专利名称：新的10-羟基脱镁叶绿素a的制作方法
技术领域：
本发明是关于新的10-羟基脱镁叶绿素a(以下有时称之为“CpD-Ⅰ”)和其药学上可接受的盐，以及该化合物的制备方法。本发明还涉及含有作为活性成份的上述化合物的光敏剂组合物，以及利用上述光动力治疗癌症的方法。
近年来，“光动力疗法(PDT)”已引起医学界的兴趣和关注，所谓“光动力疗法(PDT)”是指利用光化射线杀死肿瘤细胞的疗法。T.J.Dougherty已报道了具有代表性的这种光动力疗法。此光动力疗法包括使用光敏剂，该光敏剂被优先吸收在实心肿瘤生长迅速的组织部分。光敏剂一旦被注入，便富集在肿瘤部位周围。然后对肿瘤施用光敏剂本身固有的最大吸收波长的光，以便选择性地杀死肿瘤细胞而不损伤肿瘤细胞周围的健康细胞[参见T.J.Dougherty等人，Cancer Res.38，PP.2628-2635(1978)]。
利用光动力疗法治疗癌症时，关键在于选择所用的光敏剂。光敏剂应具有优先与肿瘤细胞结合并发射荧光的特异性。通过利用这些性质可以定位癌症细胞。当光敏剂注入被检查的身体体内，然后在身体内放置内窥镜后，很容易观察到荧光部位，即肿瘤细胞生长部位。
照射时，处于基态的光敏剂吸收光。光敏剂的光激发态向体内的分子氧转移能量，产生单线态氧。单线态氧氧化各种生物化合物，包括细胞结构组分如甾族化合物和具有不饱和酰基链的磷脂，氨基酸如色氨酸，组氨酸，光胱氨酸和蛋氨酸;以及核酸组分如鸟苷和胞苷等等。因此，一旦单线态氧与肿瘤细胞作用，它将通过氧化肿瘤组织的细胞组分杀死肿瘤细胞。
如上所述，光动力疗法可用于癌症的诊断和治疗领域。光动力疗法优于其它类型的治疗方法。这种治疗方法具有良好的治疗效果和很宽的应用范围，因为即使是处于任何偏远部位的肿瘤(不管是什么肿瘤)也可以通过光穿过内窃镜而得到成功地治疗。这种治疗方法还具有另一优点，即它对于正常细胞只产生较小的副作用，因而可重复施用。
迄今为止，已经开发了大量光敏剂，其中既有天然的也有合成的。这些光敏剂包括补骨脂灵、黄素、卟啉、吖啶、吩噻嗪、呫吨、醌、多烯、卤代芳族化合物，以及无机离子[参见J.D.Spikes和R.Livingston，Advances in Radiation Biology，Vol，Ⅱ，PP.29-121(1969)]。许多这种光敏剂现已被作为光动力抗肿瘤剂用于临床试验。少量光敏剂已可从市场上买到用于PDT。其代表性实例包括血卟啉衍生物(HpD)(由The Quadra Logic Technology Inc(Vancouver，Canada)出售，商品名称为“Photofrin-Ⅰ”，一中聚血卟啉的醚和酯的混合物，和“Photofrin-Ⅱ”，一种更纯的产品。
本发明的发明者集中进行了一系列试验，以便寻求一种具有良好治疗效果的有效的光敏剂，结果发现从蚕提取物中分离出的新的脱镁叶绿素衍生物能极大地改进光敏性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供新的脱镁叶绿素衍生物，该衍生物可作为光敏剂用于光动力疗法治疗癌症。
本发明的另一目的是提供制备本发明新的脱镁叶绿素衍生物的方法。
本发明又一目的是提供光敏剂组合物，它包括作为活性成分的本发明新的脱镁叶绿素衍生物，和与其混合和结合的常用组分，如载体，赋形剂，膨胀剂等等。
本发明再一目的是提供用本发明新的脱镁叶绿素衍生物光动力治疗癌症的方法。
本发明的其它目的通过阅读说明书的其余部分将十分清楚。
附
图1A和1B表示各种蚕提取物，波菜和桑子的薄层色谱(TLC);
附图2A，2B和2C表示附图1A和1B中所描绘的带2的反相高效液体色谱(HPLC);其中附图2A表示在荧光房间灯下曝光几小时后的带2的反相高效液体色谱，它表示由CpD-1光转换得到CpD-2;附图2B表示在灯下曝光5分钟后带2的反相高效液体色谱;附图2C表示未经曝光的带2的反相高效液体色谱;
附图3A表示CpD-1和叶绿素a的各自1H-NMR光谱，其中箭头指示C10-OH和C10-H的位置;
附图3B表示CpD-1(CpD-1与重水(D2O)混合)和叶绿素a的1H-NMR光谱，与CpD-1混合的重水是用于测定C10-OH的1H共振;
附图3C表示CpD-1的13C-NMR光谱;
附图3D表示CpD-1的1H二维COZY NMR光谱;
附图4表示CpD-1的傅利叶变换红外光谱;
附图5表示在295°K下1，3-苯基异苯并呋喃(DPBF)最大初始光氧化速率时产生的单重态氧数量的图表;
附图6表示肿瘤和正常细胞中CpD-1和HpD的可吸收性;以及附图7A和7B表示用CpD-1和HpD分别处理人体T-4淋巴瘤细胞系(MOLT-4)和人体末稍血液淋巴细胞(PBL)，然后曝光于红光(附图7A)和黄光(附图7B)后上述细胞的存活百分率。
本发明提供了具有下式的新的10-羟基脱镁叶绿素或其药学上可接受的盐
本发明的脱镁叶绿素衍生物能够高产率产生光激化单重态氧，与其它常用光敏剂比较，在肿瘤组织中显示出更好的选择吸收。此外，在对试验动物的选择破坏癌细胞和治疗肿瘤效率方面，本发明光敏剂比其它常用光敏剂更优越。
本发明化合物结构类似于叶绿素a，但仍具有结构特征，即叶绿素a中Mg++和C10位上氢原子分别被两个氢原子和羟基取代。
据发明人所知，本发明的10-羟基脱镁叶绿素是结构还未被确定过的新化合物，在体内和体外试验中还未被用作光敏剂。
式(Ⅰ)化合物可转换成其无毒盐，即按照任何常规方法得到的其药学上可接受的盐。所述无毒盐包括式(Ⅰ)化合物的无机盐，如其金属盐，无机酸盐及有机盐。金属盐包括碱金属盐如钠盐，钾盐等，以及碱土金属盐，如钙盐，镁盐等。无机酸盐可包括氢氯酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，磷酸盐等等。有机盐可包括有机胺盐，如三甲胺盐，三乙胺盐，吡啶盐，普鲁卡因盐，甲基吡啶盐，二环己基胺盐，N，N-二苄基-1，2-乙二胺盐，N-甲基葡糖胺盐，二乙醇胺盐，三乙醇胺盐，三-(羟甲基氨基)甲烷盐，苯基乙基苄胺盐，二苄基乙二胺盐等等。无毒盐还包括有机羧酸或磺酸盐，如甲酸盐，乙酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，甲磺酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐等，以及与碱性或酸性氨基酸如精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸等形成的盐。
本发明还提供了制备本发明的新的脱镁叶绿素衍生物的方法，包括步骤(a)用适宜溶剂从蚕提取物中提取叶绿素代谢物;
(b)将提取得到的物质溶解在适宜溶液中，至过饱和;
(c)经色谱法，从所得溶液中分离光敏剂组分;以及(d)收集表现出强光敏作用部分，随后用常规方法纯化。
蚕提取物的提取(步骤(a))可按照常规溶剂提取法进行，对于溶剂，可使用本专业已知的任何溶剂如酮，醇，及其混合物。提取出的物质然后溶解在适宜溶剂中，得到一超饱和溶液(步骤(b))。任何溶剂均可用于溶解固体提取物。然而，为有效溶解，优选叔丁醇，丙酮和戊烷的混合物。所得溶液然后经色谱法，分离溶解在提取液中的固体组分(步骤(c))。本专业已知的任何制备色谱，如液相色谱(LC)，薄层色谱(TLC)，及其它类形色谱均可使用。分离完之后，收集具有强光敏性的部分，然后用常规纯化方法纯化(步骤(d))。本发明优选使用高压液相色谱(HPLC)。
分析所得产物，确定其化学结构。可使用本领域已知的任何分析方法，如红外光谱(IR)，傅利叶转换红外光谱(FT-IR)，紫外光谱(UV)，旋光色散和圆二色性光谱，荧光测定法，闪光光谱，质谱，核磁共振光谱等。
另外，式(Ⅰ)化合物也可通过利用叶绿素a作原料，用化学方法合成。制备式(Ⅰ)化合物的合成方法包括下述步骤(a)将叶绿素a于室温下，在乙醇或氯仿中与HCl反应，脱去其中的Mg离子;
(b)在室温和暗淡的安全灯或黑暗情况下，向所得溶液中缓慢鼓入空气一天或更长时间，用羟基基团取代C10位上氢原子;和(c)将所得产物按常规方法纯化。
原料叶绿素a可用已知方法从任何适当原料得到，但优选使用富含叶绿素的海藻，Spirulina platensis作为叶绿素a的原料。这种合成方法优点在于适合大规模成批生产CpD。
本发明上述部分尽管只描述了单个式(Ⅰ)化合物，但应当知道，对于同类化合物，用其它取代基取代其中取代基的改进足能够进行的，参见G.N.La Mar，"Model Compounds As Aids In Interpreting NMR Spectra of Hemoproteins"in Biological Applications of Magnetic Resonance，R.G.Shulman Ed.，pp.305-343(1979)，Academic Press，New York;and J.D.Satterlee，"NMR Spectroscopy of Paramagnetic Haem Proteins"in Annual Reports On NMR Spectroscopy，G.A.Webb Ed.，pp.84-85(1986)，Academic Press，New York。根据这些先有技术，利用本领域已知的常规方法很容易设计和合成大量具有与式(Ⅰ)化合物不同的取代基的类似物，因此，本发明还包括具有下式结构的10-羟基-脱镁叶绿素a类似物
其中，R1、R3、R4、R5、R6和R8代表C1-C3烷基醛或C3-C5环烷基;
R2代表C1-C3链烯基，以及R7代表
其中1，m和n各自代表1至3整数。
另一方面，提供了用于治疗癌细胞的光敏剂组合物，包括活性成份式(Ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐，和与其混合或结合的常用组分，如载体，赋形剂，膨胀剂，以及其它添加剂。
另一方面，本发明提供了光动力治疗癌症的方法，包括给身体施用新的式(Ⅰ)脱镁叶绿素衍生物或其药学上可接受的盐。
式(Ⅰ)脱镁叶绿素衍生物可通过各种注射方法如静脉内，肌内，皮下和腹膜内注射给入到人体内，日剂量为每千克体重5毫克至10毫克。
本发明由下述实施例更详细说明。所述实施例仅用于说明本发明目的，而不应被认为限制在权利要求书中严格描述的本发明。
实施例1由蚕提取物制备CpD-1并确定其结构按照常规溶剂提取法，用丙酮从蚕提取物中提取叶绿素代谢物。作为比较，用波菜和桑子独立重复相同的提取方法。
干燥后，0.1g粗提取物溶于1ml叔丁醇，丙酮的戊烷的混合溶剂中(5∶60∶235V/V/V)，得到一过饱和溶液。将所得溶液按常规方法点到薄层色谱(TLC)塑料硅胶板上(20×20cm)(TLC塑料板，Art，5735，EM Science)。点完后，样品带在氮气流中干燥。将滤纸(25cm高)置于TLC展开槽内(30×28×10cm)，在展开之前20分钟将与上述溶解用的相同溶剂倒入展开槽内，用真空脂密封盖有盖玻片的展开槽。展开时间为约40分钟。所有操作均在黑暗或暗淡的绿光下进行。
结果见附图1A和1B所示。参见附图1A和1B，对于波菜和桑子，在展开色谱中没有出现第二条带(“带2”)。体内试验表明带2具有极好的光敏性。
将带2从TLC板上小心刮下，并且丙酮提取。洗脱液然后在氮气流中蒸发，保存残渣，以便进一步纯化。
随后，按照常规方法用反相HPLC，所用仪器为ISCO型2350 HPLC，2360型梯度程序器，UV-5吸光/荧光监测器(ISCO，Inc)，以及C-18 Dynamax-300 (1×25cm)柱(Rainin Instrument Company，Inc.)。HPLC操作条件如下流速1.7ml/min，流动相35%甲醇和65%乙腈，梯度从80%流动相和20%水到100%流动相历时25分钟。
使用具有吸光度约为7.0(600nm)的200μl注射体积样品(约25μg)。每次操作时间设置为约80分钟，监测660nm处吸光度并储藏于微机中。自动收集各峰。得到如附图2A-2C中描述的P1、P2、P3和R4四组峰。
参照附图2A-2C，附图2A表示带2在荧光房间灯曝光几小时后的反相HPLC曲线;附图2B表示带2在灯下曝光5分钟后的反相HPLC曲线;附图2C表示未曝光的带2的反相HPLC曲线，对应于第三个峰(P3)的主要组分为CpD-1，当在灯下曝光后，CpD-1被氧化成CpD-1的异构体CpD-2，对应于第二个峰(P2)。
由此得到的高纯度CpD-1通过利用FAB/MS，1H-维和两维COZY NMRS，13C NMR，和FT-IR来确定其结构。
附图3A表示CpD-1和叶绿素a的1H-NMR光谱，其中箭头分别表示CpD-1和叶绿素a中C10-OH和C10-H的位置。CpD-1和叶绿素a的化学位移列于下面表1中。附图3B表示CpD-1，与重水(D2O)混合的CpD-1和叶绿素a的1H-NMR光谱。附图3C和附图3D分别表示CpD-1的13C-NMR光谱和CpD-1的1H两维COZY NMR光谱。附图4表示CpD-1的FT-IR光谱。
根据上述图表，可以确定CpD-1的结构，其中叶绿素a中的Mg++被两个氢原子取代，C10位上氢原子被OH取代。
表1(δ，ppm)＊1H** 叶绿素a CpD-1α 9.61 9.75β 9.47 9.59δ 8.63 8.752a 8.00 8.032bt6.29 6.312b*6.20 6.2210-H/OH 6.27 5.57P2 5.14 5.22P1 4.49 4.568 4.44 4.537 4.24 4.204a 3.87 3.7710b 3.87 3.763a 3.70 3.601a 3.41 3.445a 3.26 3.297a12.64 2.957b12.48 2.567a22.34 2.267b22.34 2.26P4 1.88 1.914b 1.81 1.70P3a 1.70 1.618a 1.57 1.10P15 1.49 1.49P(CH2)*→1.24 1.24P15a & P16 0.84 0.84P7 & P11 0.78 0.79附注＊ 所用溶剂CDCl3＊＊ 位置按Fischer编码体系表示。
实施例2合成CpD-1将约40g干燥海藻(Spirulina platensis，购自墨西哥城)浸入到含有500ml甲醇的1L烧瓶内，向其中加入5ml0.01MKOH。在黑暗情况下，向所得溶液缓慢鼓入空气6天，然后在约50℃回流15分钟。所得溶液通过漏斗中滤纸过滤，接着倒入100ml甲醇漂洗残余物质。滤液然后用1ml浓HCl处理3分钟。用旋光蒸发器(Buchi，Switzerland)蒸发所得溶液至体积少于30ml。然后向产生的物质内加入200ml ddH2O和200mlCCl4。分离后，有机相用200ml ddH2O洗涤两次，放弃水相。有机溶剂通过蒸发进一步除去，所得残余物溶于约20mlCCl4中，得到粗提取液。
将约60g230至400目硅胶(Sigma Chemical Co.)浸入到CCl4中，然后声波处理5分钟。柱子用2.5内径(cm)玻璃管填充，并用CCl4预平衡。按同样条件填充第二根和第三根硅胶柱。填充入粗提取液之后，注入约50ml CCl4淋洗粉红和黄色物质。然后注入含20%丙酮的CCl4溶液，洗脱10-OH脱镁叶绿素a/含CpD的脱镁叶绿素a组分。放弃柱中的残余物质，蒸发溶剂，残渣再溶于15ml CCl4中用于第二次硅胶色谱。在样品填装到新硅胶柱内之后，用约50ml CCl4洗脱粉红/黄色物质。然后用10%丙酮的CCl4洗脱目标CpD部分。同样不能被10%丙酮的CCl4洗脱的剩余物质丢弃。重复将溶剂从收集到的部分蒸掉，然后残余物溶于15ml CCl4。将从第二根硅胶得到的样品填充到第三根硅胶柱内之后;先注入约150ml(足够为止)含2%丙酮的CCl4溶液，洗脱非目标CpD(利用吸收光谱检测)。接着将高达含5%丙酮的CCl4溶液滴加到流动相，洗脱含有10-OH脱镁叶绿素a部分。干燥所收集部分并在氮气氛下黑暗保存，以便利用反相柱色谱进一步纯化。上述操作在通风柜中进行。
将制备型C-18反相柱(Chromosorb LC-1，Sigma Chemical Co.)填充在2.2内径×12长(cm)可调玻璃管(Amicon)内。洗脱程序如下流动相50%乙醇，40%乙腈，和10%CCl4注入样品1ml约250μg CpD流速2ml/min检测660nm吸收洗脱程序(1)从99%M.P.和1%水梯度洗脱15分钟至100%M.P.
(2)100%M.P.洗脱13分钟(3)20%CCl4的异丙醇溶液洗脱7分钟(4)99%M.P.和1%水洗脱20分钟。
注入后28分钟洗脱出10-OH脱镁叶绿素a部分。经TLC分析测定，所得产物纯度大于95%。对于TLC，该产物展开的Rf值与蚕代谢物的粗提取物第二条带相同。TLC分析条件与实施例1所述相同。
发明人通过确定NMR质子/碳谱测定了TLC色谱的带1，经与10-OH脱镁叶绿素a和叶绿素a比较，确定为脱镁叶绿素a。在C-18柱上脱镁叶绿素a的保留时间比10-OH脱镁叶绿素a长，在上述洗脱条件下它们不能被分离。干燥所得的10-OH脱镁叶绿素a产物并在氮气氛下黑暗中贮存。产率大于等于0.4%，以干重海藻粉计算，假定叶绿素a100%被提取，(实际上每批叶绿素a的百分提取率都在变化)，该产率比从蚕提取物的粗提取物得到的CpD产率(0.04)高10倍。
实施例3单线态氧产率测定PDT光敏剂最大效率的最重要指数之一就是其通过从三线态光敏剂到分子氧能量转移产生单线态氧的能力。有两种独立方法可以测量单线态氧的量子产率，见本实施例所述的方法Ⅰ和方法Ⅱ。光敏氧化方法(方法Ⅰ)使用1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧捕获剂。根据DPBF荧光或吸光度的减少，测定光敏氧化速率，从而估算DPBF在各种光敏剂存在下的起始光敏氧化速率。起始光敏氧化速率与产生单线态氧的起始速率成反比。
方法Ⅰ相对DPBF的光敏氧化使用632.8nm氦-氖激光器(最大输出20mw，Metrologic Instruments，Inc.)作为辐射源，激发样品溶液。使用新制备的DPBF(在黑暗中于氮气氛下重结晶)的乙醇溶液，浓度利用420nm，ε＝22，500cm-1M-1检测。在含有总量为2ml溶液的密封比色皿中，各种光敏剂在632nm几乎具有相同的吸光度。将经溶剂预饱和的氧气缓慢鼓入溶液中，历时20分钟，然后将少量等分不同浓度的DPBF与溶液混合。测量DPBF在455nm(乙醇)和465nm(CCl4)处荧光强度的减弱与照射时间的关系，确定DPBF的起始光敏氧化速率。
方法Ⅱ直接发光方法为了直接检测单线态氧，测量近红外磷光。使用Q-开关NdYAG激光器(Quantel，YG-571-C)，在355nm处激发。蚕CpD和叶绿素a样品溶解在空气饱和的乙醇-OD中，通过调节在355nm处吸光度至约0.55，使样品浓度基本相同。
根据倒数交叉，由1/速率对1/[DPBF]的双倒数坐标图求出最大起始速率(附图5)。叶绿素a在乙醇中的单线态氧的量子产率(Φ△，X，乙醇)由最大初始速率，相对于已知的叶绿素a在四氯化碳中的单线态氧的量子产率(Φ△，ch1＝0.57，CCl4)，按下述公式(Ⅰ)计算φΔ,x=φΔ,chl (Achl·[RATEmax]x)/(Ax·[RATEmax]chl) (1)公式(1)也可用于计算各种光敏剂在乙醇中的量子产率。结果列于下述表2和附图5中。根据这些结果，可以确定CpD-1的单线态产率高于叶绿素a。CpD-1显示出比HpD高20%产率。
表2单线态氧产率(Φ△)按相对DPBF光敏氧化(方法Ⅰ)和直线发光方法(方法Ⅱ)测量方法 参数 叶绿素a CpD-1 CpD-2I φΔof 0.44 0.50 0.52(DPBF)oxII 相对IΔ 1.00 1.01±0.05 1.09±0.04τΔ(μsec) 30.5±0.8 31.6±0.4 28.9±1.1相对φΔ 1.00 1.05±0.06 1.16±0.05φΔ 0.44 0.46±0.03 0.51±0.02
实施例4CpD-1在肿瘤和正常细胞中的吸光能力利用人体T-4淋巴细胞系(MOLT-4)作为比较标准肿瘤细胞，新制备的人体末梢血液淋巴细胞(PBL)作为比较标准健康细胞，评估CpD-1和HpD的细胞吸收作用。
向1×106细胞中分别加入含有10μg/ml CpD-1和HpD的1ml光敏剂溶液，并在圆桶内培育30至210分钟。培养物在0℃，2，000rpm下离心5分钟。沉淀出的细胞片用凉生理盐水洗涤，然后再次离心。向沉淀物中加入400μl DMF。室温振动所形成的混合物并在4℃离心，取300μl上层清液并用作细胞提取液。
向300μl细胞提取液中加入200μl蒸馏水和500μl 1N盐酸，使其达到1ml。分别测定在660和550nm处的CpD-1和HpD的吸光度。并将测量结果与标准溶液在预定的波长下的吸光度比较，求出试验光敏剂在细胞中的吸收量。
结果见附图6所示。从附图6中，可以看出在细胞中的吸收量随培养时间增长而增加，与卟啉和试验细胞种类无关，在MOLT-4中吸收量大于作为比较标准健康细胞的人体末梢血液淋巴细胞(PBL)中的吸收量。在使用相同的试验细胞下，CpD比HpD显出较大的吸光度。综上所述，可以确定在肿瘤细胞部位CpD-1优先被吸收，其定位效果比HpD高两倍多。
实施例5选择破坏肿瘤细胞(体外试验)利用与上述实施例2中相同的肿瘤和健康细胞，评估CpD-1的选择破坏能力。
将CpD-1注入到各含有1×106细胞的肿瘤细胞和健康细胞内。然后将由此处理过的细胞在红光下照射10分钟。作为对比的光敏剂，用HpD代替CpD-1注入重复相同步骤。光照之后立即计算8小时内每间隔1小时时的细胞存活百分率。结果见附图7A所示。
已发现经CpD-1处理并被红光照射过的MOLT-4在光照之后2小时内能够完全被杀死，而经CpD-1处理并被CpD-1处理和照射过的PBL的存活率时间增长而减小，光照后8小时存活率达到69.4%。被HpD处理和红光照射过的MOLT-4在光照后8小时时存活率为83.4%，而被HpD处理和红光照射过的PBL在光照后8小时时存活率为91.4%。
重复上述相同步骤，但用黄色代替红光照射MOLT-4和PBL。结果见附图7B所示。
被CpD-1处理后的MOLT-4的存活率随时间增加而减小，黄光照射后8小时时存活率为2.7%，而被CpD-1处理后的PBL在黄光照射后8小时时存活率为81.5%。被HpD处理后的MOLT-4在黄光照射后8小时时存活率为58.2%，而被HpD处理后的PBL在黄光照射后8小时时的存活率为83.3%。
这些结果说明CpD-1在长波(红光)比短波(黄光)显示出较高的细胞毒性。与皮相反，HpD在黄光下比在红光下显示较高细胞毒性。即便如此，HpD的细胞毒性还是远小于CpD-1。总之，相对于CpD-1来说，HpD并不十分有效。
综上所述，可以确定就选择性肿瘤破坏而言，CpD-1优于HpD。
实施例6对鼠皮肤瘤的治疗效果(体外试验)雌性C3H/HeJ鼠(体重约20g)和BA乳房癌用于本实验。通过注射1μl BA乳房癌片到受体鼠的后胁腹内，导入皮下瘤。当肿瘤生长至直径6-7mm(移植后约10天)，施用PDT治疗。
在该PDT治疗过程中，包含有12只鼠的第1组被注入两种不同剂量CpD，注射后24小时，用两种不同光剂量的光照射。
从第1组的12只鼠中取出6只，用0.2ml储液2处理(5mg/Kg)，然后用670nm光照射24小时。6只鼠中，其中3只接受总光剂量为100J/cm2，另外3只接受300J/cm2。其它6只鼠被注入较大剂量储液2(0.4ml)(10mg/Kg)，并在CpD注入后24小时光照射。同样，其中3只鼠接受100J/cm2光剂量，另外3只鼠接受300J/cm2。这样，在相同条件下，每3只鼠构成了接受PDT治疗次小组。
在由12只鼠组成的第2组的PDT治疗的分离装置中，施用同样的PDT条件，但只是在CpD注入4小时开始光处理。上述结果分别列于表3和表4中。
表3注入CpD-1后24小时时的PDT治疗结果CpD剂量 光剂量 鼠数量 毒性 再生长 治愈(mg/Kg) (J/cm2)5 100 3 - 3 -5 300 3 1 死 - 210 100 3 - - 310 300 3 2 死 - 1表4注入CpD-1后4小时时的PDT治疗结果CpD剂量 光剂量 鼠数量 毒性 再生长 治愈(mg/Kg) (J/cm2)5 100 3 - 3 35 300 3 1死,2 - 21失去脚10 100 3 3 死 - -10 300 3 3 死 - -实施例7对恶性肿瘤的治疗效果(体外试验)通过腹部皮下注入，对ICR鼠给用S-180细胞，从而诱导产生5-10mm大小的恶性肿瘤。S-180细胞通过在ICR鼠体内长时间培养肉瘤诱导细胞系-Sarcoma 180得到。
将试验鼠分为两组，各组分别用CpD-1和HpD处理。这样处理后的两组再一分为二，得到总数4组。其中四组中的两组用卟啉具有最大吸光度的波长的光照射两次，每次10分钟。光照是先在用光敏剂治疗后1小时时然后在24小时时进行。四组中的另一两组用相同波长的光照射两次，每次10分钟，光照是先在用光敏剂治疗后24小时时然后在48小时后进行。
先在注入CpD-1后1小时时，然后在24小时时光照两次的组显示100%治愈率(治愈数量/总治疗数量＝20/20)，而用HpD处理的组显示80%治愈率(16/20)。这些结果说明与HpD相比，CpD-1具有较高光敏化能力(P＜0.025)。
同样，先在注入CpD-1后24小时时，然后在48小时时光照两次的组显示60%治愈率(12/20)。而用HpD处理的组显示80%治愈率(16/20)。根据这些结果(P＞0.1)，可以推断CpD-1在肿瘤细胞中保留时间很短，因此即使在相对较短的时间内，对经CpD-1处理的有病人再次光照射，第二次光照作用也很小。至于HpD，由于HpD第二次细胞毒性作用如潮红，浮肿和皮肤疼痛，经受光动力治疗的病人不得不与光隔离至少24小时。[参见Photobiology of Porphyrins，In Doiron DR，Gomer CJ eds.，Porphyrin Localization and treatment of tumors，New York，Alan R Liss Inc.，1984，pp.19-39]。
上述的实验结果揭示出CpD-1在各方面均优于HpD，可以有效地作为治疗肿瘤细胞的光敏剂。
实施例8对腹肿的治疗效果(体外试验)通过腹部皮下注入，对ICR鼠给用S-180细胞，诱导腹肿，并将鼠分为五组。每组包括10只鼠。根据鼠体重随处理时间的增长而增加情况，评估CpD-1对腹肿的治疗效果。
各组分别在注入S-180后第6天(第一组)，第13天(第二组)，和第20天(第三组)用CpD-1处理，然后分别在注入CpD-1后24小时，48小时和72小时时光照射三次，每次10分钟。第四组用CpD-1处理但不光照。第五组不用CpD-1处理。
在上述处理后多于50天的期限内，如果被处理鼠与第五组的体重增加基本相同并仍然活着，则鼠被认为是完全治愈。对于第一组，8只鼠被完全治愈。对于第二组，仅有3只鼠被完全治愈，而剩余7只在35天内由于体重的继续增长死亡。对于第三组，所有鼠在35天内由于体重的继续增长而死亡。同样，对于第四组，所有鼠在35天内由于体重的迅速增长而死亡，鼠死亡时的重量比其初始重量约重两倍。
上述研究出说明对于较小的肿瘤部位，肿瘤的清除率较高。可以断定利用PDT方法，CpD-1可用于治疗腹肿。
实施例9对逆病毒的逆转录酶的抑制效果首先制备传染性Gross白血病病毒(GLV)的五倍稀释溶液。其中GLV是通过在培养基中培养从患者有白血病的C3HeB/Fe老鼠中得到的TGV细胞系而得到(参见Machala O，Bodyd R，Youn JK，and Barski GLong-term in Vitro culture of pathogenic Gross Leukemia Virus in mouse thymusCells，Eur.J.Cancer 10，467-472，1974)。所得溶液用CpD-1处理，然后光照射。逆转录酶产物通过评估病毒的毒性来检定。
GLV被接种到1×105正常鼠胎细胞上，并在含有10%青霉素(100单位/毫升)，链霉素(100μg/ml)和胎牛血清的Eagle最低限度必需的培养基中培养24小时。加入CpD-1后接着光照射，培养物用胰蛋白酶处理并用锥虫蓝染色以便计算存活细胞。将通过超高速离心所得到的病毒颗粒用去污剂研磨，并与活性混合溶液反应，该溶液具有测量3H dTTP与逆转录酶结合水平的能力。所产生的混合物被点样到玻璃滤纸上，洗涤，干燥，利用闪烁计数器测量放射性比度。
经CpD-1处理和光照射后的病毒显出5000cpm或更小的放射性，对酶产物具有显著作用(即减少)或对酶(逆转录酶)具有显著的光动力作用，而没有CpD-1处理但经光照射过的对比组显示出大于40，000cpm放射性，同样，经CpD-1处理和光照过的相同病毒对鼠胎细胞的传染性减低。
根据这些结果，可以推断CpD-1具有抗病毒活性。
如上所述，本发明10-羟基脱镁叶绿素a以及药学上可接受的盐显示出改良的光敏性和良好的肿瘤细胞可吸收性。此外，本发明化合物在选择破坏癌细胞和单线态氧的生产能力方面优于其它常规光敏剂，尤其是HpD。因此本发明化合物适合在光动力疗法应用中作为光敏剂。
权利要求
1.式(Ⅰ)10-羟基脱镁叶绿素a或其药学上可接受的盐。
2.制备权利要求1中所述的脱镁叶绿素a或其药学上可接受的盐的方法，包括下述步骤(a)用适当溶剂从蚕提取物中提取叶绿素代谢物;(b)将提取得到的物质溶解在适当溶剂中，至过饱和;(c)将所得溶液经色谱分离出光敏组分;以及(d)收集显示强光敏作用部分，随后按常规方法纯化。
3.制备权利要求1中所述的脱镁叶绿素a或其药学上可接受的盐的方法，包括下述步骤(a)室温下，将叶绿素a与HCl在乙醇或氯仿中反应，脱去其中的Mg离子;(b)室温下，在暗淡的安全灯下或黑暗中，向所得的溶液内缓慢鼓入空气一天或更长时间，用羟基取代C10位上的氢原子;以及(c)将生成产物按常规方法纯化。
4.一种用于光动力治疗癌症的光敏剂组合物，包括作为活性成分的在权利要求1中所述的10-羟基脱镁叶绿素a或其药学上可接受的盐，和与其混合或结合的常规组分如载体，赋形剂，膨胀剂以及其它添加剂。
5.一种通过体内给用权利要求1中的10-羰基脱镁叶绿素a或药学上可接受的盐的光动力治疗癌症的方法。
全文摘要
本发明提供了式(1)10-羟基脱镁叶绿素a或其药学上可接受的盐。这些化合物用作光动力癌症疗法中的光敏剂。
文档编号C07D487/22GK1074219SQ9211527
公开日1993年7月14日 申请日期1992年12月17日 优先权日1991年12月17日
发明者宋佖淳, 韩宝燮, 李元荣 申请人:第一制糖株式会社, 三星物产株式会社