专利名称：糖肽衍生物，其制备方法及含有这些化合物的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及N-糖肽衍生物，其制备方法及含有这些新化合物的药剂。
血液凝固过程中的主要步骤包括使可溶性纤维蛋白原转化成不可溶性纤维蛋白。为此，必须有蛋白水解催化剂凝血酶参予。借助蛋白水解作用，凝血酶原被转化成凝血酶。该蛋白水解作用是由血管外或血管内激活过程起动的。止血平衡受凝血作用和血纤维蛋白溶解作用的激活剂及抑制剂的调节。凝血的最主要生理抑制剂是抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)。开始时它只在较小的程度上使凝血酶钝化，且只有当发动到一定时间后才在很大程度上起失活作用。因此ATⅢ直接参予针对凝血酶过度激活的阻断机制。有一系列病理生理条件可导致ATⅢ的消耗，进而增加了血栓形成的危险。弥漫性血管内凝血的临床表现(有时仍称为消耗性凝血病)常常发生在手术后和休克状态中。同时在许多情况下会出现危及生命的凝血块。ATⅢ和肝素，以及目前的水蛭素等抗凝剂被用于治疗血栓性疾病，而香豆素衍生物则用于预防。使用本文列举的这些抗凝剂各有其缺点。肝素并不是单一分子，只有在辅因子ATⅢ存在下才有活性。肝素只能经胃肠道外途径给药。水蛭素或ATⅢ必须由生物材料中分离或用基因工程技术制备。用作为维生素K之拮抗物的香豆素进行长期预防，则可出现出血性皮肤坏死、脱发和恶心等副作用。
为治疗血栓性疾病，也已开发了直接作用于凝血酶之蛋白水解活性中心的低分子量抗凝剂，例如衍生于肽硼酸的丝氨酸蛋白酶抑制剂。这些化合物不但抑制凝血酶，而且还抑制其它丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶。
还描述了凝血酶结合常数Ki＝6nmol/L的凝血酶抑制剂2-N-(2-萘磺酰甘氨酰)-4-脒基-苯丙氨酸哌啶胺(NAPAP)，以及该结构的衍生物，其中特别是芳香氨磺酰部分被修饰，且甘氨酸被其它氨基酸取代的衍生物。NAPAP化合物及所述衍生物的缺点在于其药理学耐受性不够。特别是观察到这些化合物可降低血压并释放组胺，同时对凝血酶的特异性及其溶解度太低。
已令人惊奇地发现，N-糖肽衍生物2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-N-(β-D-葡糖苷酸基-和β-D-吡喃葡糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺是十分有效而且特异的凝血酶抑制剂(结合常数Ki＝0.08nmol/L)，它们在水中的溶解度也大有改善。
基于这一发现，本发明提供了制备有抗凝血活性之新N-糖肽衍生物的方法。本发明的这一目的是通过制备式Ⅰ的化合物而实现的。
本发明涉及式Ⅰ的N-糖肽衍生物
其中芳香基团是未被取代或被取代的苯残基，萘残基、苯并三氢吡喃残基、苯并吡喃残基或苯并呋喃残基。
a 是0至5，b是0至4，c是0或1，d是1或2，R1是(C1-C3)烷基R2是(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基，R3是H，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，NH-(C1-C6)链烷酰基，NH-苯甲酰基，NH-SO3H或天然N-乙酰化氨基酸的NH-酰基残基，R4是H，OH或(C1-C3)烷氧基，R5是H，OH，(C1-C3)烷氧基，氟，氯或溴，R6是H，CH3，CH2OH，CH2O-(C1-C6)链烷酰基，CH2NHCOCH3或CH2NH-SO3H，R5和R6一起是O-CH2-O-CH2，O-CH(CH3)-O-CH2或O-C(CH3)2-O-CH2，R7是羟基-(C2-C4)烷基或(C2-C4)-烷氧基-(C2-C4)烷基，R8是H或(C1-C6)烷基或R7-N-R8一起是吡咯烷环，哌啶环或吗啉环，这些环可被HO，HOCH2，CH3或COOH取代，W 是-O-，-CONH-或-C6H4-CONH，且H-X是HCl，(C1-C7)链烷酸或另一种药理学上可耐受的无机或有机酸。
在本发明范围内，优选的式Ⅰ化合物中芳香基团是未被取代或被取代的苯残基，萘残基或苯并三氢吡喃残基，
a是0至4，b是0至2，c是0或1，d是1或2，且R1是CH3，R2是CH3或CH3O，R3是H，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，NH-乙酰基，NH-苯甲酰基，NH-SO3H或N-乙酰基-甘氨酸或N-乙酰基丙氨酸的NH-酰基残基，R4是H或OH，R5是H或OH，R6是H，CH3，CH2OH或CH2NH-SO3H，R5和R6一起是O-CH2-O-CH2或O-CH(CH3)-O-CH2，R7是羟丙基或乙氧基丙基，R8是H或(C1-C6)烷基，或R7-N-R8一起是吡咯烷环，哌啶环或吗啉环，W 是-O-，-CONH-或-C6H4-CONH，且H-X是HCl，(C1-C6)链烷酸或另一种药理学上可接受的无机或有机酸。
为制备式Ⅰ的本发明化合物，可在有机碱和有机溶剂存在下使式Ⅱ化合物-其中芳香基团是未被取代或被取代的苯残基，萘残基或苯并三氢吡喃残基，苯并吡喃残基或苯并呋喃残基，a 是0至5，b是0至4，且R1是(C1-C3)烷基，以及R2是(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基，
与式Ⅲ的N-糖苷反应，
所说的式Ⅲ中C是0或1，d是1或2，R3是H，O保护基团-本发明范围内的“保护基团”是指碳水化合物化学或肽化学中常用的保护基团，NH保护基团，NH-SO3H，(C1-C3)烷氧基，NH-(C1-C6)链烷酰基，NH-苯甲酰基，NH-SO3H或天然N-乙酰化氨基酸的NH-酰基残基，R4是H，O保护基团或(C1-C3)烷氧基，R5是H，O保护基团，(C1-C3)烷氧基，氟，氯或溴，R6是H，CH3，CH2-O保护基团，CH2O-(C1-C6)链烷酰基，CH2NHCOCH3，CH2NH-SO3H，R5和R6一起是O-CH2-O-CH2，O-CH(CH3)-O-CH2或O-C(CH3)2-O-CH2，且R9是甲基基团，叔丁基基团，烯丙基基团或苄基基团，
W 是-O-，-CONH-或C6H4-CONH，以形成式Ⅴ的氨磺酰化合物-
其中a，b，c和d及各残基的意义如前所述，选择性地用HCl/乙酸或三氟乙酸/水水解，或在钯/碳存在下，以(C1-C4)醇，乙酸或乙酸乙酯作为溶剂经氢解作用选择性地除去产物中的残基R9，并按照肽化学中惯用的缩合方法使所得产物-其中R9是氢原子-与式Ⅳ的苯丙氨酸衍生物-其中R7是羟基-(C2-C4)烷基或(C2-C4)烷氧基-(C2-C4)烷基，R8是H或(C1-C6)烷基，或R7-N-R8一起是吡咯烷环，哌啶环或吗啉环，且H-X是HCl，HI或CF3COOH-反应，以形成式Ⅰ化合物-其中a，b，c和d及各残基保留前面指定的意义，并按照碳水化合物化学和肽化学中惯用的方法除去产物中的保护基团，以生成其他形式的式Ⅰ产物-其中芳香基团是未被取代或被取代的苯残基，萘残基，苯并三氢吡喃残基，苯并吡喃残基或苯并呋喃残基，a是0至5，b是0至4，c是0或1，d是1或2，且R1是(C1-C3)烷基，R2是(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基，R3是H，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，NH-(C1-C6)链烷酰基，NH-苯甲酰基，NH-SO3H或天然N-乙酰化氨基酸的NH-酰基残基，R4是H，OH，或(C1-C3)烷氧基，R5是H，OH，(C1-C3)烷氧基，氟，氯或溴，R6是H，CH3，CH2OH，CH2O-(C1-C6)链烷酰基，CH2NHCOCH3或CH2NH-SO3H，R5和R6一起是O-CH2-O-CH2，O-CH(CH3)-O-CH2或O-C(CH3)2-O-CH2，R7是羟基-(C2-C4)烷基或(C2-C4)烷氧基-(C2-C4)烷基，R8是H或(C1-C6)烷基，或R7-N-R8一起是吡咯烷环，哌啶环或吗啉环，W 是-O-，-CONH-或-C6H4-CONH，且H-X是HCl或(C1-C6)链烷酸，并根据需要将如此得到的糖肽衍生物转化成另一种药理学上可耐受的盐。
可按肽化学的通用方法完成本发明的缩合反应，且最好是使用混合酐、借助活性酯、叠氮化物的方法，或者碳化二亚胺方法，特别是可加入例如1-羟基-苯并三唑(HOBt)，N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧亚胺等反应加速或外消旋抑制物质，另外还使用1-羟基苯并三唑的活化衍生物或磷酸、膦酸和次膦酸的酐，且反应温度在5℃和40℃之间。用于该步骤的适当溶剂是二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基乙酰胺(DMA)，六甲基磷三酰胺(HMPT)，N-甲基吡咯烷酮或二甲基亚砜(DMSO)。就各成分能达到的溶解度来说，可使用例如二氯甲烷、氯仿或二氯乙烷等溶剂。例如Meienhofer-Gross“The Peptides”，Academic Press，Vol.I(1979)中描述了上面指出的这些方法。
可根据合成方案以及偶联条件的性质确定氨基、羟基或羧基的保护基团，并选择那些碳水化合物或肽化学中惯用的保护基团。碳水化合物化学中惯用的羟基保护基团从含意上可理解为例如(C1-C10)酰基保护基团，例如(C1-C6)链烷酰基(如乙酰或其中卤素为氟或氯的一卤代乙酰基、二卤代乙酰基或三卤代乙酰基)、苯甲酰基、甲氧基苯甲酰基或对位硝基苯甲酰基，以及适当修饰的甲基、甲氧基甲基、烯丙基、苄基、四氢吡喃基、亚苄基、异亚丙基或三苯甲基等基团，且优选的是酰基保护基，特别是乙酰基团。
可使用金刚烷氧基羰基(Adoc)基团、苄氧基羰基(Z)基团、对位硝基苄氧羰基(PNBz)基团、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团、叔丁氧基羰基(BOC)基团或α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基(DDZ)基团或三氟乙酰基(TFAc)基团保护氨基基团。
可使用(C1-C4)烷基基团、烯丙基(A11)基团或苄基(Bn)基团保护羧基基团。
在每种情况下可根据特定基团的性质用常规方法除去保护基团，例如用三氟乙酸，HCl或HBr(在乙酸中)，或用温和的还原方法，例如用氢和钯/碳或钯/硫酸钡等催化剂(在(C1-C4)醇，乙酸或乙酸乙酯中)。可用哌啶，吗啉或其他仲胺，也可使用催化氢化方法除去Fmoc保护基团〔如参见R.Geiger and W.K
nig in E.Gross and Meienhofer(eds.)The Peptides，Vol.3，p.24，Academic Press 1981〕。
最好在碱性环境中除去O-酰基保护基团和COO-烷基保护基团，如使用甲醇钠、氢氧化钠、碳酸钠、氧化钡或氰化钾，或用有机碱，如在(C1-C4)链烷醇中的肼，或它们与氯仿或水的混合物。
在合成式Ⅲ的N-糖肽结构单元时，须连接两种多功能反应物(碳水化合物和氨基二羧酸)。必须有可能选择性地将两者封闭或去封闭。在不同情况下，根据所选用的N-糖苷键合的类型(1，2-顺式-N-糖苷或1，2-反式-N-糖苷)，须将用于封闭羟基、羧基或氨基基团的适当保护基团引入糖基部分及氨基酸部分，以为链合步骤造成只立体选择两种可能之端基异构体之一的反应条件。可使用文献如A.Y.Khorlin et al Carbohydr.Res.，85，201-208(1980)，R.Walczyna and J.Sokolowski，Carbohydr.Res.，180，147-151(1988)，A.Klemmer and M.Kohla，J.Carbohydr.Chem.，7(4)，785-797(1988)，T.TaKeda et al.，Carbohydr.Res.，207，71-79(1990)，W.Guenther and H.Kunz，Angew.Chem.，102/9，1068(1990)，W.Guenther and H.Kunz，Angew.Chem.，102/9，1068(1990)，L.Urge et al.，Tetrahedron Letters32(29)，3445-3448(1991)and L Biondi et al.，Int.J.Peptide Protein Res.，37，112-121(1991)中描述的已知方法或改良的糖肽方法制备式Ⅲ的糖肽结构单元。
有关治疗血栓性疾病问题，在各种体外和体内试验系统中研究了式Ⅰ的新化合物作为抗凝血剂的医药实用性。为了试验这些新化合物的血栓形成抑制活性，以标准化试验方法用显色底物确定抑制常数(Ki)。研究这些新化合物对丝氨酸蛋白酶的特异性，特别是用凝血酶和胰蛋白酶。通过测定急性毒性(LD5，LD50)和部分组织促凝血酶原激酶时间(PTT)证实式Ⅰ化合物的体内活性。用强酸和碱确定与口服给药(通过胃和小肠)有关的这些新化合物的化学稳定性。用胰蛋白酶和糜蛋白酶，以及直接使用血浆，及肝和小肠匀浆试验新化合物对降解酶的稳定性。
本发明还涉及含有式Ⅰ之糖肽衍生物和药物稀释剂、加溶剂或赋形剂的医药配制品。
医药配制品中，式Ⅰ化合物最好以乳剂或脂质体或胶束制剂的形式存在。可用于生产医药上可接受之配制品的辅助剂是磷脂、胆固醇、甘油三酯，以及去污剂如吐温R80或它们的混合物。适用的赋形剂例如可以是白蛋白、明胶聚合物如Polygeline或淀粉，葡萄糖、乳糖、甘露醇或山梨醇(存在于生理溶液中或呈固体形式)。这些配制品含治疗有效量的式Ⅰ的糖肽化合物。
下列实施例旨在更详细地描述本发明，而不是以这一方式限制本发明。
实施例借助1H-NMR光谱学、13C-NMR光谱学和IR光谱学，以及MS分析和元素分析测定下列化合物的结构。
实施例1葡基胺的制备(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖胺)糖醛酸甲酯(化合物1)将(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-葡糖吡喃基叠氮)糖醛酸甲酯溶解在乙酸乙酯/甲醇(2∶1;200ml)中。加入钯/碳(2.00g)后，用三乙胺将混合物调到pH7.5，然后氢化1小时。过滤反应混合物并真空浓缩该溶液。产率1.90g。TLC分析RF＝0.35(二氯甲烷/丙酮2∶1)。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖胺(化合物2)按上述方法由2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基叠氮化物开始制备标题化合物。
2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖胺(化合物3)按上述方法由2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-己吡喃糖基叠氮化物开始制备标题化合物。
实施例2N-糖苷的制备
2-N-(Fmoc)-4-N-〔(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸甲酯〕-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物4)将2-N-(Fmoc)-L-天冬氨酸叔丁酯(1.6g)，HOBt(0.90g)和二环己基碳化二亚胺(1.40g)溶解在THF(100mL)中。搅拌1小时后，于0℃下向混合物内加入化合物(1.4g)。混合物于室温下搅拌16小时，然后真空浓缩之。用氯仿稀释残留物，用水振荡提取，用硫酸钠干燥并在真空中蒸发。经柱层析(氯仿/丙酮6∶1)分离残留物。产率2.00g;TLC分析Rf＝0.72(氯仿/丙酮)。
2-N-(Z)-4-N-〔(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸甲酯〕-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物5)按上述方法从2-N-(Z)-L-天冬氨酸α-叔丁酯(1.5g)和化合物1(1.2g)制备标题化合物。产率1.6g。
2-N-(Z)-4-N-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物6)0℃下将2-N-(Z)-L-天冬氨酸α-叔丁酯(3.5g)、HOBt(1.6g)和DCCI(2.5g)溶解在DMF(160mL)中，然后搅拌1小时。加入化合物2(3.5g)在DMF(50mL)中所成的溶液后，在室温下将反应混合物搅拌35小时，然后过滤并蒸发浓缩。将剩余物溶解在二氯甲烷中并用水洗，用硫酸钠干燥有机相并在真空中浓缩。在用二氯甲烷/丙酮(5∶1)洗脱的硅胶(220g)柱上层析纯化粗产物。产率3.6g。〔α〕D＝+2.7°(在甲醇中C＝1)。m.P.＝186℃，TLC分析Rf＝0.43(二氯甲烷/丙酮3∶1)。
2-N-(Z)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物7)在0℃下将2-N-(Z)-L-天冬氨酸-0-α-叔丁酯(3.1g)，HOBt(1.4g)和DCCI(2.3g)溶解在DMF(150mL)中，然后搅拌1小时。加入化合物3(3.27g)在DMF(50mL)中制成的溶液后，室温下将反应混合物搅拌40小时，然后过滤并蒸发浓缩。将余留物溶解在二氯甲烷中并用水洗，在硫酸钠上干燥有机相并真空浓缩。在用二氯甲烷和丙酮(4∶1)洗脱的硅胶(200g)上层析纯化粗产物。产率3.2g。TLC分析Rf＝0.55(二氯甲烷/丙酮2∶1)。
2-N-(Z)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-谷氨酰胺叔丁酯(化合物8)按照制备化合物6的教导由2-N-(Z)-L-谷氨酸-α-叔丁酯(3.0g)和化合物2(3.1g)制备标题化合物。
实施例3选择性除去糖肽的N-保护基团。
4-N-〔(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸甲酯〕-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物9)方法A将N-Fmoc保护的化合物4(1.8g)溶解在DMF(40mL)并加入哌啶(0.4mL)。搅拌4小时后，在真空下蒸发浓缩该混合物，将余留物溶解在乙酸乙酯和丁醇(5∶1)中并用稀盐酸洗。在硫酸钠上干燥有机相并真空浓缩之。从乙醚和石油醚中结晶出余留物。产率0.8g。m.p.＝160-163℃。
方法B将N-Z-保护的化合物5(0.9g)溶解在乙酸乙酯和甲醇(1∶1)(20ml)中并在Pd/C(0.4g)存在下氢化。滤除催化剂后，蒸发浓缩滤液并不经进一步纯化即将所得产物用于下一反应步骤。产率0.75g。
4-N-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物10)将N-Z-保护的化合物6(2.2g)溶解在乙酸乙酯/甲醇(1∶1，50mL)中并在10%Pd/C(1.3g)存在下氢化4小时。滤出反应混合物并真空蒸发浓缩之。不经进一步纯化即将所得产物用于下一反应步骤。产率1.63g。TLC分析Rf＝0.45(氯仿/甲醇6∶1)。
4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氢-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物11)在Pd/C存在下氢化N-Z-保护的化合物7(2.2g)并按上述方法处理之。产率1.63g。TLC分析Rf＝0.47(氯仿/甲醇6∶1)。
4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-谷氨酰胺叔丁酯(化合物12)将N-Z-保护的化合物7(2.2g)溶解在乙酸乙酯/甲醇(1∶1，50mL)中并于钯/碳(10%;1.2g)存在下氢化5小时。滤除催化剂后真空下浓缩所得滤液，并将余留物加甲苯共蒸馏两次。所得产物(1.32g)不经进一步纯化即用于下面的反应。
实施例4芳基磺酰氯的制备2，3，4，6-四甲基-苯磺酰氯(化合物13)将1，2，3，5-四甲基-苯(5mL)溶解在二氯甲烷(400mL)中并冷却到-10℃。逐滴加入氯磺酸(6.6mL)和二氯甲烷(200mL)的溶液，将混合物搅拌3小时，然后用5%碳酸氢钠溶液和水洗，然后在硫酸钠上干燥并蒸发浓缩。所得化合物不经进一步纯化即用于下一步反应。产率7.64g。TLC分析Rf＝0.71(石油醚/乙酸乙酯7∶1)。
实施例5氨磺酰的制备
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-〔(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸甲酯〕-L-天冬酰胺丁基酯(化合物14)将化合物9(1.73g)、二异丙基乙胺(1.2mL)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰氯(0.80g)溶解在DMF(80mL)中。将反应混合物搅拌5小时，然后蒸发浓缩。将余留物溶解在乙酸乙酯中并用水洗。在硫酸钠上干燥有机相并真空蒸发浓缩。在使用二氯甲烷和丙酮(3∶1)洗脱的硅胶上层析所得粗产物。产率1.57g。〔α〕D＝+7.0°(在甲醇中C＝1);m.p.＝108℃;TLC分析Rf＝0.87(二氯甲烷/甲醇10∶1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物15)将化合物10(1.60g)、二异丙基乙胺(1.0mL)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰氯(0.78g)溶解在DMF(80mL)中。将反应混合物搅拌5小时后蒸发浓缩之。将余留物溶解在乙酸乙酯中并用水洗。在硫酸钠上干燥并真空蒸发浓缩有机相。在用二氯甲烷和丙酮(3∶1)洗脱的硅胶柱上层析纯化粗产物。产率1.57g。〔α〕D＝+7.3°(在甲醇中C＝1.0);TLC＝0.37(二氯甲烷和丙酮3∶1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物16)如上所述使化合物11(1.6g)与4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰氯(0.8g)反应并处理之。产率1.74g。TLC分析Rf＝0.36(二氯甲烷/丙酮3∶1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-谷氨酰胺叔丁酯(化合物17)向二异丙基乙胺(1mL)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯乙酰氯(0.76g)内加入化合物12(1.6g)在DMF(80mL)中制成的溶液，同时调整pH(pH＞7.5)。将混合物搅拌5小时并真空浓缩之。将余留物溶解在乙酸乙酯中并用水洗。在硫酸钠上干燥并浓缩有机相。在用二氯甲烷和丙酮(3∶1)洗脱的硅胶柱上纯化所得产物。产率1.60g。TLC分析Rf＝0.82(二氯甲烷/丙酮1∶1)。
2-N-(2，3，4，6-四甲基-苯磺酰)-4-N-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺叔丁酯(化合物18)按照制备化合物17的教导由化合物11和2，3，4，6-四甲基苯磺酰氯(化合物13)制备标题化合物。
实施例6选择性地除去糖肽的COO保护基团。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-〔(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸甲酯〕-L-天冬酰胺(化合物19)将化合物14(2.20g)溶解在二氯甲烷和三氟乙酸(1∶1，50mL)中后于室温下搅拌2.5小时。浓缩反应混合物并将残留物与甲苯共蒸馏。不经进一步纯化即将所得产物用于下步反应。产率1.4g。〔α〕D+38.2°(在甲醇中C＝1.0);TLC分析Rf＝0.22(二氯甲烷/甲醇10∶1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺(化合物20)按制备化合物19的方法用三氟乙酸冰解化合物15(1.5g)并进一步处理之。产率1.0g。TLC分析Rf＝0.07(氯仿/甲醇/冰乙酸5∶1∶0.1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺(化合物21)按一般方法用三氟乙酸水解化合物16(1.57g)并处理之。产率1.31g。TLC分析Rf＝0.3(二氯甲烷/丙酮1∶1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-谷氨酰胺(化合物22)将化合物17(1.57g)溶解在二氯甲烷(60mL)，并加入三氟乙酸(20mL)。将混合物搅拌6小时，真空蒸发浓缩并与甲苯共蒸馏3次。产率1.3g。TLC分析Rf＝0.83(二氯甲烷/甲醇/水乙酸5∶1∶0.5)。
2-N-(2，3，4，6-四甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺(化合物23)按前述方法用三氟乙酸水解化合物18(0.9g)。产率0.6g。TLC分析Rf＝0.78(二氯甲烷/甲醇/冰乙酸5∶1∶0.5)。
实施例7缩合步骤2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-〔(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸甲酯〕-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-盐酸哌啶胺(化合物24)将化合物19(1.0g)、HOBt(0.23g)和DCCI(0.37g)溶解在DMF(50mL)中，搅拌0.5小时后向其中混入4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺(作为三氟乙酸的盐0.4g)。室温下将反应混合物搅拌48小时，然后过滤并真空蒸发浓缩。将残留物溶解在乙酸乙酯中并用水洗。在用氯仿/甲醇(5∶1)洗脱的硅胶上层析以纯化粗产物。产率1.2g。TLC分析Rf＝0.7(氯仿/甲醇3∶1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-无冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物25)将化合物20(2.50g)、HOBt(0.65g)和DCCI(1.15g)溶解在DMF(100mL)中，1小时后向其中混入4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(1.50g)。将混合物继续搅拌24小时并真空蒸发浓缩。将残留物溶解在氯仿中并用水洗。真空浓缩有机相。在用氯仿和甲醇(3∶1)洗脱的硅胶柱上纯化所得粗产物。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物26)经上述反应由化合物21(1.2g)和4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(0.92g)制备标题化合物并进一步处理之。产率1.32g。TLC分析Rf＝0.47(二氯甲烷/甲醇/冰乙酸5∶1∶0.5)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡啶糖基)-L-谷氨酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物27)使化合物22与4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物反应，得到上述标题化合物。
2-N-(2，3，4，6-四甲基-苯磺酰)-4-(2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物28)使化合物20与4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物反应得到上述标题化合物。
实施例8除去糖肽衍生物的O-和COO-保护基团2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-〔(β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸甲酯〕-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物29)将化合物24(0.5g)溶解在甲醇(50mL)中，并用1N NaOH将溶液调到pH9。于pH8.5-9下搅拌2小时后，用HCl的甲醇溶液中和反应混合物并真空蒸发浓缩之。用柱层析法(Sephaclex LH 20)纯化残留物。产率0.44g。TLC分析0.34(氯仿/甲醇/水)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-〔(β-D-葡吡喃糖基)糖醛酸〕-L-天冬天酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物30)向化合物24(0.9g)在氯仿、甲醇和水(2∶1∶0.05，100mL)中制成的溶液内加入氧化钡(0.2g)。将混合物搅拌3小时然后用HCl的甲醇溶液将其调到pH3.5并真空蒸发浓缩之。用柱层析法(Sephadex LH 20)纯化所得产物。产率0.72g。TLC分析Rf＝0.32(氯仿/甲醇/水8∶6∶1)。〔α〕D＝+3.8°(在甲醇中C＝0.5)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-〔(β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物31)向化合物25(1.2g)在氯仿/甲醇(2∶1，100mL)中制成的溶液内加入氧化钡(0.25g)，将混合物搅拌2小时后过滤。用HCl的甲醇溶液中和所得滤液并在真空中蒸发浓缩之。用柱层析法(Sephadex LH 20)纯化残留物。产率1.0g。TLC分析Rf＝0.04(氯仿/甲醇3∶1)。
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物32)按上述方法在氯仿和甲醇(90mL)中用氧化钡(210mg)使化合物26(1.0g)脱乙酰基。产率0.65g〔α〕D＝+15.6°(在甲醇中C＝1.013)
2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基)-L-谷氨酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物33)按上述方法用氧化钡使化合物27脱乙酰。
2-N-(2，3，4，6-四甲基-苯磺酰)-4-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸化物(化合物34)按上述方法用氧化钡使化合物28脱乙酰。
实施例9对位-脒基-D-苯丙氨酸-吗啉胺的合成N-(叔丁氧基羰基)-D-(对-氰基)苯丙氨酸-吗啉胺(化合物35)将N-(叔丁氧基羰基)-D-(对-氰基)苯丙氨酸(5.0g)溶解在DMF(50mL)中。然后于0℃下加入HOBt(2.6g)和DCCI(4.2g)并将混合物搅拌1小时。向混合物中加入吗啉(1.5mL)，然后于室温下再搅拌3小时。过滤并于真空中蒸发浓缩之。将残留物溶解在乙酸乙酯中并用5%NaHCO3溶液和5%KHSO4溶液各洗3次。进一步用饱和氯化钠溶液洗有机相，然后在硫酸钠上干燥并真空浓缩之。产率6.5g。TLC分析Rf＝0.83(二氯甲烷/甲醇/冰乙酸10∶1∶0.5)。
N-(叔丁氧基羰基)-D-(对位硫代氨甲酰)苯丙氨酸-吗啉胺(化合物36)向化合物35(6.5g)在吡啶(120mL)和三乙胺(3.2mL)中制成的溶液内引入H2S气体持续3小时。在密封的烧瓶内将反应混合物继续搅拌2天，然后加入甲苯并在真空中蒸发浓缩该混合物。将残留物溶解在乙酸乙酯中并用5%KHSO4溶液洗。在硫酸钠上干燥并真空浓缩有机相。从乙酸乙酯和二乙醚中结晶粗产物。产率6.7g。〔α〕D＝-11.3°(在氯仿中C＝0.743)。
N-(叔丁氧基羰基)-D-(对位甲基硫代酰亚氨基)苯丙氨酸-吗啉胺盐酸化物(化合物37)将化合物36(6.5g)和甲基碘(5.2mL)在丙酮(150mL)中的溶液持续回流0.5小时。将过滤此反应混合物后得到的沉淀物溶解在乙酸乙酯中并用冰-水洗。在硫酸钠上干燥并在真空下蒸发浓缩有机相。产率7.2g。〔α〕D＝-13.5°(在二氯甲烷中C＝1.36);TLC分析Rf＝0.53(二氯甲烷/甲醇/冰乙醇10∶1∶0.5)。
N-(叔丁氧基羰基)-D-(对位脒基)苯丙氨酸-吗啉胺盐酸化物(化合物38)将化合物37(5.2g)溶解在甲醇(80mL)中并混入乙酸铵(1.0g)。于60℃下将混合物搅拌3小时并蒸发浓缩之。用柱层析法(LH20)纯化残留物。产率4.2g。〔α〕D+7.9°(在甲醇中C＝1.45)。
N-(叔丁氧基羰基)-D-(对位酰亚氨基)苯丙氨酸-吗啉胺三氟乙酸盐(化合物39)将化合物38(4.0g)溶解在甲醇和水(10∶1)中并混入三氟乙酸钠(5.0g)。将混合物搅拌24小时，过滤并在真空中蒸发浓缩。通过Sephadex LH 20柱过滤残留物。产率3.2g。
D-(对位酰亚氨基)苯丙氨酸-吗啉胺三氟乙酸盐(化合物40)按常规方法用三氟乙酸水解化合物39(3.2g)并处理之。产率2.2g。
实施例102-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N(β-D-葡吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸盐(化合物41)将2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸盐(1.0g)、HOBt(0.23g)和DCCI(0.37g)溶解在DMF和二氯甲烷(1∶1，50mL)中，搅拌0.5小时后加入β-D-半乳吡喃糖胺(1.0g)。室温下将反应混合物搅拌48小时，然后过滤并在真空下蒸发浓缩之。将残留物溶解于乙酸乙酯中并用水洗。在用氯仿/甲醇(5∶1)洗脱的硅胶柱上层析以纯化粗产物。产率1.2g。TLC分析Rf＝0.73(氯仿/甲醇3∶1)。向此中间产物(1.2g)在氯仿/甲醇(2∶1，100mL)中所成的溶液内加入氧化钡(0.25g)，将所得混合物搅拌2小时后过滤之。用HCl的甲醇溶液中和所得滤液并在真空下蒸发浓缩。用柱层析法(Sephadex LH 20)纯化残留物。产率1.0g。TLC分析Rf＝0.042(氯仿/甲醇3∶1)。〔α〕D+19.3°(在甲醇中C＝1)。M.p.186-190℃。
实施例11凝血酶抑制常数的测定用已建立的酶动力学方法检测式Ⅰ化合物的抑制常数(Ki)。用于根据活性部位滴定法检测的人凝血酶为87%纯。进行Ki检测的试验溶液由缓冲液(50mM Tris-HCl，75mM NaCl，pH7.8，37℃)、100pM凝血酶、0.1nMH-D-苯丙氨酰-L-哌啶基-L-精氨酸-对位硝基酰苯胺盐酸盐(底物S-2238;由Kabi提供)和浓度范围为0-400nM的抑制剂组成。将抑制剂和酶预保温10分钟，加入显色底物S2238后开始反应。为估测动力学，使用紧密结合的术学演算法，该方法借助非浅性回归给出Ki值和抑制类型。发现该抑制类型对所有抑制剂都是竞争性的结果总结于表Ⅰ中。
实施例12抑制剂特异性的检测检测抑制剂对凝血酶和胰蛋白酶的特异性。以与检测凝血酶Ki相似的方法检测胰蛋白酶的Ki值。反应混合物组成如下缓冲液200mM三乙醇胺、20mM CaCl2，pH7.8;37℃酶0.5nM得自牛胰脏的胰蛋白酶;底物500μM苄酯基-L-缬氨酰-甘氨酰-L-精氨酸-4-苯基重氮酸(Chromozyme TRY，得自Boehringer Mannheim)。预保温10分钟后加入底物开始酶促反应。于405nM检测所释放的对位硝基苯胺。结果总结于表Ⅰ中。
实施例13急性毒性的测定为测定急性毒性，在0天给CD大鼠静脉注射溶于0.5mL生理NaCl溶液中的不同剂量的试验底物。对照组只接受0.5mL生理盐水(NaCl溶液)。每个浓度的试验底物注射2只大鼠。计数第1天存活的大鼠数并用Litchfield & Wilcoxon方法计算LD5、LD50及LD95。经与NAPAP比较，确定本文所述化合物的毒性，即LD50(mg/kg)。结果总结于表Ⅰ中。
实施例14部分组织促凝血酶原激酶时间(PTT)一固有和非固有凝血系统缺陷的筛选试验将待试化合物作为浓注射液注入大鼠尾静脉内。5分钟后由静脉丝放血并与1/5体积的柠檬酸盐缓冲液混合。在凝度计(Schnittger & Gross)中用新凝血酶测定PTT。大鼠的正常PTT值为20秒。为测定凝血酶时间(TT)，将100μL血液、柠檬酸盐缓冲液和巴比妥酸二乙酯-乙酸盐缓冲液相混合并于37℃保温1分钟。加入100μL试验用凝血酶后用凝度计测定TT。
实施例152-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-3-O-(β-D-吡喃核糖基)-L-丝氨酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸盐(化合物42)阶段1合成2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-3-O-(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃核糖基)-L-丝氨酰-4-氰基-D-苯丙氨酰-哌啶胺将3-O-(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃核糖基)-L-丝氨酰-叔丁酯(17.3g)、三乙胺(12mL)和Mtr氯溶解在DMF(800mL)中并于室温下搅拌过夜。真空蒸发掉溶剂，将残留物重新溶解于乙酸乙酯中并用水洗3次。用硫酸钠干燥有机相并在真空下蒸发。在用二氯甲烷/丙酮(3∶1/V∶V)洗脱的硅胶柱上进一步纯化。产率15.7g。纯度检查TLCRf＝0.87(二氯甲烷∶甲醇1/10∶1)。将此中间产物溶于300mL三氟乙酸/二氯甲烷(1∶1)中并于室温下搅拌1小时。在真空中蒸馏掉酸性混合物并在真空中使用甲苯蒸发除去附着的痕量酸。所得产物不经进一步纯化即用于下一反应。将前阶段制得的10g产物、2.3gHOBt和3.7gDCCI溶解于500mLDMF中并于4℃搅拌30分钟，然后加入9.0g4-氰基-D-苯丙氨酰-哌啶与5.0mLN-甲基吗啉。于室温下将此混合物搅拌18小时并真空过滤。在使用氯仿/甲醇(5∶1)和乙酸乙酯洗脱的硅胶柱上层析纯化粗产物。产率14.3g。TLC分析Rf＝0.86(氯仿/甲醇10∶1)。
阶段2合成2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-3-O-(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃核糖基)-L-丝氨酰-4-脒基-D-苯丙氨酰-哌啶XHI将氰基苯丙氨酸糖肽(10.0g)溶解于无水吡啶(100mL)中，加入三乙胺(2.5mL)后使气体硫化氢通过3小时。将混合物在室温下放置3天，然后倾入冰(300g)和浓HCl的混合物中。抽滤除去沉淀物并用水洗。干燥此硫代酰胺后重新溶解于丙酮(200mL)中，并加入甲基碘(5.0mL)。于回流下将混合物煮沸30分钟。冷却后用二乙醚诱导产生沉淀。将沉淀物溶解在二氯甲烷中并用水洗两次。用硫酸钠干燥有机相并除去溶剂，然后将残留物(8.2g)重新溶解在无水甲醇(200mL)中，并加入乙酸铵(2.1g)。于60℃将混合物加热3小时。真空蒸发除去溶剂。在用甲醇洗脱的Sephadex LH-20柱上和用氯仿/甲醇/水(10∶1∶0.2)洗脱的硅胶柱上层析纯化粗产物。产率6.2g。TLC分析Rf＝0.3(氯仿/甲醇/水10∶1∶0.2)。
阶段3使2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-3-O-(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃核糖基)-L-丝氨酰-4-脒基-D-苯丙氨酰-哌啶XHI脱乙酰向乙酰化化合物(1.8g)在氯仿、甲醇和水(2∶1∶0.05，200mL)中制成的溶液内加入氧化钡(0.4g)。将混合物搅拌3小时，然后用HCl的甲醇溶液将其调到PH3.5并在真空中蒸发浓缩。用柱层析(Sephadex LH20)法纯化所得产物。产率1.42g(化合物42)。TLC分析Rf＝0.22(氯仿/甲醇/水8∶1∶0.2)。
实施例16合成2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-L-天冬氨酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺x HCl(化合物43)按德国专利DE4115468AI中所述方法制备化合物43。
实施例17由2-N-(氨基甲酸乙酯保护基团)-天冬氨酸-β-甲基酯制备2-N-(氨基甲酸乙酯保护基团)-天冬氨酸-α酯2-N-BOC-L-天冬酰胺-α-苄酯(化合物44)将N-BOC-L-天冬氨酰-β-O-甲酯(5.0g)溶解在苄醇(40mL)中。向溶液内加入KO叔丁酯并于60℃加热8小时。冷却后，用水将此溶液洗两次。用硫酸钠干燥有机相并在真空中除去溶剂。使用二乙醚/石油醚结晶残留物。产率4.5g。
2-N-苄氧基羰基-L-天冬酰胺-α-苄酯(化合物45)按上述方法由N-Z-L-天冬氨酰-β-O-甲酯(5.0g)开始制备标题化合物并处理之。
2-N-苄氧基羰基-L-天冬酰胺-α-正丁酯(化合物46)将N-Z-L-天冬氨酸-β-O-甲酯溶解在正丁醇(40mL)中。向溶液内加入KO叔丁酯，于60℃加热8小时。冷却后用水将此溶液洗两次。用硫酸钠干燥有机相并在真空中除去溶剂。使用二乙醚/石油醚结晶残留物。产率4.5g。
实施例18制备2-N-(氨基甲酸乙酯保护基团)-4-N-糖基-天冬酰胺-α-酯、2-N-(氨基甲酸乙酯保护基团)-5-N-糖基-谷氨酰胺-α-酯和2-N-(氨基甲酸乙酯保护基团)-4-N-糖基-4-酰氨基-苯丙氨酸酯2-N-BOC-4-N-β-L-岩藻吡喃糖基-L-天冬酰胺-α-苄酯(化合物47)按实施例2中所述反应从化合物44和β-L-岩藻吡喃糖基-胺开始制备标题化合物。
2-N-Fmoc-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基)-4-乙酰氨基-L-苯丙氨酸)-α-苄酯(化合物48)
按照实施例2中所述反应由2-N-Fmoc-4-羧基-L-苯丙氨酸-α-苄酯和2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基胺制备标题化合物。
实施例192-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(β-L-岩藻吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸盐(化合物49)按实施例6中所述的处理化合物19的方法用三氟乙酸/二氯甲烷使化合物47去保护，并按实施例5中所述方法使中间产物与Mtr氯反应。按实施例7中所述方法使所得化合物(Mtr-4-N-糖基-天冬酰胺-OH)与4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸盐反应，得到标题化合物并处理之。
实施例202-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-L-天冬酰胺酰-4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸盐(化合物50)阶段1合成2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-L-天冬氨酸-α-O-苄酯将2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-L-天冬氨酸-β-O-甲酯(5.0g)溶解在苄醇(40mL)中。向溶液内加入KO叔丁酯，于60°加热8小时。冷却后，用水将此溶液洗两次。在硫酸钠上干燥有机相并真空除去溶剂。使用二乙醚/石油醚结晶残留物。产率4.5g。〔α〕D＝+43.3°(在MeOH中c＝1)。
阶段2N-糖基化按实施例7所述使4.5g前阶段产物与2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-胺反应，以产生2-N-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰)-4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-L-天冬酰胺-α-O-苄酯。产率4.6g。
阶段3氢化在乙酸乙酯/甲醇(1∶1)中用Pd/C(2g)氢化4.6g前阶段产物，得到Mtr-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-L-天冬酰胺。
产率3.55g。
阶段4缩合步骤按上述(实施例7)方法由Mtr-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-L-天冬酰胺(3.55g)和4-脒基-D-苯丙氨酸-哌啶胺盐酸盐(3.3g)开始制备标题化合物并处理之。化合物50产率4.4g。TLC分析Rf＝0.47(二氯甲烷/甲醇/冰乙酸5∶1∶0.5)，〔α〕D＝+21.2°(在MeOH中c＝1)。
实施例212-N-(氨基甲酸乙酯保护基团)-4-羧基-苯丙氨酸和其酯的制备N-Fmoc-4-叔丁氧基羰基-D和L-苯丙氨酸-α-苄酯(化合物51和52)按实施例15(阶段2)所述方法使N-苄氧基羰基-4-氰基-D和L-苯丙氨酸-α-苄酯(5.0g)与H2S反应，再与甲基碘反应得到S-甲基-硫代酰亚胺中间产物(4.2g)。按常规方法用5%KHSO4水溶液/丙酮水解该中间产物并处理之，以得到S-甲基-硫酯，按Zemplen方法水解产物，得到N-苄氧基羰基-4-羧基-苯丙氨酸-α-苄酯。用叔丁基保护基团保护羧基并按常规方法氢解后，用Fmoc氯化物保护该中间产物，得到标题化合物51或52。
权利要求
1.制备式Ⅰ化合物
其中芳香基团是未被取代或被取代的苯残基、萘残基、苯并三氢吡喃残基、苯并吡喃残基或苯并呋喃残基，a是0至5，b是0至4，c是0或1，d是1或2，R1是(C1-C3)烷基，R2是(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基，R3是H，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，NH-(C1-C6)链烷酰基，NH-苯甲酰基，NH-SO3H或天然N-乙酰化氨基酸的NH-酰基残基，R4是H，OH或(C1-C3)烷氧基R5是H，OH，(C1-C3)烷氧基，氟，氯或溴，R6是H，CH3，CH2OH，CH2O-(C1-C6)链烷酰基，CH2NHCOCH3或CH2NH-SO3H，R5和R6一起是O-CH2-O-CH2，O-CH(CH3)-O-CH2或O-C(CH3)2-O-CH2，R7是羟基-(C2-C4)烷基或(C2-C4)-烷氧基-(C2-C4)烷基，R8是H或(C1-C6)烷基或R7-N-R8一起是吡咯烷环，哌啶环或吗啉环，这些环可被HO、HOCH2，CH3或COOH取代，W是-O-，-CONH-或-C6H4-CONH，且H-X是HCl，(C1-C7)链烷酸或另一种药理学上可耐受的无机或有机酸的方法，该方法包括在有机碱和有机溶剂存在下使式Ⅱ化合物-其中芳香基团是未被取代或被取代的苯残基，萘残基或苯并三氢吡喃残基，苯并吡喃残基或苯并呋喃残基，a是0至5，b是0至4，且R1是(C1-C3)烷基，以及R2是(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基，与式Ⅲ的N-糖苷反应，式
所说的式Ⅲ中C是0或1，d是1或2，R3是H，O保护基团-本发明范围内的“保护基团”是指碳水化合物化学或肽化学中常用的保护基团，NH保护基团，NH-SO3H，(C1-C3)烷氧基NH-SO3H或天然N-乙酰化氨基酸的NH-酰基残基，R4是H，O保护基团或(C1-C3)烷氧基，R5是H，O保护基团，(C1-C3)烷氧基，氟，氯或溴，R6是H，CH3，CH2-保护基团，CH2O-(C1-C6)链烷酰基CH2NHCOCH3，CH2NH-SO3H，R5和R6一起是O-CH2-O-CH2，O-CH(CH3)-O-CH2或0-C(CH3)2-O-CH2，且R9是甲基基团，叔丁基基团，烯丙基基团或苄基基团，W是-O-O，-CONH-或C6H4-CONH，以形成式V的氨磺酰化合物-
其中a，b，c和d及各残基的意义如前所述，选择性地用HCL/乙酸或三氟乙酸/水水解，或在钯/碳存在下，以(C1-C4)醇，乙酸或乙酸乙酯作为溶剂经氢解作用选择性地除去产物中的残基R9，并按照肽化学惯用的缩合方法使用所得产物-其中R9是氢原子-与式N的苯丙氨酸衍生物-其中R7是羟基-(C2-C4)烷基或(C2-C4)烷氧基-(C2-C4)烷基，R8是H或(C1-C6)烷基，或R7-N-R8一起是吡咯烷环，哌啶环或吗啉环，且H-X是HCl，HI或CF3COOH-反应，以形成式Ⅰ化合物-其中a，b，c和d及各残基保留前面指定的意义，并按照碳水化合物化学和肽化学中惯用的方法除去产物中的保护基团，以生成其它形成式的Ⅰ产物-其中芳香基团是末被取代或被取代的苯残基，萘残基，苯并三氢吡喃残基，苯并吡喃残基或苯并呋喃残基，a是0至5，b是0至4，c是0或1，d是1或2，且R1是(C1-C3)烷基，R2是(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基，R3是H，OH，(C1-C3)烷氧基，NH2，NH-(C1-C6)链烷酰基，NH-SO3H或天然N-乙酰化氨基酸的NH-酰基残基，R4是H，OH，或(C1-C3)烷氧基，R5是H，CH，(C1-C3)烷氧基，氟，氯或溴，R6是H，CH3，CH2OH，CH2O-(C1-C6)链烷酰基，CH2NHCOCH3或CH2NH-SO3H，R5和R6一起是O-CH2-O-CH2，O-CH(CH3)-O-CH2或0-C(CH3)2-O-CH2，R7是羟基-(C2-C4)烷基或(C2-C4)烷氧基-(C2-C4)烷基，R8是H或(C1-C6)烷基，或R7-N-R8一起是吡咯烷环，哌啶环或吗啉环，W是-O-，-CONH-或-C6H4-CONH，且H-X是HCl(C1-C6)链烷酸，并根据需要将如此得到的糖肽衍生物转化成另一种药理学上可耐受的盐。
全文摘要
本发明公开了式I的N-糖肽衍生物，式I中各取代基的定义详见说明书，还公开了这些衍生物的制备方法及含有这些新化合物的药剂。这些药物可用于治疗血栓形成性疾病。
文档编号C07K9/00GK1077961SQ93101528
公开日1993年11月3日 申请日期1993年2月15日 优先权日1992年3月5日
发明者C·科拉尔, W·斯图伯尔 申请人:柏林魏克股份公司