专利名称：一种从含有无活性蛋白的溶液中回收生物活性形式重组蛋白的方法
技术领域：
本发明总的说来涉及一种从含有无活性蛋白的溶液中回收天然的、生物活性形式重组蛋白的方法。
本领域中已公知制备重组蛋白的方法;应用重组技术可将编码某种特定蛋白的异源DNA片段插入宿主微生物中。在能诱导蛋白表达的条件下培养转化的微生物，可以产生如胰岛素、生长激素、白介素、干扰素、促生长因子等异源蛋白。
遗憾的是，由转化微生物产生的异源蛋白常常没有生物活性，因为这些蛋白在微生物内进行转录时并没有折叠成正确的三级结构。这些异源蛋白倾向于形成聚集体，这些聚集体在细胞内可被识别为“包涵体”(有时也称为“折射体”和/或“蛋白粒”)。连接数个蛋白分子的共价分子间二硫键的形成，产生了不溶性的复合体，这可能也是这些包涵体形成的原因。包涵体一般含有大部分异源蛋白和小部分污染的宿主微生物蛋白。
现已建立了数种方法，以从微生物中提取包涵体，并将其中所含的异源蛋白转化成具有与天然母本蛋白或非重组蛋白一致的具有天然生物活性的蛋白。这些方法一般涉及破碎微生物细胞;从细胞碎片中分离出包涵体;在变性剂和/或还原剂存在下使包涵体蛋白变性和/或还原，使蛋白展开而将其自身与不溶性的污染物分离;去除溶液中的还原剂或降低其浓度;在变性剂存在下氧化已还原和变性的蛋白溶液，去除变性剂，从而使异源蛋白重新折叠成三级构象;从仍存在于溶液中的污染蛋白中分离出该异源蛋白。
遵循上述一般性步骤的许多重组蛋白回收和纯化方案在本领域中都是已知的。
Yokoo等人的美国专利4，985，544公开了一种从包涵体中重新激活天然形式的含半胱氨酸蛋白的方法。该方法包括在既有变性剂又有还原剂存在下使蛋白溶解，去除还原剂，氧化蛋白，随后去除变性剂，使蛋白重新折叠成其天然构象。所公开的可能的变性剂为SDS、尿素、盐酸胍、酸和碱，而所提出的还原剂包括单价硫醇，例如β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽和二硫苏糖醇(DTT)。在所列出的还原剂中，特别优选DTT。氧化步骤可以通过充气进行空气氧化而完成。
在Yokoo等人的实施例中，说明了分别选用尿素和DTT作为变性剂和还原剂。Yokoo等人的方法的缺点在于，该方法在氧化步骤之前，需要进行在变性剂存在下有选择地完全去除还原剂这一棘手的步骤，该步骤优选凝胶过滤法。
K.Olson的美国专利4，518，526、Builder等人的美国专利4，511，502和4，620，948以及Wetzel等人的美国专利4，599，197，都涉及折射性异源蛋白的溶解和纯化，其中，将蛋白用变性溶液处理，该溶液可以包含作为可能变性剂的SDS。然后，任选在还原剂存在下，通过稀释变性溶液使蛋白重新折叠。所包括的作为可能还原剂的物质为β-巯基乙醇。
P.Ghosh-Dastidar的美国专利4，766，205涉及一种使天然和重组来源的含多个二硫键的蛋白质产生具有生物活性的天然构象的方法。在用变性剂和还原剂对所感兴趣的蛋白质进行处理后，降低还原剂的浓度，同时引入含有二硫键的、能形成加合物的化合物。含有二硫键的化合物与还原的半胱氨酸残基反应，在去除还原剂的同时，形成了稳定的中间加成产物。该专利公开了含有单、双或多官能团的含巯基试剂为合适的还原剂，如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。最优选的还原剂为β-巯基乙醇。适宜的能形成二硫键加合物的化合物包括胱胺、氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、亚硫酸钠等。
在稳定的加合物形成后，可重新形成天然的胱氨酸二硫键，在温和的氧化/还原环境中，蛋白质可重新折叠成其天然构象，这种温和的氧化/还原环境包括适宜pH下的弱还原剂和弱氧化剂。适用于这种处理的弱还原剂包括半胱氨酸，而适用于这种处理的弱氧化剂包括大气氧。
本领域内需要提高由含有无活性的、不正确折叠蛋白的溶液中回收的生物活性蛋白的产率。
本发明描述了一种提高从含有无活性蛋白的溶液中获得的生物活性蛋白产率的新方法。无活性蛋白可以是以不溶性的包涵体形式存在，也可以是以氧化的、错误折叠的和聚集的无用蛋白的形式存在。
本发明方法是以用第一碱性缓冲液稀释无活性蛋白这一步开始的。将稀释了的无活性蛋白用作为变性剂的SDS和作为还原剂的L-半胱氨酸进行处理，以同时溶解和还原蛋白质。用部分透滤法(partialdiafiltration)将含有已溶解和还原的蛋白的溶液相对于不含变性剂和还原剂的第二碱性缓冲液进行透滤，从而降低溶液中SDS和L-半胱氨酸的浓度。变性和还原了的蛋白继而被氧化，形成了与天然存在的生物活性蛋白一致的二硫键。
在一个优选实施方案中，用第一碱性缓冲液将含有无活性蛋白的溶液稀释至蛋白浓度约为0.1-1.0mg/ml。然后用约0.05%至约1.0%的SDS和约5mM至约25mM的L-半胱氨酸处理稀释了的无活性蛋白。将含有已溶解和还原的蛋白的溶液相对于约0.5至3倍体积的不含变性剂和还原剂的第二碱性缓冲液进行透滤，使溶液中的SDS和L-半胱氨酸的浓度下降约70%至约90%。变性和还原了的蛋白继而被空气氧化，形成与天然存在的生物活性蛋白一致的二硫键。
本发明的方法可用于有效而经济地提高在转化微生物中以不溶性的无生物活性包涵体形式产生的生物活性蛋白的回收率，这种转化微生物是指那些已用指导异源蛋白编码基因表达的重组DNA载体转化的微生物。本发明的方法特别可用于将无生物活性的、氧化的、错误折叠的和聚集的无用蛋白转化成有用产物，尤其是以其天然生物活性形式存在的所需蛋白。本发明进一步可用于直接从包涵体成功地回收氧化的单体。
“无用蛋白”是指在象本领域已知的回收技术所规定的那样氧化包涵体蛋白的已溶解和还原的溶液后，与正确折叠的生物活性蛋白一同形成的无活性的、氧化的、错误折叠的和聚集的蛋白。具体地说，无用蛋白是由于所回收的包涵体蛋白非共价聚集和/或分子间或分子内共价多聚而产生的。本发明可用于再循环无用蛋白，以制备正确折叠的单体产物。
可用本发明方法获得的生物活性蛋白包括动物生长激素，例如牛、猪、鸟、羊或人的生长激素。
应该理解，本文泛泛地提到蛋白质或提到具体的蛋白质如牛和猪生长激素并不是要局限于含有天然蛋白的完整氨基酸顺序的分子，而是还包括去掉了顺序中不同部分的蛋白质片段，以及在其天然顺序中进行了不同置换和修饰(即类似物)但并不破坏分子的生物活性的蛋白质或其片段。
该方法的第一步包括用第一碱性缓冲液稀释无活性蛋白，以降低蛋白质浓度并调整蛋白质溶液的pH值。优选的缓冲液为由等重量的碳酸钠(Na2CO3)和碳酸氢钠(NaHCO3)组成的碳酸盐缓冲液，其浓度一般优选为约35mM至约60mM，更优选为约40mM至约50mM，最优选为约46mM。第一缓冲液的pH优选为约9至约11，更优选为约9.6至约10，最优选为约9.8。缓冲液稀释后蛋白质的浓度优选为约0.1至约1.0mg/ml，更优选为约0.3至约0.6mg/ml。这可能要求稀释度为约1∶1.1至约1∶40，当无活性蛋白以氧化的、错误折叠的以及聚集的无用蛋白形式存在时，稀释度一般为约1∶5;当无活性蛋白以不溶性的包涵体形式存在时，稀释度一般为约1∶40。
起始的稀释步骤为本方法创造了有利的环境。蛋白质的浓度似乎很强地影响随后的溶解/还原和再氧化步骤的效率。稀释使蛋白质浓度降低，以而增加了蛋白分子间的距离。具体地说，蛋白质浓度降低使共价和非共价的分子间相互作用都减小到最低程度。因而，稀释后的溶液促进了正确的分子内相互作用，导致形成正确的二硫键。
下一步用变性剂SDS和还原剂L-半胱氨酸处理稀释的无活性蛋白，以同时溶解和还原所需蛋白。加入SDS是为了破坏非共价相互作用，而加入L-半胱氨酸是为了使共价错配的分子间和分子内二硫键解离成为巯基。SDS的浓度最好为约0.05%至约1.0%，最优选为约0.2%(重量/体积)，而L-半胱氨酸的浓度优选为约5mM至约25mM，最优选为约15mM。
其它还原剂，尤其是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(βME)以及还原型和氧化型谷胱甘肽，也广泛地用于控制已还原蛋白质的再氧化。然而，DTT非常昂贵(Sigma公司产品每100克563.50美元)，并且由于它有吸湿性而造成贮存困难，使该试剂不适宜用于大规模生产。另一方面，βME虽然便宜(Sigma公司产品每升32.15美元)，但由于有令人不快的特征性气味，也不受欢迎。更重要的是，在本方法中将βME(20mM)作为还原剂使用时，它常常由于形成异常稳定的再折叠中间产物而对再折叠过程有不利影响。这种再折叠中间产物与大量的残余还原单体(RM)一起，甚至在氧化48小时后也常常依然存在。
用半胱氨酸(L-半胱氨酸)作为还原剂，避免了上述的所有问题。其价格合理(味之素公司产品每千克77.00美元)。另外，半胱氨酸为天然氨基酸，并制备成在碱性pH下易溶于水溶液的、稳定的干燥晶体。而且，可以获得大量的食品化学药典级半胱氨酸。半胱氨酸还易于氧化成公认的氧化剂胱氨酸，尤其是在要求保护的方法中出现的碱性pH条件下(巯基的pKa为8.3)。因为，任何残余物问题都可以减少至最低程度。另外，胱氨酸的存在改善了蛋白质溶液随后的氧化。
进行上述反应所需的时间，取决于无活性蛋白是以不溶性的包涵体形式存在，还是以氧化的、错误折叠的和聚集的无用蛋白形式存在。对于包涵体，反应时间一般需要2-3小时，而对于无用蛋白，45-60分钟一般就足够了。
上述反应进行足够时间后，以透滤法，优选部分透滤法，使含有已溶解和还原的蛋白的溶液中SDS和L-半胱氨酸的浓度降低，这种透滤法一般是相对于约0.5至约3倍体积(优选约1倍体积)的不含变性剂和还原剂的第二碱性缓冲液进行的。第二碱性缓冲液的缓冲盐浓度优选为约35mM至约60mM，更优选约40mM至约50mM，最优选约46mM;其pH值优选约9至约11，更优选约9.6至约10，最优选约9.8。部分透滤操作使SDS和L-半胱氨酸的浓度在氧化步骤前都减少了约70%至约90%，优选约80%。如实施例4所示，相对于高于要求保护的方法中所述体积的缓冲液进行透滤将导致所需氧化蛋白单体产率显著降低。
透滤法的优点在于可使低分子量物质如SDS和L-半胱氨酸的浓度降低，而高分子量物质如蛋白质的浓度则不受影响。
SDS和L-半胱氨酸浓度的降低为随后进行的再氧化步骤创造了有利的环境。此外，通过将蛋白溶液调整至优选为约9.8的碱性pH值，可使留在溶液中的半胱氨酸自然转化为胱氨酸，从而改善了随后的氧化反应以及所需氧化蛋白单体的最终产率。
下一步，在空气存在下将所产生的已溶解和还原的蛋白单体氧化成正确折叠的氧化单体，反应时间优选约24小时。这种氧化单体含有与天然存在的生物活性蛋白一致的二硫键。如上所述，因为在如要求保护的方法中所要求的碱性pH条件下，半胱氨酸自发氧化成已知的氧化剂胱氨酸，所以不需要另加氧化剂。在氧化反应发生足够时间后，可使所得溶液通过装有树脂如Amberlite
IRA-400的离子交换柱，以去除所有残余的SDS。然后，可对含有聚集体衍生单体的流出液进行所需的后续处理步骤。
本发明已经进行了一般性描述，下面的实施例给出了本发明的具体实施方案，其目的在于说明本发明的实施及其优点。可以理解，实施例是以举例说明的方式给出的，决不是要对说明书和权利要求书进行限制。
实施例1用pH9.8的46mM碳酸盐缓冲液，以1∶5的稀释度稀释无用蛋白溶液，所述缓冲液含有21mM碳酸钠和25mM碳酸氢钠，而所述无用蛋白溶液则含有猪生长激素(pST)的共价和非共价聚集体以及少量的pST氧化单体。下一步加入0.2%(W/V)SDS和15mM半胱氨酸(L-半胱氨酸)，使无用蛋白溶解和还原。应用上述浓度的SDS和半胱氨酸，溶解/还原反应基本上在约1小时内完成。下一步在室温下用聚砜膜PM10(截留分子量为10，000道尔顿)，相对于另一46mM碳酸盐缓冲液进行1倍体积的透滤，使SDS和半胱氨酸的浓度迅速降低。经过透滤后，溶液的环境在pH值、pST浓度以及SDS和半胱氨酸/胱氨酸浓度等方面，对于还原pST的自发再折叠均为最佳。
然后，使含有已溶解和还原的pST的溶液进行环境空气氧化约24小时，接着使溶液通过Amberlite
IRA-400柱，以去除残余SDS。然后，对含有聚集体衍生单体的流出液进行后续的处理步骤，包括超滤和层析，以制备纯化的单体pST。
图1A-1E显示了本方法每一步骤的高压液相色谱(HPLC)的色谱图。图1A代表以1∶5稀释的无用蛋白溶液。如图1B中的色谱图所画出的，在0.2%SDS变性和15mM半胱氨酸还原1小时后，原来存在于图1A中的代表氧化单体(OM)的峰消失，而出现了代表还原单体(RM)的更大的峰。这表明，在无用蛋白溶液中存在的pST聚集体和氧化单体均已被有效还原。如图1C所示，在1倍体积透滤后，OM峰显著增大，而RM峰减小。在再氧化13(图1D)和24(图1E)小时后，RM峰基本消失，而OM峰大致增至初始OM峰的约3倍。这表明已成功地完成了再氧化。如图1E所示的数据所表明的，1.55克/升OM源自起初存在于稀释的无用蛋白溶液(如图1A所示)中的0.53克/升OM。这种增加归因于pST聚集体转化为pST单体。
实施例2图2A给出了两幅得自凝胶渗透色谱(GPC)的色谱图，其中之一是在实施例1的聚集体再循环过程之前完成的，另一幅则是在其后完成的。实线代表未稀释的无用蛋白溶液，而虚线代表得自Amberlite IRA-400柱的产物流出液。图2B所报告的数字给出了GPC单体(GM)的ppm数以及pST聚合物或高分子量杂质与pST单体的比率。这一称为P/M比率的比率，被用来度量样本的纯度。P/M比率越小，样本越纯。
图2A和2B表明，当将含有174ppmGM和大量pST聚集体、P/M比率为42.4的无用蛋白溶液，按照实施例1的聚集体再循环方法进行处理时，GM增加10倍而达到1695ppm，而P/M比率降至4.1。GM和P/M的这一剧烈变化是由于pST聚集体转化成pST单体。
实施例3将含有δ7-pST(在氨基酸顺序的N末端缺失头7个氨基酸的pST)的包涵体从大肠杆菌菌株HB101中分离出来，该菌株是在美国专利4，788，144所公开的δ7-pST制备条件下进行培养的。将细胞从发酵液中离心出来，并再悬浮于pH7.8的含20mMEDTA的0.1M磷酸钠缓冲液中，在8，000-10，000磅/平方英寸的压力下，使细胞两次通过Manton-Gaulin匀浆器以裂解细胞。将粗制的包涵体再次离心出来，并用pH7.5、含10mMEDTA的0.176M磷酸钠缓冲液再洗涤两次，每次洗涤后进行离心。经过洗涤的包涵体用pH9.8的46mM碳酸盐缓冲液以1∶40稀释度稀释，该缓冲液含21mM碳酸钠和25mM碳酸氢钠。下一步加入0.2%(W/V)SDS和15mML-半胱氨酸，使包涵体溶解和还原。在室温下搅拌混合物2小时15分。在溶解和还原结束后，HPLC分析表明RM为16.8克/升，而OM消失。然后在室温下将混合物用PM10膜对1倍体积的另一46mM碳酸盐缓冲液进行透滤。HPLC分析表明透滤液含有14.4克/升RM和0.96克/升OM。
然后，对经过透滤的溶液进行环境空气氧化约20小时。在氧化反应结束后，OM大致增至10.0克/升，RM降至0.52克/升。这表明氧化反应实质上已完成。
这些结果表明，本发明可用于从包涵体中回收氧化的单体。
实施例4用pH9.8的46mM碳酸盐缓冲液，以1∶5的稀释度稀释无用蛋白溶液，所述缓冲液含有21mM碳酸钠和25mM碳酸氢钠，而所述无用蛋白溶液则含有pST的共价和非共价聚集体以及pST的氧化单体。稀释的无用蛋白溶液中OM的浓度，经HPLC测定为0.26克/升。下一步加入0.16%(W/V)SDS和13mML-半胱氨酸，使无用蛋白溶液溶解和还原。在室温下搅拌混合物约3小时，然后在室温下将混合物用PM10膜对15倍体积的另一46mM碳酸盐溶液进行透滤，以完全去除SDS和L-半胱氨酸。
在2倍、4倍和15倍体积缓冲液交换后，从样本中取等分试样。它们分别代表了“部分”(70-90%)、“基本”(90-99%)和“全部”(100%)去除了溶解剂(SDS)和还原剂(L-半胱氨酸)。所有试样在室温下和空气存在下氧化24小时，然后用HPLC法分析OM浓度。2倍、4倍和15倍体积样本的HPLCOM分别为0.38、0.29和0.075克/升。以RM的所有峰消失证实所有氧化均已完成。
此结果表明，完全去除溶解剂和还原剂会对所需蛋白单体的高收率回收产生不利影响。
实施例5用pH9.8的46mM碳酸盐缓冲液，以1∶5的稀释度稀释无用蛋白溶液，所述缓冲液含有21mM碳酸钠和25mM碳酸氢钠，而所述无用蛋白溶液则含有pST的共价和非共价聚体以及pST的氧化单体。HPLC分析表明稀释的无用蛋白溶液中OM浓度为0.15克/升。下一步加入0.5(W/V)SDS、60毫克/升EDTA和40mML-半胱氨酸，使无用蛋白溶液溶解和还原。在室温下搅拌混合物1小时。HPLC分析表明，在溶解和还原结束后，RM为0.68克/升。
在有空气存在和室温的条件下，氧化混合物24小时，这一过程中并不去除溶解剂或还原剂。HPLC分析表明RM仍有0.42克/升，而OM则没有测出。
该结果表明不降低溶解剂和还原剂的浓度，就不能达到成功的氧化，也不能达到所需蛋白单体的高收率回收。
权利要求
1.一种从含有无生物活性蛋白的溶液中制取天然生物活性形式重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤a)用第一碱性缓冲液稀释无活性蛋白溶液；b)用足量的变性剂SDS和还原剂L-半胱氨酸处理稀释后的蛋白，以同时溶解和还原所说的蛋白；c)通过相对于第二碱性缓冲液进行透滤，使所得到的溶液中SDS和L-半胱氨酸的浓度下降约70%至约90%；d)氧化(c)步骤的已变性和还原的蛋白，以形成与天然存在的生物活性蛋白一致的二硫键。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)和(c)中的缓冲液的浓度为约35mM至约60mM，pH值为约9至约11。
3.根据权利要求2的方法，其中步骤(a)和(c)中的缓冲液的浓度为约40mM至约50mM，pH值为约9.6至约10。
4.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)的缓冲液稀释后，无活性蛋白的浓度为约0.3mg/ml至约0.6mg/ml。
5.根据权利要求1的方法，其中变性剂为约0.05%至约1.0%的SDS。
6.根据权利要求5的方法，其中变性剂为约0.2%SDS。
7.根据权利要求1的方法，其中还原剂为约5mM至约25mM的L-半胱氨酸。
8.根据权利要求7的方法，其中还原剂为约15mM的L-半胱氨酸。
9.根据权利要求1的方法，其中所说的SDS和L-半胱氨酸浓度的下降是通过相对于约0.5至约3倍体积的所说第二缓冲液进行透滤而发生的。
10.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的氧化是在空气存在下发生的。
11.根据权利要求1的方法，其中蛋白质为生长激素。
12.根据权利要求11的方法，其中生长激素为牛、猪、鸟、羊或人生长激素。
13.根据权利要求12的方法，其中生长激素为猪生长激素。
14.根据权利要求1的方法，其中所说的无活性蛋白以不溶性包涵体形式存在。
15.根据权利要求1的方法，其中所说的无活性蛋白是氧化的、错误折叠的和聚集的无用蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种从含有无活性蛋白的溶液中制取天然生物活性形式重组蛋白的方法，无活性蛋白以不溶性包涵体或氧化的、错误折叠的和聚集的无用蛋白形式存在，该方法包括用第一碱性缓冲液稀释无活性蛋白溶液，加入SDS和L-半胱氨酸以同时溶解和还原该蛋白，相对第二碱性缓冲液进行透滤使SDS和L-半胱氨酸的浓度下降约70％—90％，氧化已变性和还原的蛋白以形成与天然存在的生物活性蛋白一致的二硫键。
文档编号C07K1/113GK1083071SQ9310805
公开日1994年3月2日 申请日期1993年7月1日 优先权日1992年7月2日
发明者E·李, D·A·施维拉, R·-D·杨 申请人:皮特曼-穆尔有限公司