衍生物成分b)同样，有些黄嘌呤衍生物也是可以买到的(例如RTrental，有效成分为己酮可可碱，可以由Hoechst AG，Frankfurt买到)，黄嘌呤衍生物也可以制得，例如对于各种具体化合物可以按DE-B1，233，405或DE-B1，235，320所述方法制备。
下述制备实例的目的在于详细叙述本发明。
实例1适合于口服并含有下列成分的片剂是按本身已知的方法，将有效成分和辅助剂制成颗粒，然后压制成片剂。这些片剂适用于抗病毒治疗，每天服用3～4次，每次1片。
每片的成分重量戊聚糖多硫酸酯钠盐，100mg平均分子量为6，000道尔顿硫酸酯化程度为90%己酮可可碱50mg乳糖150mg玉米淀粉50mg滑石粉6mg胶体二氧化硅6mg硬脂酸镁4mg实例2适合于口服的胶囊剂含有下述成分，并可以按本身已知的方法，将有效成分和辅助剂混合并分装到明胶囊中而制得。这些胶囊剂用于抗病毒治疗，每天服用2～4次，每次1粒。
每粒胶囊的成分重量戊聚糖多硫酸酯钠盐，150mg平均分子量为6，000道尔顿硫酸酯化程度为90%己酮可可碱75mg乳糖200mg滑石粉10mg胶体二氧化硅10mg
实例3适合于注射的有效成分溶液剂含有下述成分，并可以按本身已知的方法，将各种成分放在一起混匀并分装入消毒过的安瓿内，用橡皮帽封口而制得。该注射溶液剂用于抗病毒治疗，每天的剂量为1～2个注射单位(1个注射单位为1安瓿)。
各个安瓿的成分重量戊聚糖多硫酸酯钠盐，150mg平均分子量为6，000道尔顿硫酸酯化程度为90%己酮可可碱25mg氯化钠50mg对羟苯甲酸甲酯5mg无菌水5mg效果试验Ⅰ)对细胞培养的人体免疫缺乏病毒(HIV)的效果为试验各种组合物对于HIV复制的抑制作用，首先用梯度离心从新鲜的人血中分离出淋巴细胞，并向含有10%小牛血清的RPMI1640培养基(细胞培养底物为氨基酸、维生素、无机物和缓冲物质的混合物，参见G.E.Moore等J.A.M.A.199，519(1967))中加入刺激淋巴细胞生长的植物凝血素(有效化合物是以N-乙酰基半乳糖胺为基础的，并可以从普通菜豆属(PhaseolusVulgaris)得到)，然后将淋巴细胞加到含有20I.U./ml重组体白细胞介素-2(Kulitz等DrugRes.35，1607(1985))的完全RPMI培养基(完全RPMI培养基＝RPMI1640+小牛血清)中，于37℃培养3天。经过刺激的淋巴细胞分装入容器，贮藏在液氮中。试验时，将细胞解冻，在含重组体白细胞介素-2的完全RPMI培养基中培养3～4天。感染时，使该细胞与HIV感染的细胞培养物中无细胞的上清液混合，并培养30分钟。将感染的细胞洗涤一次，然后放入含有白细胞介素-2的完全RPMI培养基中，加入适当浓度的试验物质，种入24孔培养板。于37℃培养3天后，从每孔吸出一半培养基，继之加入含有活性物质的新鲜培养基。感染后第4天，用显微镜检查，评价细胞培养物。根据合体细胞的数量和大小评价病毒复制程度。每个活性物质的浓度列入表1中，此表注明了各个化合物抑制合体细胞形成的观察结果。表1表明，将一定量的黄嘌呤衍生物加到适量的硫酸酯化多糖中，所有试验的硫酸酯化多糖均可以抑制合体细胞形成，而单用硫酸酯化多糖是无效的。这一结果证实，加入黄嘌呤衍生物可以增加硫酸酯化多糖的作用。
表1抑制合体成分a)浓度μg/ml成分b)浓度μg/ml细胞形成果聚搪多硫酸酯钠盐，10己酮可可碱-否平均分子量为8，00020-否道尔顿，硫酸酯化程50-是度为100%105否1025否10100否25己酮可可碱5否″2525是25100是100否葡聚糖多硫酸酯钠盐，10己酮可可碱5否平均分子量为8，0001025否道尔顿，硫酸酯化程度10100否度为80%255否2525否25100是-100否表1(续)抑制合体成分a)浓度μg/ml成分b)浓度μg/ml细胞形成戊聚糖多硫酸酯101-(5-羟己基)5否(SP54)，钠盐，10-3-甲基-7-25否平均分子量为6，00010丙基黄嘌呤100是道尔顿，硫酸酯化程-100否度为90%-己酮可可碱100否5-否51否510否″5100否10-否101否1010是10100是25己酮可可碱-是251是″2510是25100是-100否
Ⅱ)戊聚糖多硫酸酯(SP54)对于小白鼠感染逆转录病毒的效果由于对人感染的HIV没有合适的实验室感染动物模型，因此，为了检验化学治疗剂的效果，必须用其它逆转录病毒感染。如果根据对RT活性的特定阻断作用，在体内研究病毒复制的抑制作用，那么选择该类型的替代模型是恰当的。在本试验中，选用弗云德白血病病毒。
为此，用含有弗云德病毒的小白鼠血清，通过静脉注射感染正常的实验小白鼠(NMRI-NavalMedicalResearchlnstitute)。未经治疗的对照动物，二周内脾和肝明显增大，以此作为感染的标志。在感染后48小时开始治疗，持 0天。在试验进行的第14天，用脊椎动物颈椎脱位法处死动物，取出脾并称重。治疗组动物的脾重量与未经治疗的感染对照组动物的脾重量作为评价治疗效果的参数。
生长良好而未经感染的实验小白鼠(20～24g体重)的脾不到体重的1%，而试验结束时，感染动物的脾达体重的10%。用苏拉明治疗降低了脾的增长，经统计学处理P＜0.05。单独给戊聚糖多硫酸酯，也有显著的作用。用所研究的动物模型试验，单独服用葡聚糖多硫酸酯和与己酮可可碱并用，也都有效，由于动物数较少，因此没有用戊聚糖多硫酸酯进行比较。与单独用戊聚糖多硫酸酯治疗相比，将戊聚糖多硫酸酯与己酮可可碱合并使用，减少了脾大的程度。己酮可可碱对感染过程没有任何作用。
给以戊聚糖多硫酸酯的小白鼠死亡率较高是由于注射药物时刺伤而引起出血所致，这在小试验动物中经常发生。在较大的试验动物和人中，因注射针头刺伤而导致出血死亡的危险是很少有的。
表Ⅱ戊聚糖多硫酸酯(SP54)与己酮可可碱(Trental)并用对于小白鼠弗云德病毒感染的治疗效果产物剂量相对于体重的存活数/显著性脾重量(%)组数对照-9.22±2.767/71.0苏拉明10×1.0mg4.8±0.967/7＜0.05戊聚糖多硫酸酯20×0.25mg5.67±2.857/70.017戊聚糖多硫酸酯20×1.0mg5.88±3.402/70.094己酮可可碱20×0.04mg8.32±1.457/70.232己酮可可碱20×0.4mg9.45±2.07/70.428己酮可可碱20×1.0mg9.08±2.367/70.459戊聚糖多硫酸酯20×0.25mg5.07±2.15/70.009+己酮可可碱20×0.04mg戊聚糖多硫酸酯20×0.25mg2.69±1.673/70.03+己酮可可碱20×0.04mg
权利要求
1.药用组合物，该组合物含有下述成分a)至少一种硫酸酯化多糖，和b)至少一种黄嘌呤衍生物，或者该组合物是由多种上述成分组成。
2.按照权利要求1所述的组合物，其中成分a)含有选自以下一组至少一种硫酸酯化多糖，该组硫酸酯化多糖包括葡聚糖多硫酸酯、果聚糖多硫酸酯和戊聚糖多硫酸酯，尤其是戊聚糖多硫酸酯。
3.按照权利要求1或2的组合物，其中成分a)硫酸酯化多糖的分子量约为1，000～200，000道尔顿，最好约为5000～12，000道尔顿。
4.按照权利要求1～3中一项或一项以上所述的组合物，其中成分a)硫酸酯化多糖中多糖OH基团硫酸酯化的程度约为20～100%，最好约为50～95%，尤其是约90%。
5.按照权利要求1～4中一项或一项以上所述的组合物，其中成分b)黄嘌呤衍生物系选自以下一组化合物b1)式Ⅰ化合物，
其中R1和R3中之一代表含3～8个碳原子的(ω-1)氧代烷基或(ω-1)-羟烷基、直链烷基其他二个基团R2和R3或R1和R2代表在位置R1和R3上含有1～8个碳原子的直链或带支链的烷基，在位置R2上含有1～4个碳原子的直链或带支链的烷基，并且上述二个烷基取代基中碳原子总数至多为10，b2)式Ⅱ化合物，
其中R代表有1～4个碳原子的烷基，b3)式Ⅲ化合物，
其中基团R4和R6中至少一个代表下式叔羟烷基，
其中R7表示有至多3个碳原子的烷基，n表示整数2～5，并且如果基团R4或R6中只有一个代表上述式Ⅲa叔羟基烷基，则另一个基团代表氢原子或有至多6个碳原子的脂肪族烃基R8，并且基团R8的碳链可以被至多2个氧原子间隔，或被氧基或至多2个羟基取代，R5表示有1～4个碳原子的烷基，b4)式Ⅰ Ⅲ化合物的药物前体形式，和/或b5)式Ⅰ～式Ⅲ化合物的代谢物。
6.按照权利要求1～5中一项或一项以上所述的组合物，其中成分b)黄嘌呤衍生物系选自以下一组化合物1-己基-3，7-二甲基黄嘌呤，1-(5-羟己基)-3，7-二甲基黄嘌呤，3，7-二甲基-1-(5-氧代己基)黄嘌呤，7-(5-羟己基)-1，3-二甲基黄嘌呤，1，3-二甲基-7-(5-氧代己基)黄嘌呤，1-(5-羟己基)-3-甲基-7-丙基黄嘌呤，3-甲基-1-(5-氧代己基)-7-丙基黄嘌呤，和/或7-乙氧谆 1-(5-羟基-5-甲基己基)-3-甲基黄嘌呤，尤其是3，7-二甲基-1-(5-氧代己基)黄嘌呤。
7.按照权利要求1所述的组合物，其中成分a)与成分b)的重量比约为1∶10～100∶1，最好约为1∶10～30∶1。
8.按权利要求1～7中一项或一项以上所述的组合物，该组合物可以用作为治疗或预防由病毒，尤其是逆转录病毒所引起的传染性疾病的药物。
9.按照权利要求1～8中一项或一项以上所述的制备药用组合物的方法，该方法包括将至少一种硫酸酯化多糖与至少一种黄嘌呤衍生物，如果合适还可以与添加剂和/或辅助剂一起转变成合适的剂型。
10.按照权利要求1～8中一项或一项以上所述的组合物可以用作为治疗或预防由病毒，尤其是逆转录病毒所引起的传染性疾病。
全文摘要
本发明叙述了含有或者由下述成分组成的组合物，
文档编号C07D473/06GK1031184SQ8810468
公开日1989年2月22日 申请日期1988年7月29日 优先权日1987年8月1日
发明者埃尔玛·赛瑞娜, 伊万·维克勃, 克里斯托弗·米歇尔, 马提斯·亥尔斯伯格 申请人:赫彻斯特股份公司