专利名称：N-(膦酰甲基)甘氨酸的酶催化制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备乙醛酸和氨甲基磷酸(AMPA)混合物及接着制备N-(膦酰甲基)甘氨酸(通常称为草甘膦)的方法。更具体地，本发明涉及一种酶催化方法，该方法包括在有AMPA和催化剂存在的水溶液中使羟基乙酸与氧反应，所述催化剂包括羟基乙酸氧化酶((S)-2-羟基酸氧化酶，EC1、1.3，15)和过氧化氢酶(EC1，11，1.6)，生成含乙醛酸和AMPA的混合物，然后将此混合物就地氢化，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸，该化合物是广谱的后突发性植物生长抑制剂和除莠剂，可用于调节各种植物的生长。
羟基乙酸氧化酶通常存在于绿叶植物和哺乳动物细胞中，它能催化羟基乙酸氧化为乙醛酸，同时生成过氧化氢
N.E.Tolbert等人(J.Biol.Chem.，Vol.181，905-914(1949))首先报道了一种由烟草叶中提取出来的酶，通过形成乙醛酸中间体，这种酶催化了羟基乙酸氧化为甲酸和CO2。某些化合物如乙二胺的加入限制了中间体乙醛酸的进一步氧化。该氧化反应在pH约为8的条件下进行，常用的羟基乙酸的浓度为约3-40mM(毫摩尔)。据报道羟基乙酸氧化的最佳pH为8.9。已报道草酸(100mM)能抑制羟基乙酸氧化酶的催化作用。类似地，K.E.Richardson和N.E.Tobert(J.Biol.Chem.，Vol236，1280-1284(1961))指出含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)的缓冲液抑制了在羟基乙酸氧化酶(催化羟基乙酸的氧化)中草酸的形成。C.O.clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris(J.Biol.Chem.，Vol.178，977-987(1949)报道了催化氧化羟基乙酸与氧的羟基乙酸氧化酶的最佳pH为约7.8-8.6，最佳温度为35-40℃。
I.Zelitch和s.ochoa(J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)及J.C.Robinson等人(J.Biol.Chem，Vol237，2001-2009(1962)报道了在菠菜羟基乙酸氧化酶催化的羟基乙酸的氧化中，甲酸和CO2的形成是由H2O2与乙醛酸的非酶反应产生的。他们观察到，加入能催化H2O2分解的过氧化氢酶，通过抑制甲酸和CO2的生成而大大地提高了乙醛酸的产率。还发现FMN(黄素单核苷酸)的加入极大地增加了羟基乙酸氧化酶的稳定性。
N.A.Frigero和H.A.Harbury(J.Biol.Chem.，Vol.231，135-157(1985)已报道关于由菠菜分离出的羟基乙酸氧化酶的制备和性质。发现纯化的酶在溶液中极不稳定;这种不稳定性被认为是由于黄素单核苷酸较弱地结合在酶活性部位，以及这种酶的具有酶活性的四聚物和/或八聚物分解成酶惰性的单聚物和二聚物，后者不可逆地聚集并沉淀。向此酶溶液中加入FMN极大地增加了酶的稳定性，而且高蛋白浓度或高离子强度保持该酶作为八聚物或四聚物。
关于通过羟基乙酸氧化酶催化的羟基乙酸的氧化还有许多其他的参考文献。在下列参考文献中描述了酶的分离(及一种分析方法)I.Zelitch，MethodsinEnzymology，Vol，1，AcademicPress，NewYork，1955，P.528-532(由菠菜和烟草叶中提取)，M.Nishimura等人，Arch.Biochem.Biophys，Vol，222，397-402(1983)(由南瓜子叶提取)，H.Asker和D.Davies，Biochim.Biophys.Acta，Vol.761，103-108(1983)(由鼠肝提取)，以及M.J.Emes和K.H.Erismann，Int.J.Biochem.Vol.16.1373-1378(1984)(由LemnaMinorL提取)。还报告了这种酶的结构E.Cederlund等人，EurJ.Biochem，Vol，173，523-530(1988)，及Y.Lindquist和C.Branden，J.Biol.Chem，Vol246，3624-3628(1989)。
由氨甲基磷酸和乙醛酸制备N-(膦酰甲基)甘氨酸有许多已知方法。Rogers等人在欧洲专利申请186，648中描述了这样一种方法，它包括乙醛酸或其盐与氨甲基磷酸或其盐缩合，生成一中间产物，通常认为是醛亚胺(席夫碱)，不经分离将该中间产物通过催化氢化还原为N-(膦酰甲基)甘氨酸。Gaertner在美国专利4，094，928中描述了另一方法，它是通过乙醛酸与氨甲基磷酸酯在无水溶剂中反应，分离同样的中间体羰基醛亚胺甲基磷酸酯;在与水共沸蒸馏并除去溶剂之后，还原该羰基醛亚胺甲基磷酸酯，并将酯基水解生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
上述制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法其缺点在于乙醛酸是相当昂贵的起始原料，而其他较便宜的制备所需物质的方法已被实施。现有的制备乙醛酸的方法，如二卤代乙酸的水解，草酸的电解还原、乙二醛的氧化、乙烯或乙醛的催化氧化以及马来酸、其酯或酐的臭氧分解，它们在实施中都存在一种或多种困难，例如昂贵的分离/纯化步骤、低产率、或大量废料流出。Gaertner所述的方法还有一个缺点是它需要额外的步骤(相应地会有产率损失)，而且需要不必要的中间体的分离。
Kleiner在美国专利4，670，191中公开了合成N-(膦酰甲基)甘氨酸的另一方法，它包括氨甲基磷酸或其盐与约两摩尔当量的乙醛酸在含水介质中反应。过量的乙醛酸明显地起还原剂的作用，将中间体乙醛酸-氨甲基磷酸反应产物转化为所需的N-(膦酰甲基)甘氨酸，其本身被氧化为一种或多种副产物，包括CO2。类似地，Fields等人在美国专利4，851，159中描述了通过加热N-酰氨基甲基磷酸与乙醛酸或其衍生物制备N-(膦酰甲基)甘氨酸。乙醛酸与N-酰氨基组份的摩尔比优选为2∶1;而较小的比例会损失产率。
Kleiner和Fields等人的方法伴随的缺点不仅是要用较昂贵的乙醛酸，而且要用它作牺牲的还原剂(生成每摩尔N-(膦酰甲基)甘氨酸需用约-摩尔乙醛酸作还原剂)以及氨基-(或N-酰氨基)甲基磷酸的缩合剂。
本发明的一个方面涉及乙醛酸(或其盐)和氨甲基磷酸(AMPA)(或其盐)的混合物的制备，它是通过在水溶液中并在AMPA和两种催化剂-羟基乙酸氧化((S)-2-羟基酸氧化酶，EC1、1.3、15)和过氧化氢酶(EC1、11、1.6)的存在下，用氧来氧化羟基乙酸。因此，这第一方面代表用于制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的中间体的制备方法，该中间体包括乙醛酸组份和氨甲基磷酸组分，该方法包括在氨甲基磷酸存在下将羟基乙酸组分酶催化转化为乙醛酸组份。
因此，根据第一方面，本发明提供用作制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的中间体混合物的制备方法，该方法包括下列步骤，通过将羟基乙酸组份和氨甲基磷酸组分混合到水溶液中就地生成乙醛酸组份，第一个催化剂适于催化羟基乙酸部分用氧来氧化为乙醛酸组分和过氧化氢，第二个催化剂适于过氧化氢的催化分解，调节溶液的pH值在6到10之间，在有效的温度和足够的时间内使溶液与氧源接触，在氨甲基磷酸组份存在下使至少部分羟基乙酸组份转化为乙醛酸组份，在将所述中间体转化为N-(膦酰甲基)甘氨酸之前，使该溶液停止与氧接触。
本发明的另一方面涉及N-(膦酰甲基)甘氨酸的制备，它是通过在水溶液中并在氨甲基磷酸和两种催化剂-羟基乙酸氧化酶((s)-2-羟基酸氧化酶，EC1、1.3、15)和过氧化氢酶(EC1、11、1.6)的存在下，用氧来氧化羟基乙酸，随后在水溶液中就地还原所得到的乙醛酸和氨甲基磷酸混合物，生成所需的N-(膦酰甲基)甘氨酸，该化合物是后突发性植物生长抑制剂和除莠剂。
根据此第二方面，本发明提供制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法，该方法包括下列步骤(a)在水溶液中并在氨甲基磷酸和酶-羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的存在下，用氧来氧化羟基乙酸，生成乙醛酸组分和氨甲基磷酸组份的混合物;
(b)还原步骤(a)中生成的所述混合物，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
换句话说，本发明的第二方面包括使由第一方面得到的混合物经过氢化，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
对本发明来说应当理解，在氨甲基磷酸存在下通过羟基乙酸的酶催化氧化所生成的混合物自然导致除所需的乙醛酸组份外的氧化副产物的分布(包括通过实施例但并不限于此的草酸酯、甲酸酯和二氧化碳)。在这种混合物中还将存在未反应的羟基乙酸以及各种添加物，如黄素单核苷酸(以下称作FMN)等，所有这些物质可能或可能不影响所期望的后续氢化反应(再一次通过实施例但并不局限于此，已经发现甲酸酯和FMN降低了转化的碳平衡，该平衡存在于AMPA存在下的乙醛酸的氢化过程中)。这样本发明进一步提供由酶催化氧化所生成的溶液分离并回收酶，以及在氢化步骤之前任意除去FMN。
优选地，催化剂是酶催化的;更优选地，第一个酶是羟基乙酸氧化酶((s)-2-羟基酸氧化酶，EC1、1.3.15)，第二个酶是过氧化氢酶(EC1.11.1.6)。在催化剂/酶存在下溶液与O2的接触停止之后，通过过滤或离心除去催化剂/酶，然后使该溶液经过还原条件制备N-(膦酰甲基)甘氨酸。
因此，通过避免在单独的步骤中制备乙醛酸的需要，本发明提供了制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的更有效且经济的方法。
本发明一个目的是提供制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的改进的方法，该方法是通过乙醛酸和氨甲基磷酸混合物的酶催化制备及随后的还原来进行，它避免需要单独制备乙醛酸。
另一个目的是提供这样一种方法，其中在氨甲基磷酸的存在下，由易得的其前体即羟基乙酸酶催化地就地生成了乙醛酸，这样就提供了一种制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的更有效且经济的方法。
羟基乙酸或其合适的盐的催化氧化是在酶催化剂存在下通过羟基乙酸与分子氧源接触而方便地进行，所述酶催化剂可催化羟基乙酸与O2反应生成乙醛酸。一种这样的催化剂是羟基乙酸氧化酶(EC1.1.3.15)，也称作羟基乙酸氧化酶。羟基乙酸氧化酶可以由本领域已知的许多来源分离得到。用于该反应的羟基乙酸氧化酶应当以有效浓度存在，通常的浓度为约0.01至约1000IU/mL，优选约0.1至约4IU/ml。IU(国际单位)被定义为每分钟催化一微摩尔底物转变的酶的量。对这种酶的分析方法见于I.Zelitch和S.Ochoa.J.BiolChem.Vol.201，707-718(1953)。该方法也被用于分析回收或再循环的羟基乙酸氧化酶的活性。
尽管羟基乙酸与氧的酶催化反应已为公知的，但对乙醛酸的高选择性以前尚未知晓，而且以前没有关于在氨甲基磷酸(AMPA)存在下进行羟基乙酸的酶催化氧化反应的报道。一个应用先例即国际公开号WO为91/05868(1991年5月2日)标题为“通过羟基乙酸的酶催化氧化制备乙醛酸”，该文描述了在氧、胺缓冲液和溶解的酶-羟基乙酸氧化酶或过氧化氢酶的存在下将羟基乙酸酶催化转化为乙醛的方法。
该方法表明了使用过氧化氢酶(以破坏副产物过氧化氢)和能够与生成的乙醛酸形成化学加合物的胺缓冲液(限制了乙醛酸的进一步氧化)具有意想不到的协合效应。已经发现单独加入过氧化氢酶或胺缓冲液都不会产生两者均存在时所见测到的高选择性，所得到的乙醛酸的几乎定量的产率要大于单独使用过氧化氢酶或胺缓冲液所预期的简单的加合效果。
通过形成乙醛酸与胺缓冲液的抗氧化配合物(通过N-取代的半胺和/或亚胺的形成)所产生的乙醛酸产率的提高取决于质子化的胺缓冲液的pKa。在胺缓冲液(0.33M，pH8.3)、氢基乙酸氧化酶(0.2IU/mL)、过氧化氢酶(1，400IU/mL)和FMN(0.01mM)存在下，于30℃、1atm氧压下氧化羟基乙酸水溶液(0.25M)24h，其结果列于下表，以及用两种预期不与乙醛酸配合的缓冲液(磷酸盐和N-二(羟乙基)甘氨酸)进行反应，结果也见下表
缓冲液(pKa)%草酸%乙醛酸%羟基乙酸%甲酸乙二胺(6.85,9.93)6.885.50.82.4TRIS(8.08)1.181.02.812.0甲胺(10.62)1.053.939.85.1乙醇胺(9.50)1.869.64.8124.5氯化铵(9.24)1.139.937.718.9异丙醇胺(9.43)2.060.04.837.4N-二(羟乙基)甘氨酸(8.30)1.024.925.643.8磷酸盐(2.15,7.10,12.3)0.724.552.421.2在试验的胺缓冲液中，pKa约等于或低于反应混合物的pH值的胺(即乙二胺和TRIS)生成的乙醛酸产率(低的甲酸和草酸产率)高于胺的pKa大于进行反应的pH值时乙醛酸的产率。这些结果与所预期的相一致，即未质子化的胺与乙醛酸必然形成抗氧化的N-取代半胺和/或亚胺配合物;在反应混合物中其Pka大于反应混合物pH值的胺缓冲液主要以质子比的铵离子存在，因此不可能与乙醛酸生成这样的配合物。
氨甲基磷酸(AMPA)的质子化的胺的pKa是10.8(Lange’sHandbookofChemistry，J.A.Dean，Ed，McGraw-Hill，NewYork，1979，12th，Edition)，因此，在7至9的pH范围内向羟基乙酸的酶催化氧化反应中加入AMPA。意想不到地会产生高产率的乙醛酸。附带的实施例说明用这种胺已得到高达92%的乙醛酸产率。除了得到意想不到的高产率的乙醛酸，与不加AMPA所进行的反应(实施例13)相比，使用AMPA还能导致在羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的回收方面的改进。在使用酶催化剂的方法中通常需要回收再循环催化剂，其中催化剂的消耗对整个生产消耗起着重大作用。
在用羟基乙酸作催化剂将羟基乙酸氧化转化为乙醛酸的过程中，通过向反应溶液中加入能分解过氧化氢的催化剂便得到最佳结果。能有效地与羟基乙酸氧化酶结合的一种这样的破坏过氧化物的催化剂是过氧化氢酶(E.C.1、11、1.6)。过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧，而且认为在羟基乙酸氧化酶催化的羟基乙酸与O2的反应中，过氧化氢酶加快了与乙醛酸一起生成的过氧化氢的分解，从而提高了本发明方法中乙醛酸的产率，过氧化氢酶的浓度应当为50，000IU/mL，优选500至15，000IU/ml。最好将过氧化氢酶和羟基乙酸氧化酶的浓度调节在上述范围内，以使过氧化氢酶与羟基乙酸氧化酶的比例(每种酶按IU测定)为至少约250∶1。
在反应溶液中另一任选的但常常是有益的组分是黄素单核苷酸(FMN)，通常所用浓度为0.0至约2.0mM，优选约0.01至约0.2mM。FMN增加了羟基乙酸氧化酶的效率，这就是说每单位的酶转化羟基乙酸为乙醛酸的量增加了。应当理解加入的FMN的浓度是除了与酶共存的任何FMN，因为在制备酶的过程中也常常向酶中加入FMN。关于FMN的结构及其分析方法见于K.Yagai，MethodsofBiochemicalAnalysis，Vol.x，Inter-sciencePublishers，NewYork，1962，P.319-355，该文献在此引入作为参考。
羟基乙酸(2-羟基乙酸)是市场上可买到的，在本发明反应中其初始浓度在0.10M至2.0M的范围内，优选0.25M至1.0M之间。它可以酸形式使用，或以其相容的盐形式使用，也就是说这种盐水是水溶的，其阳离子不影响所需的羟基乙酸转化为乙醛酸或后续反应，即乙醛酸产物与氨基甲基磷酸反应生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。合适的并且相容的成盐阳离子可通过试验容易地测定。这些盐具有代表性的例子是碱金属、碱土金属、铵、取代的铵、磷鎓及取代的磷鎓盐。
羟基乙酸向乙醛酸的转化方便地且优选在含水介质中进行。加入氨甲基磷酸(AMPA)或其合适的盐。形成AMPA/羟基乙酸(起始量)的摩尔比范围为0.01/1.0至3.0/1.0，优选0.25/1.0至1.05/1.0。将AMPA和羟基乙酸在水溶液中混合之后，调节所得混合物的pH在6到10之间，优选7.0到9.0之间。在此pH范围内，通过加入任何相容的无干扰的碱包括碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐，可以调节准确的值以达到所需pH值。随着反应的进行反应混合物的pH略有降低，因此通常易于在接近最大酶活性的pH范围的高值端开始反应，约9.0-8.5，反应过程中使pH下降。通过单独加入无干扰的无机或有机缓冲液能够任意地保持pH值，因为酶活性随pH而变化。
当然羟基乙酸和乙醛酸极易溶解于水，当pH在6到10之间时，它们即使不是几乎全部也是大部分以羟基乙酸和乙醛酸离子存在。本领域技术人员还应理解乙醛酸(及其共轭碱，乙醛酸阴离子)也可以水合物存在，如(HO)2CHCOOH和/或半缩醛存在，HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH，它们的组成和其阴离子配对物等价于乙醛酸和其阴离子，后者是本发明用于N-(膦酰甲基)甘氨酸制备的合适的反应物。
氧(O2)是用于将氧基乙酸转化为乙醛酸的氧化剂，它可以气体形式通在过在气-液介面液体的搅动或通过透氧膜加到反应体系中。在大多数情况下，反应速度至少部分地受到氧溶于含水介质的速度的控制。因此，尽管氧能让空气形式加入反应体系，但最好使用较纯的氧，甚至使用高压。尽管氧压上限尚属未知，可以使用高达50大气压的氧，优选15大气压的上限。为保持高的氧溶解(这里是反应)速度，搅动是很重要的，可用任何方便的搅动形式，如搅拌。另一方面，正如酶领域技术人员所熟知的，高压速剪切搅动或产生泡沫的搅动会降低酶的活性，应当避免。
反应温度是很重要的变量，因为它影响反应速度和酶的稳定性。可以使用0℃至40℃的反应温度，但优选的反应温度范围为5℃至15℃。在优选的温度范围内进行反应便能在反应末尾使回收的酶活性达到最大值。温度不应太低以致使水溶液开始结冰。温度可以通过一般方法加以调节，如(但不局限于此)通过使用套层反应器并使具有适当温度的液体通过夹套。反应器可以由对反应组份呈惰性的任何材料构成。
反应完成后，可以通过过滤或离心分出酶并再使用。用另一种方法，可以通过加热如至70℃5分钟使酶变性并沉淀，和/或使酶留在反应混合物中，如果在后续步骤中它们的存在并非有害，即将乙醛酸-氨甲基磷酸混合物转化为N-(膦酰甲基)甘氨酸，以及从反应混合物分离N-(膦酰甲基)甘氨酸的步骤。
使反应溶液与O2停止接触之后，且优选在除掉存在的羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶之后，可以通过使溶液与活性碳接触任意地除去黄素单核苷酸(FMN)。还原含有乙醛酸和氨甲基磷酸(它们与相应的亚胺处于平衡中)的溶液，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
催化氢化是由乙醛酸和氨甲基磷酸混合物制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的优选方法。适用于本发明的催化剂包括(但并不限于)各种铂系金属，如铱、锇、铑、钌、铂和钯;还有各种其他过渡金属，如钴、铜、镍和锌。催化剂可以没有载体，例如阮内镍或氧化铂;或可以使催化剂载于载体上，例如载于碳上的铂、载于氧化铝上的钯、或载于硅藻土上的镍。优选是载于碳上的钯、载于硅藻土上的镍和阮内镍。
氢化反应可以在4至11的pH，优选5至10的pH下进行。在此pH范围内，通过加入任意的相容且无干扰的碱或酸可以调节准确的值以得到所需的pH值。合适的碱包括(但并不限于)碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐，而合适的酸包括(但并不限于)盐酸、硫酸或磷酸。
氢化温度和压力可以极大地变化。温度一般为0℃至150℃，优选20℃至90℃，而H2压力一般为约大气压至约100个大气压，优选1至10个大气压。氢化催化剂以最小浓度被使用，在所选择的反应条件下该浓度是以使氢化反应达到所需的反应速度和起始原料的总转化率;此浓度易于通过试验测定。用于该反应的乙醛酸和AMPA的每100份合并重量可以使用0.001至20或更多份重量的催化剂。
用作后突发性除莠剂的N-(膦酰甲基)甘氨酸可以从还原溶液中回收，无论采用什么还原方法，可以还原溶液中回收，无论采用什么还原方法，可以通过本领域已知的任何回收方法，包括在美国专利4，851，159和4，670，191及欧洲专利申请186648和413672中公开的方法。
在下列用于进一步说明本发明的实施例中，乙醛酸、甲酸、草酸的产率及羟基乙酸的回收率都是基于反应开始时羟基乙酸的总量而计算的百分比。反应混合物的分析是用高压液相色谱进行的。有机酸的分析是用Bio-RadHPX-87H柱进行的，AM-PA和N-(膦酰甲基)甘氨酸是用Bio-RadAminex草甘膦分析柱分析的。所报告的N-(膦酰甲基)甘氨酸的产率是基于羟基乙酸或AMPA计算的。这取决于该反应中哪一个是限制反应剂。
实施例1向3OZ.Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放入磁搅棒和10mlpH为8.5的水溶液，该溶液含有羟基乙酸(0.25M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丙酸(HPLC内标，0.125M)、羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IV/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取，1，400IU/ml)。将反应器密封并使反应混合物冷却至15℃，然后通过加压至70psig用氧冲洗反应器并向大气压放气五次，同时搅拌。然后给反应器加70psig的氧压在15℃下搅拌混合物。用注射器通过取样口(反应器内无压力损失)定期移出等分试样(0.10ml)，通过HPLC分析以监测反应进程。5小时后，，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别是70.4%、19.6%和2.2%，剩下5.3%羟基乙酸。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们的初始值的27%和100%。
实施例2(比较例)用0.33MK2HPO4代替0.265M AMPA，重复实施例1的反应。5小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别是34.1%、11.1%和0.2%，剩下58.7%的羟基乙酸。23小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别是39.4%、44.7%和15.34%，无剩余的羟基乙酸。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们初始值的85%和87%。
实施例3(比较例)用0.263MN-二(羟乙基)甘氨酸代替0.265MAMPA，重复实施例1的反应。5小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别是42.5%、49.6%和10.1%，羟基乙酸剩余0.2%。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们初始值的47%和100%。
实施例4用5，600IU/ml过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取)重复实施例1的反应。6小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为85.5%、7.6%和3.3%，羟基乙酸剩余2.5%。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们初始值的36%和100%。
实施例5用14，000IU/ml过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取)重复实施例1的反应。6小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为88.0%、3.3%和3.0%，羟基乙酸剩余3.4%。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为它们初始值的28%和96%。
实施例6用56，000IU/ml过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取)重复实施例1的反应。6小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别是84.0%、0.4%和2.5%，羟基乙酸剩余8.4%。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶和剩余活性分别为其初始值的16%和76%。
实施例7向30Z.Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放入磁搅棒和10mlpH为8.5的水溶液，该溶液含有羟基乙酸(0.25M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.20M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC内标，0.10M)羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)。将反应器密封并使反应混合物冷却至5℃，然后通过加压至70psig用氧冲洗反应器并向大气压放气五次，同时搅拌。之后给反应器加70psig氧压，在5℃下搅拌混合物。用注射器通过取样口(反应器内无压力损失)定期移出等分试样(0.10ml)，通过HPLC分析以监测反应进程。6小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为92.3%、4.36%和5.5%，羟基乙酸无剩余。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的87%和88%。反应混合物的最终pH为6.7。
得到的乙醛酸(0.23M)和AMPA(0.20M)的混合物用Ami-conCentriprep10浓缩器(10，000分子量断流)过滤，除去可溶的酶，然后将滤液放在装有磁搅棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向该瓶中加入0.100g10%Pd/c并将瓶密封，用氮气冲洗，然后用氢气加压至50psi并在25℃下搅拌。17小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度为0.13M(通过HPLC测定，按AMPA计算产率为66%)。
实施例8向3OZ.Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放入磁搅棒和10mlpH为8.5的水溶液，该溶液含有羟基乙酸(0.50M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.40M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC内标，0.10M)、羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)。将反应器密封并使反应混合物冷却至5℃(代替前面实施例中所的15℃)，然后通过加压至70psig用氧冲洗反应器并向大气压放气五次，同时搅拌。之后给反应器加70psig氧压，在5℃下搅拌混合物。用注射器通过取样口(反应器内无压力损失)定期移上等分试样(0.10ml)，通过HPLC分析以监测反应进程。17.5小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为91.0%、2.9%和2.9%，羟基乙酸剩余4.1%。反应混合物的最终pH为6.7。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的63%和91%。
得到的乙醛酸(0.46M)和AMPA(0.40M)的混合物用Ami-conCentriprep10浓缩器(10，000分子量断流)过滤，除去可溶的酶，然后将滤液放在装有磁搅棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向该瓶中加入0.100g10%pd/c并将瓶密封，用氮气冲洗，然后用氢气加压至50psi并于25℃搅拌。17小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.29M(按AMPA计算产率为72%)。
实施例9用10ml含有羟基乙酸(0.75M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.60M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC内标，0.10M)，羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，2.0IU/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml的水溶液，pH为8.5，重复实施例8的羟基乙酸的酶催化氧化。40小时后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPCL产率分别为83.2%、2.3%和7.5%，羟基乙酸无剩余。反应混合物的最终pH为6.8。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的65%和86%。
得到的乙醛酸(0.62M)和AMPA(0.60M)的混合物用Ami-conCentriprep10浓缩器(10，000分子量断流)过滤，除去可溶的酶，然后将滤液放在装有磁搅棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向该瓶中加入0.100g10%pd/c并将瓶密封，用氮气冲洗，然后用氢气加压至50psi并于25℃搅拌。24小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.42M(按AMPA计算产率为70%)。
实施例10用10ml含有羟基乙酸(1.0M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.80M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC内标，0.10M)、羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，2.0IU/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger，14，000IU/ml)的水溶液，pH为8.5，重复实施例8的羟基乙酸的酶催化氧化。66小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为78.9%、2.2%和12.1%，羟基乙酸剩余2.0%。反应混合物的最终pH为6.9。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的64%和87%。
得到的乙醛酸(0.79M)和AMPA(0.80M)的混合物用Ami-conCentriprep10浓缩器(10，000分子量断流)过滤，除去可溶的酶，然后将滤液放在装有磁搅棒3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向该瓶中加入0.100g10%pd/c并将瓶密封，用氮气冲洗，然后用氢气加压至50psi并于25℃搅拌。23小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.51M(按乙醛酸计算产率为65%)。
实施例11在pH为8.0时重复实施例8的反应。17.5小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为87.0%、2.2%和1.9%，羟基乙酸剩余8.5%。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的44%和97%。
实施例12在pH为7时重复实施例8的反应。17.5小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为88.0%、1.4%和1.9%，羟基乙酸剩余8.2%。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的44%和93%。
实施例13向3OZ.Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放入磁搅棒和10mlpH为8.5的水溶液，该溶液含有羟基乙酸(0.50M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内标，0.10M)、羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger，14，000IU/ml)。将反应器密封并使反应混合物冷却至5℃，然后通过加压至70psig用氧冲洗反应器并向大气压放气五次，同时搅拌。之后给反应器加70psig氧压，在5℃下搅拌混合物。用注射器通过取样口(反应器内无压力损失)定期移出等分试样(0.10ml)，通过HPLC分析以监测反应进程。21小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为81.7%、1.2%和2.2%，羟基乙酸剩余7.5%。羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的19%和77%。然后用0.50M羟基乙酸和0.25M、0.375M、0.40M、0.50M或0.625M氨甲基磷酸(AMPA)重复该反应，将这些反应的反应产物的产率及酶回收率列在下面[AMPA]乙醛酸甲酸草酸羟基乙酸羟基乙酸过氧化氢酶氧化酶(M)(%)(%)(%)(%)(%)(%)0.0081.71.22.27.519770.2579.42.13.32.548790.37578.32.33.61.757950.4091.02.92.94.163910.5085.21.53.35.549930.62579.61.71.814.04294
实施例14用10ml含有羟基乙酸(0.25M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC内标，0.25M)、羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)的水溶液，在pH7.0和15℃下重复实施例8的羟基乙酸的酶催化氧化。8小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为82.8%、0.9%和2.1%，羟基乙酸剩余13.9%。反应混合物的最终pH为6.6。
这种乙醛酸(0.21M)和AMPA(0.263M)的混合物用Ami-conCentriprep10浓缩器(10，000分子量断流)过滤，除去可溶的酶，然后将滤液和50mg10%pd/c放在装有玻璃衬里的不锈钢压力反应器中。将反应器密封，用氮气冲洗，然后用氢气加压至1000psi并在25℃摇动。在反应的前0.5小时内反应器压力降到一稳定值。然后加压至1000psi。4小时后，将反应器压力放空，用氮气清洗反应器。N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.16M(按乙醛酸计算产率为76%)。
实施例15在pH8时重复实施例14的羟基乙酸的酶催化氧化。8小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为86.7%、1.8%和4.1%，羟基乙酸剩余13.2%。反应混合物的最终pH为6.7。
用实施例5所述的相同方法，将这种乙醛酸(0.22M)和AMPA(0.263M)混合物在1000psi下氢化。4小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.14M(按乙醛酸计算产率为64%)。
实施例16在pH9时重复实施例14的羟基乙酸的酶催化氧化。7小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为70.0%、5.6%和11.1%，羟基乙酸无剩余。反应混合物的最终pH为6.8。
用实施例5所述的相同方法，将这种乙醛酸(0.18M)和AMPA(0.263M)的混合物在1000psi下氢化。4小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.094M(按AMPA计算产率为52%)。
实施例17用羟基乙酸和AMPA的起始浓度分别为0.50M和0.40M，在pH8.5下重复实施例14的羟基乙酸的酶催化氧化。16.5小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为85.4%、3.5%和6.3%，羟基乙酸剩余1.4%。反应混合物的最终pH为7.0。
用实施例5所述的相同方法，将这种乙醛酸(0.43M)和AMPA(0.40M)的混合物在1000psi下氢化。4小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.30M(按AMPA计算产率为75%)。
实施例18用10ml含有羟基乙酸(0.50M)、氨甲基磷酸(AMPA，0.375M)、FMN(0.01mM)、丁酸(HPLC内标，0.10M)、羟基乙酸氧化酶(由菠菜提取，1.0IU/ml)和过氧化氢酶(由Aspergillusniger提取，14，000IU/ml)的水溶液，在pH8.5下重复实施例8的羟基乙酸的酶催化氧化。17小时后，乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为87.1%、1.9%和2.1%，羟基乙酸剩余8.9%。反应混合物的最终pH为6.7。
得到的乙醛酸(0.435M)和AMPA(0.375M)混合物用Ami-conCentriprep10浓缩器(10，000分子量断流)过滤，除去可溶的酶，然后将滤液与50mg脱色碳混合(除去FMN)再过滤。将得到的滤液放在装有磁搅棒的3-OZ.Fischer-Porter瓶中。向该瓶中加入0.100g10%pd/c，将瓶密封，用氮气冲洗，然后用氢气加压至50psi并于25℃搅拌。17小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的浓度(通过HPLC测定)为0.372M(按AMPA计产算产率为99%)。
权利要求
1.一种用于制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的中间体的制备方法，该中间体包括乙醛酸组份和氨甲基磷酸组份，该方法包括在氨甲基磷酸存在下酶催化转化羟基乙酸组份为乙醛酸组份。
2.一种制备乙醛酸和氨甲基磷酸混合物的方法，该方法包括在水溶液中在氨甲基磷酸和羟基乙酸氧化酶及过氧化氢酶的存在下，用氧氧化羟基乙酸的步骤。
3.一种用作制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的中间体混合物的制备方法，该方法包括下面的步骤，将羟基乙酸组份和氨甲基磷酸组份混入水溶液中就地生成乙醛酸组份，第一个催化剂适于催化羟基乙酸组份用氧来氧化为乙醛酸组份和过氧化氢，第二个催化剂适于催化过氧化氢的分解，调节溶液pH值在6到10之间，在有效的温度和足够的时间内使该溶液与氧源接触，在氨甲基磷酸组份存在下使至少部分羟基乙酸组份转化为乙醛酸组份，在将所述中间体转化为N-(膦酰甲基)甘氨酸之前，使该溶液停止与氧接触。
4.一种制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法，该方法包括下列步骤(a)在水溶液中，在氨甲基磷酸和羟基乙酸氧化酶及过氧化氢酶的存在下，通过用氧氧化羟基乙酸制备乙醛酸组份和氨甲基磷酸组份的混合物;(b)还原在步骤(a)中制备的所述混合物，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
5.一种制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的方法，该方法包括下列步骤(ⅰ)通过将羟基乙酸组份和氨甲基磷酸组份混入水溶液中，在水溶液中就地酶催化制备乙醛酸组份和氨甲基磷酸组份的混合物，第一个催化剂适于催化羟基乙酸与氧的氧化，生成乙醛酸和过氧化氢，第二个催化剂适于催化过氧化氢的分解，调节溶液的pH值在6到10之间。(ⅱ)在有效的温度和足够的时间内使溶液与氧源接触，在氨甲基磷酸组份存在下，使至少部分羟基乙酸组份转化为乙醛酸组份;(ⅲ)使溶液停止与氧接触，(ⅳ)然后使所述混合物氢化，生成N-(膦酰甲基)甘氨酸。
6.根据权利要求1、3或5的方法，其中转化是通过羟基乙酸氧化酶催化的。
7.根据权利要求1、3或5的方法，在过氧化氢酶存在下进行。
8.根据前面任一权利要求的方法，在黄素单核苷酸存在下进行。
9.根据前面任一权利要求的方法，在pH约6.0至约10.0之间进行。
10.根据前面任一权利要求的方法，在0℃至约40℃的温度下进行。
11.根据前面任一权利要求的方法，其中在羟基乙酸氧化酶以0.01至约1000IU/ml浓度存在时进行。
12.根据前面任一权利要求的方法，其中在过氧化氢酶以50至50，000IU/ml浓度存在时进行。
13.根据权利要求4的方法，进一步包括在所述步骤(b)之还原之前，从由步骤(a)中制备的所述溶液分离并回收所述酶。
14.根据权利要求4的方法，其中所述步骤(a)的乙醛酸混合物的制备是在黄素单核苷酸存在，并且进一步包括在所述步骤(b)之还原之前，从由步骤(a)中制备的所述溶液分出所述黄素单核苷酸。
15.根据权利要求5的方法，其中第一个催化剂是羟基乙酸氧化酶，第二个催化剂是过氧化氢酶。
16.根据权利要求5的方法，其中氢化反应是在催化剂存在下进行的。
17.根据权利要求16的方法，其中氢化催化剂选自载在碳上的钯，载在硅藻土上的镍和阮内镍。
18.根据权利要求17的方法，其中氢化催化剂存在的量为每100份所用的乙醛酸和氨甲基磷酸的合并重量的0.001至20份重量的催化剂。
19.根据权利要求17的方法，其中氢化反应是在4至11的pH、0℃至150℃的温度范围内和1至约100大气压的氢气压力下进行的。
20.根据权利要求1、2或3的方法，包括还原中间体生成N-膦酰甲基甘氨酸的另一步骤。
21.根据权利要求20的方法，其中中间体是通过催化氢化还原的。
22.根据权利要求21的方法，其中中间体反应混合物被就地制备并氢化。
23.权利要求1、2或3的任一方法在制备N-膦酰甲基甘氨酸中的应用。
24.权利要求1、2或3的任一方法的产物。
全文摘要
本发明提供了制备乙醛酸和氨甲基磷酸的混合物并接着制备N-(膦酰甲基)甘氨酸(也称作草甘膦)的方法。该方法包括在水溶液中在氨甲基磷酸和催化剂——羟基乙酸氧化酶和过氧化氢酶的存在下，通过羟基乙酸和氧的酶催化反应就地制备乙醛酸和氨甲基磷酸的混合物，然后将所得混合物氢化制备N-(膦酰甲基)甘氨酸，它是一种后突发性植物生长抑制剂和除莠剂。
文档编号C07C59/153GK1073481SQ9211438
公开日1993年6月23日 申请日期1992年11月6日 优先权日1991年11月6日
发明者D·L·安顿, R·迪科西莫, E·W·波塔 申请人:纳幕尔杜邦公司