专利名称：二聚体块的合成及其在装配寡核苷酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及寡核苷酸的化学合成。尤其是，本发明涉及具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸的合成。
自从Zamecnik和Stephenson(Proc.Natl.Acad.Sci.75280-284，1978)发现合成的寡核苷酸能抑制劳氏肉瘤病毒的复制以来，人们对使用寡核苷酸和具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸类似物来控制基因调节和处理病理状况表现出极大兴趣。
为了这种目的，已研究出多种方法用于合成寡核苷酸。早期的合成方法包括磷酸二酯和磷酸三酯化学方法。Khorana等(J.Molec.Biol.72209，1972)公开了用于寡核苷酸合成的磷酸二酯化学方法。Reese(Tetrahedron Lett.343143-3179，1978)公开了用于合成寡核苷酸和多核苷酸的磷酸三酯化学方法。这些早期的方法已在很大程度上让位于更有效的亚磷酰胺和H-膦酸酯方法去合成。Beauca-ge和Caruthers(Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)公开了在多核苷酸合成中使用脱氧核苷亚磷酰胺的方法。Agrawal和Zamecn-ik在美国专利No.5149798(1992)中公开了通过H-膦酸酯途径合成寡核苷酸的优化方法。
这两个现代方法都已被用来合成具有各式各样经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild(Tetrahedron Lett.283539-3542，1987)讲授了用亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸甲基膦酸酯(oligonucleotide mathylphosponatas)的方法。Connolly等(Biochemistry 233443，1984)公开了用亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸硫代磷酸酯(oligonucleotide phosphorothioates)的方法。Jager等(Biochemistry 277237，1988)公开了通过亚磷酰胺化学方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯的方法。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857079-7083，1988)公开了通过H-膦酸酯化学方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯(oligonucleotide phosphoramidates)和硫代磷酸酯的方法。
亚磷酰胺化学合成法和H-膦酸酯化学合成法都是在存放于反应容器中的固体支持物上进行的。偶联每一个核苷酸必须的反应步骤包括脱三苯甲基、偶联、加帽和氧化。对于小规模合成(达到1μm摩尔)来说，增加一个核苷酸所需总时间约为6分钟。装配一个30个链节长的寡核苷酸可在180分钟内完成。在这些条件下，合成的寡核苷酸具有化学纯度和生物学活性。然而，当寡核苷酸以较大规模合成(达到1毫摩尔)时，在CPG上增加每一个核苷酸的时间约为50-60分钟，装配一个具有25个链节的寡核苷酸大约需要25小时。时间的增加是由于合成中使用的固体支持物的体积所致。周期时间的增加使已经被装配的寡核苷酸序列暴露于所有反应步骤(包括二氯乙酸步骤、偶联步骤、氧化步骤和加帽步骤)较长的时间。装配总时间的增加不仅影响该化合物的化学性质和生物学性质，也影响其产率。化学性质和生物学性质主要受脱嘌呤作用、碱基修饰等的影响。
为减少这些问题的影响，可以用二聚体或多聚体合成子(Syn-thon)合成寡核苷酸，从而减少周期数，并由此减少合成寡核苷酸所需时间。为达到这一目的，几位研究者都曾为开发出可接受的二聚体或多聚体合成子方法做出了努力。Khorana(Science 203614-625，1979)用磷酸二酯方法，提出了多聚体合成子的概念。Crea和Itakura(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.755765-5769，1978)；Reese(Tetrahedron Lett.343143-3179，1978)；和Ohtsuka等(NucleicAcids Res.106553-6570，1982)都公开了在磷酸三酯方法中使用二聚体或三聚体合成子的方法。Kumar和Poonian(J.Org.Chem.494905-4912，1984)和Wolter等(Nucleosides and Nucleotides 565-77，1986)公开了用二聚体合成子合成寡核苷酸磷酸二酯的亚磷酰胺方法。Marugg等(Nucleic Acids Res.129095-9110，1984)讲述了用二核苷酸硫代磷酸三酯制备含有一个硫代磷酸酯连键的寡核苷酸的方法。Connolly等(Biochemistry 233443，1984)；和Coss-tick和Eckstein(Biochemistry 243630，1985)公开了用亚磷酰胺方法在正在增长的寡核苷酸链上增加一个二核苷酸硫代磷酸酯的方法。Brill和Caruthers(Tetrahedron Lett.283205，1987)公开了合成胸腺嘧啶二核苷酸甲基硫代膦酸酯的方法。Roelen等(NucleicAcids Res.167633-7645，1988)公开了液相反应中用二聚体核苷酸甲基硫代膦酸酯TA在一短的六聚体寡核苷酸中引入单个甲基硫代膦酸酯连键的方法。
上述的研究工作代表了用二聚体或多聚体合成子合成寡核苷酸方法的进展。遗憾的是仍存在一些不足。例如，现有的制备包含有硫代磷酸酯或甲基硫代膦酸酯核苷酸间连键的二聚体核苷酸的化学方法非常复杂。因而，至今已报道的仅有两例含有甲基硫代膦酸酯的二聚体(TT和TA)。而且，没有一个现有的二聚体合成子被成功地用于合成唯一由烷基膦酸酯，氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键的寡核苷酸。因而，人们需要一种用简化的化学方法合成二聚体合成子的新方法，也需要一种用这样的二聚体合成子装配寡核苷酸的新方法。
本发明提供了制备二聚体核苷酸合成子(下文简称二聚体块(dimer block))的新方法，该二聚体块具有经修饰的核苷酸间连键，并最好为烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键。根据本发明这一方面的内容，不管二聚体块中核苷酸间连键为何类型，二聚体块的合成是以单罐液相反应进行的例如，为合成二聚体块烷基膦酸酯，将核苷3′-烷基亚磷酰胺与3′保护的核苷缩合。为合成二聚体块氨基磷酸酯，核苷酸之间H-膦酸酯缩合后加入烷基胺。为合成二聚体块硫代磷酸酯，被保护的单体核苷酸液相偶联，进行核苷酸缩合，产生二聚体后，用一适当硫化剂进行硫化作用。为制备二聚体块烷基硫代膦酸酯，在与所述二聚体块硫代磷酸酯相同的单罐反应中使用烷基亚膦酰胺。这一简单的化学方法首次允许合成所有可能的二聚体块甲基硫代膦酸酯，其中，先前已知的仅有TT和TA，并有助于制备具有3′缩合基的二聚体块。
这样，本发明的第二方面提供了新型的二聚体块，该二聚体块包括含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯连键的GG、GA、GT、GC、AG、AA、AT、AC、TG、TA、TC、TT、CG、CA、CT或CC，并具有各种保护基和缩合基组合。这些新的二聚体块也导致了用这些二聚体块装配含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯连键的寡核苷酸的方法出现。并且，根据本发明的二聚体块首次提供了一种用这些二聚体块装配只含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键、或它们的混合连键的寡核苷酸的方法。
这样，本发明的第三方面提供了用二聚体块装配具有烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯或烷基硫代膦酸酯连键或这些连键组合的寡核苷酸的方法。本发明的一个目的是提供减少寡核苷酸的总装配时间的有效方法。本发明的另一个目的是提供减少寡核苷酸装配所需的总溶剂消耗的有效方法。本发明的又一个目的是提供通过增加全长寡核苷酸的产量，简化寡核苷酸纯化操作的有效方法。本发明的再一个目的是提供通过减少部分装配的寡核苷酸对化学药品暴露的时间来减少副反应的有效方法。本发明的最后一个目的是通过允许使用廉价的液相化学方法来达到半数的总合成反应，减少寡核苷酸装配的总体费用。
图1表示含有硫代磷酸酯的二聚体块5′-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3′-O-甲基硫代磷酸酯-5′-O-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷的合成步骤。图中，(a)是无水乙腈和四唑，(b)是Beau-cage试剂，(c)是四氢呋喃和氟化四丁铵，(d)是在二氯甲烷和4-甲基吗啉中的三氯亚磷和三唑，DMT是二甲氧基三苯甲基，TBDMS是叔丁基二甲基甲硅烷基，Et3NH+是三乙基铵。
图2表示含有硫代磷酸酯的二聚体块5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷-3′-O-甲基硫代膦酸酯-5′-O-胸苷的合成步骤。图中，(a)是乙腈和四唑，(b)是Beau-cage试剂，(c)是乙酸吡啶和水合肼，(d)是二氯甲烷和4-甲基吗啡中的三氯亚磷和三唑，DMT是二甲氧基三苯甲基，Lev是乙酰丙酰基(levulinyl)，Et3NH+是三乙基铵。合成相应二聚体块甲基膦酸酯的方法，除在步骤(b)中用I2代替Beaucage试剂外，其余相同。
图3表示含有硫代磷酸酯的二聚体块5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷-3′-O-氰乙基硫代磷酸酯-5′-O-胸苷的合成步骤。标示同图2。
图4表示含有硫代磷酸酯的二聚体块5′-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2′-脱氧腺苷-3′-O-硫代磷酸酯5′-O-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷的合成步骤。标示同图2。
图5表示根据本发明的二聚体块，其中，R1是诸如二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或三苯甲基的保护基，L是烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键，R2是羟基、或β-氰乙基亚磷酰胺或H-膦酸酯缩合基，或诸如乙酰丙酰基、叔丁基、或二甲基甲硅烷基的保护基，B1是G、A、T或C，B2是G、A、T或C。
本发明涉及用于装配寡核苷酸的试剂和方法。尤其是本发明涉及装配具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸。
首先，本发明提供了制备二聚体块的新方法。二聚体块是具有经修饰的核苷酸间连键和具有5′-羟基端封闭基的核苷酸二聚体。优选的封闭基包括叔丁基二甲基甲硅烷基，二甲氧基三苯甲基、乙酰丙酰基、单甲氧基三苯甲基和三苯甲基。二聚体块的3′位可以有封闭基、自由羟基、H-膦酸酯、磷酸三酯、或β-氰乙基亚磷酰胺基。优选的经修饰的核苷酸间连键包括硫代磷酸酯、烷基膦酸酯和烷基硫代膦酸酯连键。二聚体块的经修饰的连键有一个烷氧基或烷基。
从一般意义上来说，根据本发明合成二聚体块的方法可被认为是一种合成具有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键的二聚体单元的方法，该方法包括以下步骤(a)将第一个5′端有保护基，3′端有缩合基的核苷衍生物与第二个3′端有保护基，5′端有羟基的核苷衍生物缩合，形成一个具有还原的核苷酸间连键的二核苷酸衍生物，和(b)用适当的氧化剂将核苷酸间连键氧化，产生二聚体块烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代磷酸酯。
准确的二聚体块的获得，当然依赖于如下表1所示的第一个核苷衍生物和氧化剂的种类。
表1二聚体块的合成二聚体块类型 第一个核苷衍生物 氧化剂烷基膦酸酯核苷-3′-烷基N，N-二异丙 碘基亚磷酰胺氨基磷酸酯核苷-3′-H-膦酸酯 烷基或芳基胺硫代磷酸酯核苷-3′-O-烷基N，N-二异丙基亚磷酰胺硫化剂或核苷-3′-H-膦酸酯烷基硫代膦核苷-3′-烷基N，N-二异丙 硫化剂酸酯 基亚磷酰胺本发明这一方面内容的第一个实施方案中，用这一方法制备了具有5′和3′封闭基和硫代磷酸酯核苷酸间连键的二聚体块。在此实施方案中，该方法包括以下步骤(a)通过亚磷酰胺或H-膦酸酯化学方法，将具有5′封闭基的核苷和具有3′封闭基的核苷连接，和(b)加入适宜的硫化剂，如Beaucage试剂。Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二硫酚-3-(一)1，1-二氧化物)在美国专利US NO.5003097中有讲述，其内容通过参考在此引入。
硫代磷酸酯二聚体块也可用三酯方法制备。这种情况下，5′-DMT保护的核苷将首先由硫代磷酸化试剂转变为活性中间体，然后与5′-羟基核苷偶联，生成硫代磷酸酯二聚体。然后，该二聚体可被亚磷酸酯化(Phosphitylated)，并用作装配寡核苷酸硫代磷酸酯和其类似物的合成子。
在本发明这一方面内容的第二个实施方案中，用这一方法制备具有5′封闭基、3′自由羟基和硫代磷酸酯核苷酸间连键的二聚体块。在此实施方案中。该方法包括上述第一个实施方案中的(a)和(b)步骤，还包括对3′-羟基去保护的步骤(c)。这是通过使用仅除去3′保护基的选择性条件达到的。例如，若5′保护基是二甲氧基三苯甲基，单甲氧基三苯甲基或三苯甲基，3′基是叔丁基二甲基甲硅烷基，则3′基的选择性去除是通过用氟化四丁基胺处理获得的。另外，若5′基是二甲氧基三苯甲基，单甲氧基三苯甲基或三苯甲基，3′基是乙酰丙酰基，3′基的选择性去除是通过在吡啶/乙酸中用水合肼处理获得的。
在本发明这一方面内容的第三个实施方案中，用这一方法制备具有5′封闭基，3′H-膦酸酯基和硫代磷酸酯核苷酸间连键的二聚体块。在这一实施方案中，该方法包括上述前两个实施方案的(a)、(b)和(c)步骤，还包括将自由3′羟基转变为H-膦酸酯基的步骤(d)。该转变反应在下面实施例5中给予详细描述。
在本发明这一方面内容的第四个实施方案中，用这一方法制备具有5′封闭基，3′β-氰乙基亚磷酰胺基和硫代磷酸酯核苷酸间连键的二聚体块。在这一实施方案中，该方法包括上述前两个实施方案的(a)、(b)和(c)步骤，还包括将自由3′羟基转化为β-氰乙基亚磷酰胺基的步骤(d)。该转变反应在下面实施例8中给予详细描述。
本领域的普通技术人员将认识到，作为第三和第四实施方案的改变，根据已公知的方法，可制备出具有磷酸三酯3′基的二聚体块。
在本发明这一方面内容的其它实施方案中，用该方法制备具有5′封闭基，烷基硫代膦酸酯、烷基膦酸酯或氨基磷酸酯核苷酸间连键，和可能为封闭基、自由羟基、H-膦酸酯基、β-氰乙基氨基磷酸酯基，或磷酸三酯基的3′基的二聚体块。在这些实施方案中，除起始物为核苷烷基亚磷酰胺外，本方法就按上文所述四个实施方案进行以制备二聚体块烷基硫代膦酸酯。类似的二聚体块烷基膦酸酯是按与二聚体块烷基硫代膦酸酯相同的方式制备的，只是用I2取代硫化剂，类似的二聚体块氨基磷酸酯是用H-膦酸酯缩合，再用烷基或芳基胺氧化该连键而制备的。
本发明第一方面提供了一种制备二聚体块产物的方法，该二聚体块产物作为装配具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸的中间体是非常有用的。人们能够在一个罐反应中制备这些二聚体块，大大简化了其制备方法。
第二方面，本发明提供了具有5′封闭基，被修饰的核苷酸间连键，和，可能是封闭基、自由羟基、H-膦酸酯基、或一些情况下为β-氰乙基亚磷酰胺或磷酯三酯基的3′基的新二聚体块产物。制备这些二聚体块的方法与该二聚体块中的核苷酸序列无关，因而，可以制备含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯连键的所有可能的二聚体序列，即，GG、GA、GT、GC、AG、AA、AT、AC、TG、TA、TT、TC、CG、CA、CT和CC。这些二聚体示于图5。
第三方面，本发明提供了一个用二聚体块装配具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸的方法。在这一方面，具有经修饰的核苷酸间连键(即硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯)的二聚体块被用来装配具有如此经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸(使用具有5′封闭基和3′β-氰乙基亚磷酰胺基或H-膦酸酯基的二聚体块)。然后，根据亚磷酰胺方法或H-膦酸酯方法进行合成反应。寡核苷酸与二聚体块合成的支持物可以是可溶性聚合体，也可以是不溶性的CPG和聚合物珠。本领域的一般技术人员将认识到，用这一方法也可方便地合成混合的磷酸酯骨架的寡核苷酸，即，具有硫代磷酸酯和烷基硫代膦酸酯，或磷酸二酯和烷基硫代膦酸酯，或磷酸二酯和烷基硫代膦酸酯连键，或这里讲述的经修饰的连键之间，或与磷酸二酯连键之间的任何一种组合的寡核苷酸。
根据本发明这一方面的方法提供了相对于寡核苷酸单体合成方法来说的几个优点。首先，由于只需要半数的反应循环，总装配时间减少一半，对于大规模合成来说，合成一个寡核苷酸的时间可节省12小时或更多。这一时间的缩短也导致副反应减少，这是因为部分装配的寡核苷酸暴露于化学药品中较短的时间。该方法还通过提高全长寡核苷酸的比率从而便于寡核苷酸的纯化，这是因为，该比率与反应进行的循环数呈反比。最后，本方法通过减少一半的溶剂消耗和允许使用廉价的液相化学方法进行半数的总合成反应，从而减少合成的费用。本方法将这些优点扩展至全部为硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯连键的寡核苷酸和具有上述连键的任一组合的寡核苷酸。
下述实施例的目的是为更一步说明根据本发明方法的一些优选的实施方案，不是为了限定本发明的内容。
实施例15′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷的液相合成该被保护的二聚体块的合成方法示于图1。该二聚体块用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
将5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-0-甲基N，N-二异丙基亚磷酰胺，1、(1.4g，2毫摩尔)与N4-苯甲酰基-3′-O(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2′-脱氧胞苷，2，(0.88g，2毫摩尔)的混合物溶于无水乙腈(25ml)，并加入四唑溶液(0.45M，10ml)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。加入Beaucage试剂(0.6g溶于15ml无水乙腈中)，并将混合物继续搅拌15分钟。在减压状态下，蒸发该反应混合物，以除去大部分的乙腈。将粗反应产物用二氯甲烷提取，并用盐水洗涤。将有机层在Na2SO4上干燥，并蒸发至干，得到3。将产物3重新溶于四氢呋喃(16ml)，并用1M氟化四丁铵溶液(3ml，THF)处理15分钟。将反应混合物蒸发至几乎干燥状态，并在二氯甲烷和水之间进行分配。将有机层在Na2SO4上进行干燥，并蒸发至较小的体积。用硅胶(2.5×20cm)柱层析技术将该产物纯化。用含0-7％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)溶液将二聚体块产物，4，洗提出来；得到1.3g(产率70％)；未经优化。
31P NMR＝70.06实施例25′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-胸苷的液相合成该二聚体块的合成步骤示于图2，它用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
将N4-苯甲酰基5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧胞苷-3′-O-甲基N，N-二异丙基亚磷酰胺，6，(1.6g，2毫摩尔)和3′-O-乙酰丙酰基-胸苷，7，(0.68g，2毫摩尔)的混合物溶于无水乙腈(25ml)，并加入四唑溶液(0.45M，10ml)。将该反应混合物在室温下搅拌15分钟。加入Beaucage试剂(0.6g溶于15ml无水乙腈中)，并将该反应混合物继续搅拌15分钟。然后，将该反应混合物蒸发，以除去大部分溶剂。用二氯甲烷将粗反应产物抽提，并用盐水洗涤，得到8。将二氯甲烷蒸发，把固态残余物重新溶于20ml吡啶，并与20ml含有1M水合肼的吡啶/乙酸(3/2)溶液混合。搅拌该反应混合物5分钟。然后，将该反应混合物在冰浴中冷却，并加入4ml乙酰丙酮，以猝灭多余的水合肼。将该混合物蒸发至较小体积，然后直接用于硅胶柱层析(2.5×25cm)。将二聚体块产物，9，用含有0-7％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)洗提出来，得到1.25g(产率67％)。
31P·NMR＝69.86。
实施例35′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷-3′-O-氰乙基硫代磷酸酯-5′-O-胸苷的液相合成该二聚体块的合成步骤示于图3，它用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
将N4-苯甲酰基-5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧胞苷-3′-O-β-氰乙基，N，N-二异丙基亚磷酰胺，11，(1.7g，2毫摩尔)和3′-O-乙酰丙酰基-胸苷，7，(0.68g，2毫摩尔)混合物溶于无水乙腈(25ml)，并加入四唑溶液(0.45M，10ml)。将该反应混合物在室温下搅拌15分钟。加入Beaucage试剂(0.6g溶于15ml无水乙腈中)，并继续进行反应15分钟。蒸发该反应混合物，以除去大部分溶剂。纯化产物12。以实施例2中，用于产物9描述的相同方法，用水合肼进行去保护反应。用硅胶柱纯化后得到二聚体块，产物13，1.2g(产率59％)。
31P NMR＝67.80。
实施例45′-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2′-脱氧腺苷-3′-O-硫代磷酸酯5′-O-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷的液相合成该二聚体块的合成步骤示于图4，该二聚体块用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
将N4-苯甲酰基-5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧胞苷-3′-O-甲基N，N-二异丙基亚磷酰胺，15，(4g，5毫摩尔)和3′-O-乙酰丙酰基-N6-苯甲酰基-2′-脱氧腺苷，16，(2g，4.4毫摩尔)的混合物溶于无水乙腈(18ml)，并加入四唑溶液(0.45M，22ml)。室温下搅拌该反应混合物30分钟，然后用Beaucage试剂(1.4g溶于25ml无水乙腈)处理15分钟。然后，蒸发该反应混合物以除去大部分溶剂。将该粗反应产物用二氯甲烷抽提，并用盐水洗涤。蒸发二氯甲烷，得到固态产物，17，然后将其重新溶于40ml吡啶，并加入40ml水合肼浓度为1M的吡啶/乙酸(3/2)溶液。7分钟后，用冰将反应淬火，用二氯甲烷抽提该产物，然后用水洗涤。将有机层在硫酸钠上干燥，然后与甲苯共同蒸发至干燥。将该混合物重新溶于少量二氯甲烷中并用硅胶柱层析(5×12cm)纯化。用含有0-7％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)洗提二聚体块产物18，得到3.8g(产率79％)。
31P NMR＝69.84，69.89。
实施例5二聚体块的H-膦酸酯衍生作用在含有4.9g(70毫摩尔)三唑的二氯甲烷中(60ml)加入0.62ml三氯亚磷(7毫摩尔)，然后再加入4-甲基吗啉(7.8ml，70毫摩尔)。室温下搅拌该混合物30分钟，然后用冰浴冷却。逐滴加入根据实施例1制备的、溶于二氯甲烷(20ml)中的、全保护的二聚体块，4，5′-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-N4-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷(1.3g，1.4毫摩尔)的溶液，然后室温下搅动该混合物30分钟。用1M TEAB缓冲液(pH7.5)将反应淬灭。用二氯甲烷抽提该混合物，用1M TEAB洗涤一次。将有机提取物蒸发，得到固态残余物，用硅胶柱层析技术(2.5×20cm)进一步纯化，用含有O-10％甲醇的二氯甲烷(0.2％TEA)洗提，得到0.97g(产率63％)的H-膦酸酯衍生化的二聚体块5。
31P NMR＝PV70.0，PIII3.8。
分别根据实施例2、3和4制备的二聚体块9，13，和18的H-膦酸酯衍生物是通过上述方法合成的，从而分别得到H-膦酸酯衍生化的二聚体块10，14和19。
实施例6用H-膦酸酯衍生化的二聚体块装配合有硫代磷酸酯的寡核苷酸寡核苷酸的装配是在1微摩尔的规模上使用美国专利US NO.5149798讲述的在自动合成仪(Millipore Model 8700)上用H-膦酸酯方法(在此引用作为参考)进行的。二聚体块H-膦酸酯10是溶于乙腈/吡啶(1∶1；V/V)的10mM混合溶液中并存于DNA合成仪的U形贮存管内。合成了下述两种寡核苷酸寡核苷酸15′TCCTTCT寡核苷酸25′TCCTTCT寡核苷酸1是用核苷H-膦酸酯为合成子合成的。对于寡核苷酸2的装配来说，前两个偶联是用核苷H-膦酸酯进行的，然后与根据实施例2和5制备的二聚体块H-膦酸酯10偶联。最后两个偶联是用核苷H-膦酸酯进行的。
在寡核苷酸1和2装配的最后，GPG连接的寡核苷H-膦酸酯中间体是用三乙胺/吡啶/二硫化碳(1∶10∶10；V/V/V)中的5％元素硫氧化的，从而将H-膦酸酯连接转化成硫代磷酸酯连接。去保护反应是在浓缩氨中，55℃下进行10小时完成的。
产物的分析是用高性能毛细管电泳、离子交换HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行的。寡核苷酸1和2的结果相似。
用一个二核苷酸H-膦酸酯5单元成功地装配寡核苷酸2之后，用实施例1和5制备的核苷H-膦酸酯和二聚体块H-膦酸酯，4，合成下列具有25个链节的寡核苷酸3。
寡核苷酸35′CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT3′在有下标线的地方，是用二聚体块H-膦酸酯4进行偶联的。其余序列是用核苷H-膦酸酯装配的。上述序列的装配完成后，用三乙胺/吡啶/二硫化碳(1∶10∶10；V/V/V)中5％的元素硫将CPG连接的寡聚体氧化，从而将H-膦酸酯连接转化为硫代磷酸酯连接。甲氧基是用苯硫酚处理而除去的。然后，寡核苷酸的去保护是在浓缩的氢氧化胺中，在55℃下进行10小时而完成的。
通过高性能毛细管电泳、离子交换HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析寡核苷酸。
实施例75′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷基(thymidyl)-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-胸苷的液相合成该二聚体块用于合成含有烷基硫代膦酸酯的寡核苷酸的亚磷酰胺方法的步骤示于图5。
将5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-甲基N，N-二异丙基亚磷酰胺(0.5g，0.74毫摩尔)和3′-O-乙酰丙酰基-胸苷(0.25g，0.7毫摩尔)的混合物溶于无水乙腈(7ml)，并加入四唑溶液(0.45M，3.5ml)。室温下搅动该反应混合物30分钟，用Beaucage试剂(0.29g溶于10ml无水乙腈)处理15分钟，然后蒸发，以除去大部分溶剂。将粗反应产物用二氯甲烷抽提，并用盐水洗涤。除去二氯甲烷后，将该物质再溶于7.5ml吡啶，并加入含有1M水合肼的吡啶/乙酸(3/2)溶液7.5ml。5分钟后，在冰浴中冷却该反应混合物，加入2ml乙酰丙酮，以淬灭过量的水合肼。将该混合物蒸发至较小体积；然后直接加样至硅胶柱(2.5×25cm)。用含有0-5％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)溶液洗提二聚体块产物，22，得到0.5g(产率82％)。
31P NMR＝97.7，99.0。
实施例8含有烷基硫代膦酸酯的二聚体块的β-氰乙基亚磷酰胺衍生化作用在溶于无水THF(5ml)中的、根据实施例7制备的全保护二聚体块22，5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷基-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-胸苷(0.5g，0.58毫摩尔)的溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.42ml，2.4毫摩尔)，然后再加入β-氰乙基N，N-二异丙基氯化亚磷酰胺(0.27ml，1.2毫摩尔)。在室温下氮气中搅动该反应混合物30分钟，硅胶TLC(含10％三乙胺的乙酸乙酯)的结果显示，反应是完全进行的。将沉淀物过滤后，蒸发反应混合物。将产物用乙酸乙酯抽提，并用碳酸氢钠和盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥后，将β-氰乙基亚磷酰胺衍生化的二聚体块产物，23，蒸发至较小体积，然后在己烷(-78℃)中沉淀。得到0.51g(产率81％)。
31P NMR＝PV97.7，99.0；PIII149.3，149.7。
这一方法同样用于制备含有硫代磷酸酯的二聚体块的β-氰乙基亚磷酰胺衍生物。实施例2、4和1中分别制备的含有硫代磷酸酯的二聚体块9、18和4，被用于上述方法，以分别获得β-氰乙基亚磷酰胺衍生化的二聚体块24、25和26。
实施例9用含有烷基硫代膦酸酯的二聚体块亚磷酰胺装配含有烷基硫代膦酸酯的寡核苷酸寡核苷酸的装配是在1微摩尔的规模上，在自动合成仪(Milli-pore Model 8700)上用标准亚磷酰胺方法(参见美国专利US NO.5047524，其内容通过参考在此引入)和碘氧化方法进行的。将甲基硫代膦酸酯二聚体亚磷酰胺23溶于无水乙腈(25mg/ml)并存于DNA合成仪的U形存贮管内。合成出了下列寡核苷酸寡核苷酸4 5′TTTTTTTT寡核苷酸5 5′TTTTTTTT合成寡核苷酸4时，前两个偶联是用保护的胸苷亚磷酰胺(用碘氧化)，然后用甲基硫代膦酸酯二聚体偶联(无氧化)。最后三个偶联是用保护的胸苷亚磷酰胺进行的(用碘氧化)。最后，去保护是在室温下用浓缩氨进行1小时而完成的。产物的分析是用高性能毛细管电泳和反相HPLC进行的。
在反相HPLC中，寡核苷酸4的保留时间为18.96分钟、而寡核苷酸5的保留时间为17.11分钟。寡核苷酸5保留时间的增加正是由于其含有的一个甲基硫代膦酸酯连接而使其疏水性增加的一个标志。
实施例105′-二甲氧基三苯甲基-胸苷基-3′-O-膦酸甲酯-5′-O-胸苷的液相合成将5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-甲基N，N-二异丙基亚磷酰胺(0.5g，0.74毫摩尔)和3′-O-乙酰丙酰基-胸苷(0.17g，0.5毫摩尔)的混合物溶于无水乙腈(7ml)，并加入四唑溶液(0.45M，3.5ml)。室温下搅动该反应混合物30分钟，然后在二氯甲烷和水之间分配。将有机层在无水硫酸钠上干燥，并蒸干。在残余物中，加入10ml含2.5％碘的2，6-二甲基吡啶/水/THF(1∶1∶2)溶液，并搅动15分钟。将该混合物例入亚硫酸氢钠溶液中，并用二氯甲烷抽提。将溶剂除去后，将产物再溶入5ml吡啶，加入5ml含1M水合肼的吡啶/乙酸(3∶2)溶液。7分钟后，用冰将反应混合物骤冷，用二氯甲烷和水进行抽提。将该混合物在无水硫酸钠上干燥并蒸干。将二聚体块产物在硅胶柱(2.5×25cm)上用含0-5％甲醇的二氯甲烷溶液(0.5％吡啶)进行纯化，得到0.25g(产物60％)。
31P NMR＝32.4，33。
二聚体块烷基膦酸酯的所有其它序列都可用同样的方式制备。为了将这些具有3′羟基的二聚体块转化成它们的H-膦酸酯或β-氰乙基亚磷酰胺衍生物，可将3′羟基二聚体块分别根据实施例5或实施例8的方法处理。
实施例115′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷基-3′-O-正丁基氨基磷酸酯-5′-O-胸苷的液相合成将5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-H-膦酸酯三乙胺盐(0.5g，0.7毫摩尔)和3′-O-乙酰丙酰基-胸苷(0.2g，0.6毫摩尔)的混合物溶于6ml无水吡啶/乙腈(1∶1)，并加入溶于同一溶剂(6ml)中的1-金刚烷碳酰氯(0.7g，0.5毫摩尔)。室温下搅动该反应混合物15分钟，然后在二氯甲烷和水之间分配。将有机层在无水硫酸钠上干燥并蒸干。在残余物中加入10ml含有2％正丁胺的四氯化碳溶液，搅动20分钟。将产物用二氯甲烷抽提，并用水洗涤。除去溶剂后，将残余物再溶于5ml吡啶，加入5ml含1M水合肼的吡啶/乙酸(3∶2)溶液。7分钟后，将反应混合物用冰骤冷，并用二氯甲烷和水抽提。将混合物在无水硫酸钠上干燥，并蒸干。将正丁基氨基磷酸酯二聚体块产物在硅胶柱(2.5×25cm)上用含有0-5％甲醇的二氯甲烷溶液(0.5％吡啶)纯化，得到0.4g(产率74％)。
31P NMR＝10.9。
二聚体块氨基磷酸酯的所有其它序列都可用相同的方式制备。通过将正丁胺替换成另一烷基胺或芳基胺可改变该氨化物的性质。为了将这些具有3′-羟基的二聚体块转化成它们的H-膦酸酯或亚磷酰胺衍生物，可将3′羟基二聚体块分别根据实施例5或实施例8的方法进行处理。
权利要求
1.一种合成具有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键的二聚体块的方法，该方法包括以下步骤(a)将第一个具有5′端保护基和3′端缩合基的核苷衍生物，与第二个具有3′端保护基和5′端羟基的核苷衍生物缩合，形成具有还原的核苷酸间连键的二核苷酸衍生物，(b)用一适当的氧化剂氧化该核苷酸间连键，生成二聚体块烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯。
2.根据权利要求1的方法，其中，该核苷酸间连键是氨基磷酸酯连接，该第一个核苷衍生物是一个具有H-膦酸酯缩合基，5′端保护的核苷，并且该氧化剂为烷基胺或芳基胺。
3.根据权利要求1的方法，其中，该核苷间连键是烷基膦酸酯连键，该第一个核苷衍生物是5′保护的核苷-3′-烷基N，N-二异丙基氨基磷酸酯，并且该氧化剂为碘。
4.根据权利要求1的方法，其中，该核苷酸间连键为烷基硫代膦酸酯连键，该第一个核苷衍生物是一个5′保护的核苷-3′-烷基N，N-二异丙基氨基磷酸酯，并且该氧化剂为硫化试剂。
5.根据权利要求1的方法，其中，该核苷酸间连键为硫代磷酸酯连键，该第一个核苷衍生物是一个5′保护的核苷-3′-O-烷基N，N-二异丙基氨基磷酸酯或核苷3′-H-膦酸酯，并且该氧化剂为硫化试剂。
6.如图5所示的二聚体块，其中，P为保护基，L为烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯基，G为保护基、羟基、或亚磷酰胺或H-膦酸酯基，B1为G、A、T或C，B2为G、A、T或C。
7.根据权利要求6的二聚体块，其中，L为烷基膦酸酯基。
8.根据权利要求6的二聚体块，其中，L为氨基磷酸酯基。
9.根据权利要求6的二聚体块，其中，L为硫代磷酸酯基。
10.根据权利要求6的二聚体块，其中，L为烷基硫代膦酸酯基。
11.根据权利要求6的二聚体块，其中，G为亚磷酰胺基或H-膦酸酯基。
12.用二聚体块装配含有氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯和/或烷基硫代膦酸酯核苷酸间连键的寡核苷酸的方法，该方法包括以下步骤将根据权利要求11的二聚体块与正在增长的寡核苷酸链上的自由5′羟基缩合，或与连接于固体支持物上的自由羟基缩合。
全文摘要
本发明提供了用简化的化学方法合成二聚体块(具有经修饰的核苷间连接的二核苷衍生物)的方法、新型的二聚体块和用二聚体块装配具有经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸的方法。
文档编号C07H21/00GK1122137SQ94191181
公开日1996年5月8日 申请日期1994年1月7日 优先权日1993年1月8日
发明者汤锦炎, 帕特里夏·L·亚达罗拉, 休德海尔·阿格里沃尔 申请人:海布里顿公司