抗体纯化的制作方法

专利名称：抗体纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域。更具体地，本发明涉及将疏水相互作用层析(HIC)用于分离免疫球蛋白G单体，以及在一种联合层析方法中联用HIC以进行IgG抗体分子的纯化。
背景技术：
历史上，蛋白纯化方案基于待纯化的蛋白质与不期望的蛋白污染物之间分子的大小，电荷和溶解度性质的差异。基于这些参数的方法包括分子排阻层析、离子交换层析和差速沉淀等。
分子排阻层析，或被称为凝胶过滤或凝胶渗透层析，基于流动相中大分子穿入固定相颗粒的孔中。差速穿入是颗粒流体体积的作用。因此，在理想条件下，较大的分子从颗粒内部逐出而较小的分子可进入此体积，洗脱顺序可通过蛋白大小预测，因为在洗脱体积和分子量对数之间存在线性关系。
层析支持物基于交联葡聚糖如SEPHADEX，球形琼脂糖珠和SEPHAROSE(可从瑞典的Pharmacia AB.Uppsala购得)，基于交联的聚丙烯酰胺如BIO-GEL(从BioRad Laboratories，Richmond，Caiifornia购得)或基于乙烯二醇-异丁烯酸共聚物如TOYOPEARLHW65(从Toso Haas Co.，Tokyo，Japan商品购得)在本发明某些方面的实施中，用于形成分子排阻或HIC层析的各种层析柱。
沉淀法基于这样一个事实，即蛋白质粗混合物中，蛋白质各自的溶解度常常有较大不同。虽然在水溶性介质中，蛋白质的溶解度依赖于多种因素，但是就这种讨论而言，一般说来，如果一种蛋白质与溶剂的相互作用比与它相同或相似的蛋白质分子的相互作用强，则该蛋白质是可溶的。未想与描述沉淀现象的特殊作用机制理论结合，然而相信蛋白质与水分子之间的相互作用可通过氢键产生，借助于几种不带电基团和/或静电的，如偶极子，带电基团及沉淀剂如单价阳离子盐(如硫酸铵)与蛋白质竞争水分子。因而在高盐浓度下，蛋白质被“脱水”减小了与水环境的相互作用，增加了与相似蛋白质的聚集作用，导致从介质中沉淀。
离子交换层析涉及样品中带电的功能基团与吸附剂表面相反电荷的离子功能基团的相互作用。已知两种普遍的相互作用。阴离子交换层析通过带负电的氨基酸侧链(如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电的表面相互作用介导，阳离子交换层析以带正电的氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)与带负电的表面相互作用介导。
最近已发展亲合层析和疏水相互作用层析技术以补充较传统的大小排阻和离子交换层析方法。亲合层析依赖于蛋白质与一种固定化配基的特异性相互作用，该配基对感兴趣的具体的蛋白是专一的，该配基可以是底物、底物类似物、抑制剂、受体或抗体。或者该配基能与一些相关蛋白反应。可使用基团特异配基如磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或某些染料来回收一特定种类的蛋白质。
考虑到抗体分子的纯化，可应用特异的或广泛的亲合技术。抗体亲合纯化的最专一配基选择是与目的抗体反应的抗原(或其抗原决定簇)。许多已知的免疫吸附剂试验如酶联免疫吸附试验(ELISA)便基于这种特异的抗原/抗体亲合反应。
然而，广泛的亲合技术也有用。例如已知葡萄球菌蛋白A结合IgG类别的某些抗体(见Ey，P.L.et al.Immunochemistry 15429-36(1978))或者可用异源种类抗血清(如兔抗鼠抗血清)分离(见CurrentProtocols in Molecular Biology Supra，Chap 11)。
疏水相互作用层析最早是观察到蛋白质可保留在含有烃间隔臂而缺乏亲合配基的亲合凝胶上之后发展起来的。虽然在此领域有时用术语疏水层析，但优选疏水相互作用层析，因为是疏水的溶质和凝胶之间的相互作用而非层析过程。在高离子强度下疏水相互作用最强，所以这种分离形式在盐沉淀或离子交换过程后便利地进行。从HIC支持物的洗脱受溶剂、pH、离子强度的变化或加入离液剂、有机调节剂如1，2亚乙基二醇或丙二醇的影响。疏水相互作用层析一般原理的叙述见美国专利3,917,527和4,000,098。应用HIC纯化特异蛋白参照下列公开内容举例说明人生长激素(美国专利4,332,717)，毒素偶联物(美国专利4,771,128)，抗溶血因子(美国专利4,743,680)，肿瘤坏死因子(美国专利4,894,439)，白介素-2(美国专利4,908,434)，人淋巴毒素(美国专利4,920,196)和溶菌酶类(Fausnaugh，J.L.and F.E.Regnier J.Chromatog.359131-146(1986))和可溶互补受体(美国专利5,252,216)。在一步法中，HIC和高效液相层析(HPLC)顺序使用从完整抗体分子中分离抗体片段(如F(ab’)2)(Morimoto，K.et al.，J.Biochem.Biophys.Meth.24107-117(1992))。
除亲合和HIC技术外，一种或多种传统蛋白质纯化系统也已用于抗体纯化。例如，Hakalahti，L.等(J.Immunol.Meth.117131-136(1989))公开一种采用相继的两个离子交换层析步骤或者一种离子交换步骤接一个HIC步骤的方法。Danielsson A.等(J.Immunol.Methods 11579-88(1988))分别比较基于阴离子交换、阳离子交换、层析聚焦的一步法和HIC。
虽然蛋白A亲合柱层析已被广泛使用，但也意识到从这种柱上洗脱抗体能导致从支持物上滤掉蛋白A残基。分子排阻HPLC(Das et al.，Analytical Biochem.14527-36(1985))和阴离子交换层析(EPO345549，published Dec.13，1989)被建议为处理这个问题的方法。
现在令人惊奇地发现，HIC可用于从蛋白A层析支持物洗脱的IgG混合物中除去蛋白A污染。
本发明涉及用HIC从含有同样物质的混合物中分离IgG单体，以及将HIC应用到结合蛋白A和离子交换层析的方法中，用于免疫球蛋白G分子的纯化。发明简述本发明涉及通过将所述混合物与疏水相互作用层析支持物接触，从支持物上选择性地洗脱单体从含有相同物质混合物的聚集物中分离IgG单体的方法。
本发明的另一方面提供从含有同样物质的条件细胞培养基中纯化IgG抗体，包括顺序将培养基经过(a)蛋白A，(b)离子交换层析和(c)疏水相互作用层析。
本发明的另一方面提供从包含蛋白A和抗体的混合物中除去蛋白A的方法，包括将所述混合物与疏水相互作用层析支持物接触，并从支持物上选择性洗脱抗体。
附图详述

图1说明根据本发明纯化抗体过程的流程图解。
发明详述本发明涉及已用于大规模纯化免疫球蛋白分子的蛋白质纯化技术。该发明特别有用，因为它可回收＞95％蛋白纯度的IgG单体。本发明也可用于纯化一些不同的免疫球蛋白G分子。
抗体样蛋白质为可通过在此描述的方法纯化的蛋白质，如果需要的话这种方法通过不必过度试验的常规、非发明调整进行改进。这些蛋白包括免疫球蛋白基因的同种型、同种异型和等位基因，截短形式，变化的抗体如嵌合抗体和人化抗体等，化学修饰的形式如被PEG处理，以及含有一种免疫球蛋白部分的融合蛋白。这些蛋白因为具有或保留足够的免疫球蛋白性质(如Fc决定簇)，可以通过本发明方法进行纯化，所以称为类抗体。除非特殊指明，否则术语抗体或免疫球蛋白也包括类抗体蛋白。
本发明的免疫球蛋白分子可从一些来源中分离到， 包括但不限于，免疫动物的血清，腹水流体，杂交瘤或骨髓瘤上清，从培养表达免疫球蛋白分子的重组细胞株和产生免疫球蛋白细胞的所有细胞提取物中得到的条件培养基。本发明对于从产生各种抗体的重组细胞株的条件细胞培养基中纯化抗体特别有用。虽然人们可能预料不同抗体产品之间及细胞株与细胞株之间有些差异，基于这里的公开内容，针对抗体蛋白和产生细胞株的具体组合变通本发明。处于本领域普通技术人员范围之内。
一般地，编码蛋白质如抗体的基因可通过将编码多肽目的区的DNA序列插入重组DNA载体(如载体)，并转化或转染合适的原核或真核宿主来克隆。合适的原核宿主包括但不限于埃希氏菌属，链霉菌属和芽胞杆菌属等。合适的真核宿主包括但不限于酵母，如酵母菌和培养的动物细胞如VERO，Hela，小鼠C127，中国仓鼠卵巢(CHO)，WI-38，BHK，COS，MDCK，骨髓瘤及昆虫细胞株。特别优选的宿主为二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞株，如ATCC CRL 1793，CRL9096及其它下述细胞株。目前，这些重组技术已熟知并在Methods inEnzymology(Academic Press)Volunes65和69(1979)，100和101(1983)以及其中引用的参考文献中有描述。收录最常用的重组DNA方法学的广泛技术讨论见Maniatis等，Molecular Cloning，ColdSpring Aarbor Laboratory(1982 )或Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing，Wiley Interscience(1988，1991，1993)。
获得编码目的多肽如一种抗体分子的DNA片段的一种方法是通过cDNA克隆。此方法中，从已知的或被猜想为产生目的蛋白细胞中分离信使RNA(mRNA)。通过一系列酶促反应，细胞的mRNA群体复制成互补DNA(cDNA)。得到的cDNA然后插入克隆载体，再用来转化一种合适的原核或真核宿主。得到的cDNA“文库”包括转化的宿主细胞群体，其中每个含有一种基因或基因片段。整个文库理论上提供了编码存在于用作起始材料的mRNA混合物信息的代表性样品。该文库可用核酸或抗体探针筛选以鉴别特异的DNA序列。这些DNA序列一旦被分离，可被修饰或组装入完整基因。
一种抗体基因的特殊片段可独立于基因的剩余部分进行改造。编码互补性决定区(CDRs)的DNA片段可从异源种类整合到DNA构架序列产生改变的抗体。这些改动的抗体对治疗不期望的生理疾病有重要用途。如PCT/GB91/01554(公布为WO92/04381)公开对治疗和预防呼吸合胞体病毒(RSV)感染有用的“人化”抗体的生产。或者抗体基因的整个可变区融合到第二抗体的稳定区，形成一种改变的抗体或“嵌合抗体”。如PCT/US92/06194(公布为WO93/02108)公开一种与人CD4受体反应的猴/人嵌合抗体。
一旦抗体基因或基因片段被克隆，该DNA可导入表达载体，该构建物用于转化合适的宿主细胞。一种表达载体具有在此定义的表达调节序列的特性，则当感兴趣的DNA序列可操作地联结其上时，该载体能够指导编码感兴趣DNA序列的产物在含有该载体的宿主细胞中生产。具体到本发明，可能组装单个编码序列的片段以在表达时形成一种抗体分子。这种方法对重组抗体生产的特别有效应用见Harris，et al.，PCTApplications WO92/04381，公布于1992年3月19日，上面已引用，和Newman et al.，PCT Application WO93/02108，公布于1993年2月4日，上面已引用。
重组产物产生后，便想回收产物。如果该产物被产生它的细胞排出，则可直接从细胞培养基中回收。如果该产物保留在细胞内，则要通过机械的、化学的或生物方法破碎细胞体以获得细胞内产物。
就蛋白产物来说，纯化方法不仅提供基本上没有其它蛋白质的蛋白产品，意味着相对于制剂中的总蛋白至少80％并优选大于95％的纯度，还要将其它宿主细胞污染物、DNA、RNA和潜在的热原等消除或减少到可接受水平。再者，顺次通过重组表达系统进行抗体生产中，最好是150,000道尔顿IgG产品聚集物到较高分子量种类中。因此，为了产品的纯度和标准化，从较高分子量聚集体和其它错误折叠形式中分离天然的150,000道尔顿单体种类也是有用的。虽然意识到150,000道尔顿IgG种类含有4个多肽链(2条重链和2条轻链)，该150,000道尔顿种类在此被称为“单体”或“单体IgG”。
如上面提到的， 多种宿主细胞可用于本发明的抗体生产。一种特殊宿主细胞的选择处于一般技术人员考虑的范围之内，特别是抗体的种类，其合成速度、衰变速度以及指导抗体表达的重组载体的特性。宿主细胞表达系统的选择很大程度上支配被采用的细胞培养步骤的种类。具体生产形式的选择，分批或连续，旋转或气升式，液体或固定化的，一旦选择了表达系统便可确定。因此，可采用多种有或没有细胞微载体的反应器，如流化床生物反应器，中空纤维生物反应器，滚瓶培养或搅拌釜生物反应器。这些选择的标准在细胞培养技术中是可接受的。因为它们在本发明的范围之外，在此不作详细说明。本发明涉及抗体的纯化，它们存在于条件细胞培养基，杂交瘤上清液，抗血清，骨髓瘤上清液或腹水液中。
如上提及的，本发明特别涉及疏水相互作用层析(HIC)在抗体分子分离纯化中的应用。疏水分子在水性溶剂中会自联结。这种联结是由于疏水相互作用。现已知如蛋白质的大分子，其表面除期望的亲水基团外还有广泛的疏水小块。
HIC部分基于这些小块与附于层析支持物疏水配基的相互作用。偶联到基质的疏水配基在此不同地称作HIC支持物、HIC凝胶或HIC柱。进一步主张蛋白质和HIC支持物的相互作用强度不仅是蛋白表面上非极性部分与极性表面的作用，而且是非极性表面的分布与HIC支持物的化学性质。
一些层析支持物可用于HIC柱的制备，最广泛使用的是琼脂糖，硅胶及有机聚合物或共聚树脂。有用的疏水配基包括但不限于具有约2到8个碳原子的烷基，如丁基，丙基或辛基；或芳基如苯基。常规用作凝胶或柱的HIC产品可从供应商购得，如瑞典的Pharmacia LKB AB，Uppsala，商品名为丁基-SEPHAROSE，苯基或丁基-SEPHAROSECL-4B，丁基-SEPHAROSEFF，辛基-SEPHAROSEFF；和苯基-SEPHAROSEFF；日本东京的Tosoh公司的产品TOYOPEARL乙醚650，苯基650或丁基650(Fractogel)；以色列Rehovot Miles-Yeda产品烷基-琼脂糖，其中烷基含2-10个碳原子，以及J.T.Baker，Phillipsburg，N.J产品Bakerbond WP-HI-丙基。
也可能用常规化学方法制备需要的HIC柱。(见如Er-el.Z.et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.49383(1972)或Ulbrich，V.et al.，Coll.Czech.Chem.Commun.91466(1964))。
配基密度是一个重要参数，因为它不仅影响相互作用的强度还有柱的容量。商业可买到的苯基或辛基苯基凝胶的配基密度属于40μmoles/ml凝胶床级。凝胶容量与pH、温度和盐的类型与浓度一样，对于待处理的具体蛋白质是一种函数，但一般定为3-20mg/ml凝胶。
特定凝胶的选择可由技术人员确定。一般地随着烷基配基链长度增加，HIC配基与蛋白的相互作用强度增加，但是对大多数分离来说大约4-8个碳原子的配基是合适的。苯基基团与戊基基团具有大约相同的疏水性，虽然由于蛋白质上芳香基团π-π轨道相互作用的可能性使选择性十分不同。选择性还可被支持树脂的化学性质影响。
高盐浓度下蛋白质利于吸附到HIC柱上，但依赖于蛋白质性质和所选的特定HIC配基，准确的盐浓度在广范围内变化。不同离子可在称为soluphobic系列中排序，根据它们是促进疏水相互作用(盐析效应)还是破坏水的结构(离液效应)并导致疏水相互作用的减弱。根据盐析效应的增加，阳离子排列为Ba++＜Ca++＜Mg++＜Li+＜Cs+＜Na+＜K+＜Rb+＜NH+4，而根据离液效应的增加，阴离子排列为PO43-＜SO42-＜CH3COO-＜Cl-＜Br-＜NO3-＜ClO4-＜I-＜SCN-。因此，影响相互作用强度的盐归纳为下列关系(NH4)2SO4＞Na2SO4＞NaCl＞NH4Cl＞NaBr＞NaSCN一般，使用盐浓度为约0.75-2M(NH4)2SO4或约1-4M NaCl。
虽然一般说来温度降低相互作用减弱，但温度对HIC分离的影响不简单。而通过增高温度自然增加的好处也对相反的作用不利，温度增加会影响蛋白的稳定性。
洗脱可逐步或以梯度形式以各种方式完成(a)通过改变盐浓度，(b)通过改变溶剂极性，(c)通过添加去垢剂。通过减少盐浓度，吸附的蛋白质以疏水性增加的顺序被洗脱。通过添加乙烯或丙烯二醇或(异)丙醇溶剂，可以对极性变化产生影响，因此减小疏水相互作用强度。去垢剂替换蛋白的作用主要用于膜蛋白的纯化。
虽然已经发现HIC层析可单独用于上面提到的从聚集物和错误折叠类分离IgG单体(MW150,000)，但HIC当与其它蛋白质纯化技术联用时特别有用。这就是说，最好用HIC纯化已用其它蛋白纯化步骤部分纯化的混合物。术语“部分纯化”的意思是蛋白制剂中感兴趣蛋白存在的重量百分率至少为5％，优选至少10％，最优选至少45％。术语“混合物”意思是目的单体IgG抗体分子与不限于下列的一种或几种不想要的污染物混合免疫球蛋白聚集物，错误折叠类，宿主细胞蛋白，来自前面采用的层析步骤中的残留物质如蛋白A。因此，HIC纯化免疫球蛋白可接着一种大体纯化方法使用，如亲合纯化的单克隆抗体。例如已经发现在使用HIC前将条件细胞培养基进行部分纯化是有用的。术语“条件细胞培养基”指支持细胞生长和/或细胞维持并含有分泌产物的细胞培养基。这种培养基样品在使用HIC步之前经过一种或多种蛋白纯化步骤。样品可第一步经过采用酵母菌蛋白A的亲合层析。例如，采用由蛋白A与可控多孔玻璃共价偶联组成的PROSEP-A(Bioprocessing Ltd.U.K.)其它有用的蛋白A制剂为Protein A SEPHAROSEFast Flow(Pharmacia)和TOYOPEARL 650M Protein A(Toso Hass)。第二步可采用离子交换层析。在这点上各种阴离子或阳离子取代基可连到基质上以形成层析的阴离子或阳离子支持物。阴离子交换取代基包括二乙氨乙基(DEAE)，季氨乙基(QAE)和季氨(Q)基团。阳离子交换取代基包括羧甲基(CM)，磺乙基(SE)，磺丙基(SP)，磷酸盐和硫酸盐。纤维素离子交换树脂如DE23，DE32，DE52，CM-23，CM-32和CM-52可从Whatman Ltd.Maidstone，Ken+，U.K.得到基于SEPHADEX及交联离子交换剂也是已知的。如DEAE-，QAE-，CM-，和SP-SEPHADEX，DEAE-，Q-，CM-和S-SEPHAROSE以及SEPHAROSEFast Flow均可从Pharmacia AB得到。而且，DEAE和CM衍生的乙二醇-异丁烯酸共聚物如TOYOPEARL DEAE-650S或M和TOYOPEARL CM-650S或M可从Toso Haas Co.，Philadelphia，Pa.得到。因为从离子交换支持物的洗脱常需加入盐以及前面提到的HIC在增加盐浓度时增强，所以特别优选在离子交换层析或其它盐介导的纯化步骤之后采用HIC步骤。可增加的其它纯化方法包括但不必限于进一步离子交换层析，分子排阻层析，病毒失活，浓缩及冷冻干燥。
只是为了解释，本发明用于几种IgG异型抗体的纯化。更具体而言，对治疗RSV感染有用的人化抗体，见Harris.et al.1992.Intl.PatentPublication Number WO92/04381，发表于1992年3月19日(此后“RSHZ-19”)以及与CD4抗原特异反应的嵌合抗体，见Newman etal.Intl.Patent Publication Number WO93/02108，发表于1993年2月4日(此后CH-CD4)。生产RSHZ-19和CH-CD4嵌合抗体的重组系统的构建详见上面的PCT申请，其内容作为背景在此引入作为参考并归纳如下。
含RSHZ-19编码序列的表达质粒与pSV2dhfr共转染入需dhfr的中国仓鼠卵巢细胞株(CHODUXBII)。转染在生长培养基中进行并用钙共沉淀/甘油休克步骤，见DNA Cloning，D.M.Glover ed(Chap.15，C.Gorman)。转染后，在选择步骤之前细胞于生长条件下(如上所述)在生长培养基中保持46小时。
选择和共扩增步骤基本上依R.J.Kaufman，et al.(Mol.Cell.Biol.51750-1759(1985))所述完成。转染后46小时，细胞转入选择培养基MEM ALPHA(041-02571)，1％谷氨酰胺母液，1％pen/strep(043-05070)母液和透析胎牛血清(220-6300AJ)(Gibco，Paisley，Scotland)。细胞在选择培养基保持8-10天，直至dhfr+克隆出现。当克隆长好时，细胞转入含氨甲蝶呤的选择培养基(A6770，Sigma.Chem.Co.，St.Louis，MO.)。氨甲蝶呤浓度开始0.02μM并逐渐增至5μM。在扩增步骤期间，从生长细胞取等份培养基检测人IgG的RSHZ-19产品。根据本发明，任何分泌抗体的重组细胞株可用于提供用来纯化的条件培养基，当然不需要特殊的细胞株。
能够产生RSHZ-19的转染CHO细胞株可通过各种细胞培养技术培养。对于应用本发明，特殊的培养方法不重要。
如前面提及的，具体的重组生产系统和具体的细胞培养方法在本发明范围之外。上面讨论的系统和方法是技术人员知道的许多选择的代表，在此引入仅为解释。纯化方法属于本发明的主题，只需常规的修改，即适用于各种重组抗体和抗体样蛋白，不管它们是如何产生或培养的。例如CD4的嵌合单克隆抗体也用本发明的方法纯化。
用本发明的方法得到的纯化抗体具有下列性质1)抗体蛋白重量百分比＞97％；2)4℃下对蛋白酶降解稳定至少3个月；3)低(＜0.1E.U./mg蛋白)内毒素；4)低(＜1pg/mg蛋白)DNA；5)非抗体蛋白重量＜5％；及6)病毒失活。下列实施例进一步解释本发明，但在此不按权利要求的限制方式提供。
实施例1介绍下面略述的方法被建立用于呼吸合胞体病毒(RSV)的单克隆抗体的分离和纯化。该抗体为在CHO细胞中表达的“人化”IgG，生长在搅拌釜生物反应器中。它在PCT WO92/04381中有较详细描述并在此称为RSHZ-19。该方法预计在从宿主细胞，细胞培养基或其它粗材料中除去污染物之后，制备＞95％纯度的RSHZ-19。该方法最优选的实施方案由三个纯化步骤(蛋白A亲合，阳离子交换和疏水相互作用层析)，两个病毒失活步骤和一个将产品交换入选择的终缓冲液的渗滤步骤组成(概括于图1)。所有步骤在室温进行(18-25℃)。所有缓冲液用WFI制备，使用前经0.2微米滤器或10,000MWCO膜过滤。缓冲液配方列于表1。表2、4、6和8分别显示实施例IA、IB、IC和ID的柱参数。表3、5、7和9分别提供实施例IA、IB、IC和ID的纯化概要。
程序的第一步骤(蛋白A在ProSep A上亲合层析)可快速循环以提供不同量的无细胞培养液(CCF)，并具有每升ProSep A大约15克RSHZ-19的能力。例如含400-50克IgG的500升CCF可加工5或6个循环。程序的下游步骤(阳离子交换层析(CEC)和疏水相互作用层析(HIC))平均每循环提供大约130-140克RSHZ-19。因而，含有400-500克RSHZ-19的500升培养基从ProSep A获得后要进行三个下面的循环。
疏水相互作用层析步骤(HIC)已被证明除去洗脱过程中从蛋白A柱滤掉的残留蛋白A(见实施例IA-D)。此外，如实施例IC和ID所示，IgG聚集物可用HIC除去。
方法描述适用于任何规模；列出的线性流速不依赖于柱直径，上样比例为每单位柱体积的质量表示。提供的实施例用以操作和回收1克、40克及125克规模(实施例IA-ID)。纯化过程描述从培养物中除去细胞为收集培养液，用装有0.65微米滤器或等同物的切向流微滤装置(Prostak)除去细胞。在滤液中回收产品。对小体积培养液，可采用离心。
通过蛋白A层析的亲合捕捉在预先用PBS平衡的ProSep A柱上，通过吸附层析从CCF回收IgG。培养基以流速最高达1000cm/hr上样到柱上，上样比例最高达每升柱体积15克IgG。上样后用至少3倍柱体积含有0.1M甘氨酸的PBS洗脱。用大约3倍柱体积的洗脱液，以低pH缓冲液洗脱下RSHZ-19。
蛋白A层析除去大部分细胞和培养物衍生杂质(特别是洗脱组分中的蛋白和DNA)，并浓缩洗脱液中的RSHZ-19以进行进一步处理。
在酸性pH下的病毒失活(可任选)收集蛋白A柱洗脱液，加入2.5M HCl调至pH3.5。溶液转入另一容器于pH3.5保持至少30分钟使病毒失活，再通过加入Tris缓冲液重调至pH5.5。得到的溶液通过预滤器(Millipore Polygard或等同物)和无菌0.2μM滤器(Millipore Millipak同等物)过滤，并于4℃保存在无菌容器中，或冷冻存放于-70℃。
pH3.5处理使病毒灭活，调至pH5.5的溶液用于阳离子交换层析(CEC)。如果需要的话pH3.5处理可省略。
阳离子交换层析pH灭活的蛋白A洗脱液进一步在CM SEPHAROSE FF(Pharmacia LKB)柱上通过CEC层析纯化。样品以150cm/hr流速上样到已平衡好的柱上，上样比例为每升CM SEPHAROSE≤20克蛋白。上样后柱子用3-5倍柱体积的平衡缓冲液冲洗。产品用3-5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱。
阳离子交换层析步骤除去蛋白和非蛋白杂质。
用胍灭活病毒阳离子交换洗脱液通过缓慢加入(边搅拌)1/2体积的胍贮存液，调至约2.0M盐酸胍。试剂加入速度调至约5-15分钟加完。该溶液转入另一容器保存30分钟使病毒失活。然后缓慢加入等体积的硫酸铵贮存液(边搅拌)，并立即进行疏水相互作用层析(HIC)步骤。试剂加入速度调至约5-15分钟加完。
采用酸灭活步骤时，胍处理提供了第二种病毒灭活步骤，并在加入硫酸铵后保持RSHZ-19可溶；加入硫酸铵以稀释胍并制备用于HIC的溶液。
疏水相互作用层析胍处理的溶液通过由TOYOPEARL Phenyl-650M装填的柱预先用平衡缓冲液平衡HIC柱进一步纯化。胍处理的溶液以150cm/hr流速上样到柱上，上样比例为每升Phenyl-650M≤20克蛋白。上样后柱子用3-5倍柱体积的平衡缓冲液冲洗。以100-150cm/hr加入线性梯度减少的硫酸铵，RSHZ-19作为一个主峰洗脱下来，然后是洗脱下来杂质。梯度的规模约20柱体积，开始为100％平衡缓冲液，最后为100％梯度缓冲液(1.3-0M硫酸铵)。收集吸收峰至吸光度降至最大峰吸收的20％，再停止产品组分的收集。梯度完毕后，柱子用大约3倍柱体积的脱荷载缓冲液冲洗。
HIC层析步骤去掉加入的蛋白和非蛋白杂质，最主要为残留的蛋白A，IgG聚集物和宿主DNA。
浓缩、渗滤和最终过滤HIC洗脱液用切向流超滤装置(如Millipore CUF)浓缩至约10mg/ml，该装置配有一个截留分子量为30,000的滤器，HIC洗脱液渗滤入一合适配方的缓冲液并通过无菌0.2微米滤器(Millipore Millipak或等同品)滤入无菌容器中。
进行中检测进程中间产品通过OD280或Bradford方法测总蛋白浓度，通过HPLC和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测RSHZ-19浓度。在TSK 3000 SWXL上用分子排阻HPLC确定聚集产品，用ELISA检验蛋白A残留。
合并标准从蛋白A捕获和阳离子交换步骤的洗脱组分根据层析谱的UV示踪合并，收集整个峰。从HIC步骤的洗脱液根据UV示踪合并，主峰合并到峰的尾侧UV读数为峰最高值的20％。HIC尾组分包含大部分蛋白A和聚集的IgG。
表1缓冲液配方缓冲液名称 组 成PBS 20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7PBS/甘氨酸 PBS+0.1M甘氨酸ProSep洗脱液25mM柠檬酸pH3.5CM SEPHAROSE平衡缓冲液 10mM柠檬酸pH5.5CM SEPHAROSE洗脱缓冲液 40mM柠檬酸100mM氯化钠，pH6胍贮存液6mM盐酸胍，50mM磷酸钠，pH72.6M硫酸铵贮存液2.6M硫酸铵，50mM磷酸钠，pH72.0M硫酸铵贮存液2.0M硫酸铵，50mM磷酸钠，pH7Phenyl-650平衡缓冲液1.3M硫酸铵，50mM磷酸钠，pH7Phenyl-650梯度缓冲液50mM磷酸钠，pH7Butyl-650平衡缓冲液 1.0M硫酸铵，50mM磷酸钠，pH7Butyl-650梯度缓冲液 50mM磷酸钠，pH7HIC脱荷载缓冲液 0.2M NaOH实施例IA 使用TOYOPEARL Phenyl-650以1克规模的RSHZ-19纯化5.0升(直径20cm，长16cm)ProSep A亲合柱用PBS(见表1)以5.2升/分钟平衡。每升含0.8克RSHZ-19单克隆抗体的100升条件培养基通过上述的微滤澄清，并以5.2升/分钟的流速上样。上样后，约15升PBS/甘氨酸以相同流速上到柱上。用15-20升ProSep A洗脱缓冲液洗脱IgG。未结合峰和洗脱峰部分分别收集并用HPLC方法测定IgG含量。洗脱液大约体积为15升，每毫升含约5毫克蛋白。
洗脱后，样品立即通过加入2.5M盐酸调至pH3.5，保持约30分钟，再用约350ml 1M Tris碱调至pH5.5。中和至pH5.5后，样品滤过-0.1μM Polygard CR滤器和一无菌0.2μM Millipak200，流入一无菌容器。滤液于4℃保存。滤液样品用HPLC方法分析IgG含量，并通过280nm吸收测总蛋白。样品是通过ELISA方法分析蛋白A含量。该pH3.5处理并过滤的ProSep A洗脱液在实施例IA、B和C用作CMSEPHAROSE上样物。
400毫升pH3.5处理并过滤的ProSep A洗脱液直接上样到220ml(4.4cm直径×15cm长)CM SEPHAROSE-FF柱上，流速为38ml/min，该柱已预先用CM平衡缓冲液平衡。上样后，柱子用大约700mlCM平衡缓冲液，以38ml/min冲洗。IgG通过用CM洗脱缓冲液，以38ml/min洗脱。大约通过一个床体积的洗脱缓冲液后IgG从柱上下来。收集整个峰作为CM SEPHAROSE洗脱液。CM非结合组分，洗脱物和脱荷载组分收集起来，并如前所述分析IgG含量、总蛋白含量和蛋白A含量。洗脱物大约体积为160ml，并含有12mg蛋白/ml。该CMSEPHAROSE洗脱液分为约80ml的两等份，用于实施例IA和IB的HIC上样。
向80ml CM SEPHAROSE洗脱液中加入(缓慢并不停搅拌)总体积为40ml的胍贮存液。这使胍浓度至2M以使病毒失活。边搅拌胍处理的溶液，边加入共120ml 2.6M硫酸铵贮存液。得到的溶液含1.0M胍和1.3M硫酸铵。硫酸铵处理的溶液上样至80ml TOYOPEARL Phenyl-650M柱(3.2cm直径×10cm长)，该柱预先用苯基平衡缓冲液平衡。整个过程中上样流速为20ml/min。上样后，柱子用约350ml苯基平衡缓冲液冲洗。用初始85％平衡/15％梯度缓冲液、终止0％平衡/100％梯度缓冲液，18-19柱体积的线性梯度洗脱IgG。这代表初始硫酸铵浓度约为1.1M，终止浓度为0M。梯度斜率约为每柱体积洗脱缓冲液4.7％增加，或每柱体积-0.061M硫酸铵。IgG始于约7个柱体积到约13个柱体积从柱上洗脱至梯度缓冲液中(硫酸铵浓度约0.7至0.3M)。收集洗脱的组分至峰尾侧的UV吸收减至峰高的20％，然后收集接到另一容器(尾部分)。在梯度最后，用约250ml HIC脱荷载缓冲液再生柱。未结合苯基的洗脱组分、洗脱物、尾和脱荷载部分分别收集，并如上所述分析IgG含量、总蛋白含量和蛋白A含量。洗脱物体积约为300ml，每毫升含约2.4ml蛋白。
表2概括了此实施例的柱参数。每一步的产品和蛋白回收数据见表3，连同蛋白A含量，以每毫克IgG中纳克蛋白(ng/mg)表示。如表3所示，经Phenyl-650M蛋白A减少约4倍，回收率约为94％。
表2用Phenyl-650M在1克规模的柱参数步骤柱体积柱子上样比例流速(升) 直径×长度(cm/hr)(mL/min)(cm)ProSep A5.0 20×16 16.0g IgG 1000 5200每升床体积CM SEPHAROSE FF 0.22 4.4×15 9.1g蛋白 150 38每升床体积Phenyl-650M 0.08 3.2×10 10.4g蛋白 150 20每升床体积表3用Phenyl-650M以1克规模，对于实施例IA的纯化步骤体积 总RSHZ总蛋白b步骤蛋白(升) -19a(克) 收率Ac(克) (％)(ng/mg)无细胞培养液 10080.3 n.d. - 0ProSep A15.8 73.8 80.4 92 20.2洗脱液CM SEPHAROSEd(0.4)d(1.87)d(2.04)d上样CM SEPHAROSE0.16 2.01 1.88 100 14.5洗脱液Phenyl-650Md(0.21)d(0.72)d(0.83)d上样Phenyl-650M 0.31 0.68 0.73 94 3.5洗脱液苯基尾 0.59 0.075 0.10 - 133)e累积回收(％)86a 通过HPLCb280nm处吸光度÷1.27mLmg-1cm-1c通过ELISAd如上面文中所述，从前面柱子的洗脱液只有一部分往下进行e蛋白A主要迁移在尾组分中实施例IB 用TOYOPEARL Butyl-650M以1克规模纯化RSHZ-19这种制备用与实施例IA所述相同的CM SEPHAROSE洗脱物，HIC步用TOYOPEARL Butyl-650M代替Phenyl-650M进行。CMSEPHAROSE洗脱物的制备在上面实施例IA中描述。向80ml CMSEPHAROSE洗脱物中加入共40ml胍贮存液(缓慢地不停搅拌)。使胍浓度为2M以利病毒失活。边搅拌胍处理溶液，边加入共120ml 2.0M硫酸铵贮存液。得到的溶液胍1.0M，硫酸铵1.0M。硫酸铵处理的溶液上样到-80ml TOYOPEARL Buryl-650M柱(3.2cm直径×10cm长)，该柱预先用丁基平衡缓冲液平衡。整个过程流速20mL/min。上样后，柱子用约350ml丁基平衡缓冲液冲洗。IgG用起始65％平衡/35％梯度缓冲液、终末20％平衡/80％梯度缓冲液的线性梯度，以12-13个柱体积洗脱。这代表起始约0.65M硫酸铵浓度和终末浓度约0.2M。梯度斜率为每柱体积洗脱液3.3％增长，或每柱体积硫酸铵-0.033M。IgG从柱上在大约2柱体积到9柱体积洗脱入梯度液(硫酸铵浓度大约0.58-0.35M)。收集洗脱液组分至峰尾侧的UV吸光度降至峰高的10％，用大约250ml丁基梯度缓冲液，并收集洗脱下的一个小峰。用大约250mlHIC脱荷载缓冲液再生柱。收集丁基非结合组分。洗脱物、尾和脱荷载部分，并如上所述分析IgG含量、总蛋白含量和蛋白A含量。洗脱物体积大约400ml，每毫升约含1.5毫克蛋白。
表4概括本实施例的柱参数。每步的产品和蛋白回收数据见表5，连同蛋白A含量，表示为每毫克IgG中纳克蛋白A(ng/mg)。虽然与实施例IA相比，IgG的回收较低(79％比94％)，但用Butyl-650M作为HIC步骤，蛋白A含量减少约20倍。
表4用Butyl-650M在1克规模的柱参数步骤 柱体积 柱子上样比例流速(升) 直径×长度 (cm/hr)(mL/min)(cm)CM SEPHAROSE FF 0.2244×15 每升床体积150389.1g蛋白Butyl-650M 0.083.2×10 每升床体积1502010.4g蛋白表5用Butyl-650M，1克规模对于实施例IB的纯化概要步骤 体积总RSHZ 总蛋白b每步蛋白(升)-19a(克) 收率Ac(克) (％)(ng/mg)无细胞培养液 100 80.3n.d. - 0ProSep A 15.873.880.4 9220.2洗脱液CM SEPHAROSEd(0.4)d(1.87)d(2.04)d上样CM SEPHAROSE 0.162.011.88 100 14.5洗脱液Butyl-650Md(0.21)d(0.76)d(0.86)d上样Butyl-650M0.410.600.62 790.7洗脱液丁基尾0.400.030.03 - 31.4)e.f丁基脱荷载0.530.100.10 - n.d.)g累积回收(％) 73质量平衡(上样的％) 95a通过HPLCb280nm处吸光度÷1.27mLmg-1cm-1c通过ELISAd如上所述，从前面柱子的总洗脱物只有一部分继续进行e蛋白A主要迁移在尾组分f尾包含上样量的3％g荷载包含上样蛋白的13％。实施例IC用TOYOPEARL Phenyl-650M在40克规模纯化RSHZ-19该制备用与实施例IA所述相同的ProSep A洗脱液，并且下游的步骤放大到适用大约40克蛋白，用TOYOPEARL Phenyl-650M作HIC介质。CM SEPHAROSE上样的制备如上述实施例IA。7.8升经pH3.5处理并过滤ProSep A的洗脱液直接上样到预先用CM平衡缓冲液以1.2L/min平衡的4.2升(25cm直径×8.5cm长)CM SEPHAROSE FF柱。上样后，柱子用约8升CM平衡缓冲液以1.2L/min冲洗。IgG用CM洗脱缓冲液以1.2L/min洗脱。经过约1床体积洗脱缓冲液，IgG从柱上洗脱下来。收集整个峰作为CM SEPHAROSE洗脱物。收集CM非结合级分和洗脱物，并如前所述分析IgG含量、总蛋白含量和蛋白A含量。洗脱物体积约5.7升，每毫升含约6.7毫克蛋白。
向5.6升CM SEPHAROSE洗脱物加入(缓慢地并不断搅拌)共2.8升胍贮存液(重量3.2千克)。在8.3升体积，胍浓度为2M使病毒失活，边搅拌胍处理溶液，边加入共8.3升(重量9.7kg)2.6M的硫酸铵贮存液。得到的溶液胍为1.0M、硫酸铵为1.3M，终体积为16.7升。硫酸铵处理的溶液上样到4.6升(18cm直径×18cm长)TOYOPEARL Phenyl-650M柱，该柱预先用苯基平衡缓冲液平衡。整个过程流速为0.5-0.6L/min。上样后，柱子用约14升苯基平衡缓冲液冲洗。采用起始100％平衡缓冲液、终止100％梯度缓冲液的线性梯度，以20个柱体积洗脱IgG。这代表起始和终止硫酸铵浓度为约1.3M和0M。梯度斜率为每柱体积洗脱缓冲液增加5％，或每柱体积-0.065M硫酸铵。IgG在约7个柱体积到12个柱体积从柱上洗脱到梯度液中(硫酸铵浓度约0.85M到0.5M)。收集洗脱级分至峰尾侧UV吸光度减为峰高的20％，然后收集接至另一容器(尾)。苯基非结合级分、洗脱物和尾及脱荷载级分分别收集，并如前所述分析IgG含量、总蛋白含量和蛋白A含量。洗脱物体积约15.4L，每ml含约2.2mg蛋白。
该苯基洗脱物用装以30,000MW CO Omega膜(FiltronCorp.)的切向流超滤装置(CUF，Millipore Corp.)浓缩至约16mg/ml，缓冲液通过对适当配方的缓冲液不断渗滤进行交换。
表6概括本实施例的柱参数。每一步的产品和蛋白回收数据见表7，连同蛋白A含量，表示为每mg IgG中ng蛋白A(ng/mg)，IgG聚集体含量表示为总IgG的％。如表7所见，蛋白A经Phenyl-650M减少约3倍，回收约90％。IgG聚集体从CM SEPHAROSE洗脱物中的0.5％减至制剂产品的0.06％。
表640克规模的柱参数步骤 柱体积 柱子 上样比例流速(升) 直径×长度 (cm/hr)(L/min)(cm)CM SEPHAROSE FF 4.225×8.5 每升床体积150 1.28.9g蛋白Phenyl-650M 4.618×18每升床体积140 0.610.4g蛋白表7实施例IC的纯化概要，40克规模步骤体积 总RSHZ 总蛋白b每步 蛋白IgG聚(升) -19a(克) 收率Ac集体(克) (％) (ng/mg) (％)无细胞培养液 100 80.3 n.d.- 0 n.d.ProSep A15.8 73.8 80.49220.2n.d.洗脱液CM SEPHAROSEd(7.84)d(36.0)d(37.3)d上样CM SEPHAROSE 5.71 36.5 37.3100 21.40.5％洗脱液Phenyl-650M15.4 32.8 33.6 908.0＜0.05洗脱液(产品)Phenyl尾 24.62.53.0 -78.05.1)e制剂产品2.0 32.8 32.01006.50.06累积回收(％) 83质量平衡(上样的％)97a通过HPLCb280nm处吸光度÷1.27mLmg-1cm-1c通过ELISAd总ProSep A洗脱物只有一部分向下进行e蛋白A和IgG聚集体主要在尾组分实施例ID用TOYOPEARL Phenyl-650M以125克规模纯化RSHZ-195.5升(直径20cm，长18cm)ProSep A亲合柱以4.8l/min用PBS平衡(见表1)。含有每升0.94克RSHZ-19单克隆抗体的450升条件培养基如上述用微滤澄清，分成4份90-95升和1份40升，以4.8l/min流速上柱(并贯穿始终)。柱的每个循环进行如下上样后，以相同流速用约17升PBS/甘氨酸洗柱。用15-20升ProSep A洗脱缓冲液洗脱IgG。收集非结合级分峰和洗脱峰并用HPLC分析IgG含量。每个循环的洗脱物体积约9升，每ml含约5-10mg蛋白。洗脱后立即将ProSep A洗脱物通过加入2.5M盐酸调至pH3.5，保持约30分钟，通过加入约250ml 1M Tris碱调到pH5.5。中和至pH5.5后，洗脱物合并到一起，顺次通过0.1μM Polygard CR滤器和无菌0.2μm Millipak200，进入无菌容器，每份5升。滤液存于4℃。滤液样品用HPLC方法分析IgG含量，通过280nm处吸光度分析总蛋白。样品还通过ELISA方法分析蛋白A含量，通过HPLC分析IgG聚集体。
下游的步骤放大以适合约120-140克蛋白，含有约130克蛋白的16.3升pH3.5处理并过滤的ProSep A洗脱液直接上样到14.4升(35cm直径×15cm长)CM SEPHAROSE FF柱，流速2.4L/min，该柱预先用CM平衡缓冲液平衡。上样后，柱子用约45升CM平衡缓冲液，以2.4L/min冲洗。IgG用CM洗脱缓冲液以2.4L/min洗脱。约经过1-2个床体积洗脱缓冲液，IgG开始从柱上洗脱下来。收集整个峰为CMSEPHAROSE洗脱物。收集CM非结合和洗脱物级分，并分析IgG含量、总蛋白含量和IgG聚集体。洗脱物体积约21升，含约120克蛋白。
向19.4升CM SEPHAROSE洗脱液中加入(缓慢并不断搅拌)共9.7升胍贮存液。在29.1升体积使胍浓度至2M以使病毒失活。边搅拌胍处理溶液，边加入共29.1升2.6M硫酸铵贮存液。得到的溶液中胍1.0M，硫酸铵1.3M，终体积为58.2升。将硫酸铵处理的溶液上样到预先用苯基平衡缓冲液平衡的12.4升(30cm直径×18cm长)TOYOPEARLPhenyl-650M柱。整个过程流速1.1-1.3L/min。上样后，柱子用约37升苯平衡缓冲液冲洗。用起始80％平衡缓冲液/20％梯度缓冲液和最终20％平衡缓冲液/80％梯度缓冲液的线性梯度，以12柱体积洗脱IgG。这代表起始硫酸铵约1.0M，最终约0.26M。梯度斜率为每柱体积梯度缓冲液增加约5％，或每柱体积-0.065M硫酸铵。从柱上下来的IgG基本在梯度中间，峰含约0.8M硫酸铵。收集洗脱部分至尾侧峰的UV吸光度降至峰高的20％，然后收集连到另一容器(尾)。收集苯基非结合、洗脱物和尾及脱荷载部分并分析IgG含量、总蛋白含量和IgG聚集体。洗脱物体积约29升，含约100克蛋白。
用装有30,000MW CO Omega膜(Filtron Corp.)的切向流超滤装置(CUF Millipore Corp.)将苯基洗脱液浓缩至约10mg/ml，缓冲液通过不断对合适配方缓冲液渗滤进行交换。产品分析IgG含量，总蛋白、蛋白A和IgG聚集体。
表8概括本实施例的柱参数。每步的产品和蛋白回收数据见表9，连同蛋白A含量，表示为每mg IgG(ng/mg)的ng蛋白A，以及IgG聚集体含量，表示为总IgG的％。如表9所示，蛋白A经过CMSEPHAROSE和Phenyl-650M减少约7倍，累积回收约70％。IgG聚集体从CM SEPHAROSE洗脱液中的0.4％减至制剂产品中的0.06％。
表8125克规模柱参数步骤 柱体积柱子 上样比例流速(升) 直径×长度(cm/hr)(L/min)(cm)ProSep A 5.020×18 每升床体积9154.814-16gRSHZ-19CM SEPHAROSE FF 14.435×15 每升床体积1502.48.4g蛋白Phenyl-650M 12.430×18 每升床体积1001.28.6g蛋白表9实施例ID的纯化概要125克规模步骤 体积 总RSHZ总蛋白b每步 蛋白IgG聚(升) -19a(克) 收率 Ac集体(克) (％) (ng/mg) (％)无细胞培养液 416 392 477c- 0 n.d.ProSep A 48.7 375 384 96 11.70.4洗脱液CM SEPHAROSEd(16.3)d(125)d(129)d-上样CM SEPHAROSE 20.6 116 117 93 n.d.0.4洗脱液Phenyl-650M 29.1 98.1 99.8 85 n.d.＜0.05洗脱液制剂产品 9.29 89.8 91.1 92 1.7 0.06累积回收(％)70a通过反相HPLCb280nm处吸光度÷1.27mLmg-1cm-1c通过Bradford方法d下面方法能力约为140克；总ProSep A洗脱物只有一部分向下进行表10纯度分析125克规模步骤 聚集体 纯度a活性b(％总IgG) (％总面积)(％)CCF 不合适 未作80cProSep洗脱物 0.498.5105CM洗脱物 0.498.4109苯基洗脱物 ＜0.05 98.399终产品 0.06 99.7115a通过缩小SDS-PAGE扫描密度计测定；IgG重链和轻链面积的总和b活性(通过牛RS病毒结合ELISA)与RSHZ-19浓度(A280测定)的计算比率
c通过牛RS病毒ELISA测得活性与HPLC测得RSHZ-19浓度计算的比率实施例II抗CD4单克隆抗体CH-CD14通过细胞培养技术制得，并用蛋白A和离子交换层析以与实施例I使用的相似方式进行部分纯化，只是用阴离子交换树脂。一只Amico柱(1cm直径，10cm长)装以8ml PhenylTOYOPEARL 650M树脂(lot#65 PHMOIH)。所有步骤流速保持在2ml/min。柱子用20ml平衡缓冲液(1M硫酸铵，50mM磷酸钠，pH7.0)平衡。5ml部分纯化的CH-CD4单克隆抗体(17mg/ml，通过280nm处吸光度的浓度)加2.5ml 6M盐酸胍，50mM磷酸钠，pH7.0，混合保持30分钟，然后加7.5ml 2M硫酸铵，50mM磷酸钠，pH7.0制得用于上柱的产品。上样的硫酸铵终浓度为1M，盐酸胍终浓度为1M，取样后终体积为12ml，产品的终浓度为5.6mg/ml。该材料以2ml/min上样到柱上，用10倍柱体积平衡缓冲液到50mM pH7.0磷酸铵的线性梯度洗脱。约4ml级分为从柱上洗脱下的产品。
结果见表11。所有产品最终以梯度洗脱。蛋白A也被洗脱并从梯度较后面的级分中富集。为了在终产品中减少蛋白A，有必要排除梯度最后的一些级分，因而减少了产品的产量。产品86％产率，蛋白A可能减少2倍；产品50％产量蛋白A可能减少3倍。
表11
a去除因子通过汇集从开始洗脱到目的级分的洗脱级分，并将最初上样的蛋白A除以汇集的洗脱级分中的蛋白A ng/mg计算得来。
例如，因子8.6通过级分1-3的蛋白A总和除以级分1-3的产品总和，得到4ng/mg算得。该数然后除以上样的35ng/mg，得8.6。实施例IIB如实施例IIA所述CH-CD4单克隆抗体被部分纯化，为在HIC柱上样作准备。使用实施例IIA所述相同的柱、流速、平衡和上样。在本实施例中，柱子上样并用平衡缓冲液冲洗后，再用18ml冲洗缓冲液(1M硫酸铵，50mM柠檬酸钠，pH3.5)冲洗。然后再用13.5ml平衡缓冲液(如实施例IIA所述)冲洗。柱子用梯度洗脱再如实施例IIA所述用水冲洗，柱洗脱液分成14ml级分，然后分析产品和蛋白A。结果见表12。在90％收率时蛋白A可减少6倍，78％产率可减少8倍。
表12
1同表11的脚注“a”比较实施例IIB和IIA的结果可见，当包括pH3.5冲洗时，80％产率下蛋白A减少6-8倍，而无pH3.5冲洗时CH-CD4的80％产率下只减少2倍。实施例IIC本实施例类似于实施例IIB完成，只是规模增加。平衡和冲洗缓冲液见实施例IIB。柱子直径5cm、高28cm，流速50ml/min。制备CH-CD4单克隆抗体并部分纯化，如实施例IIA所述。部分纯化产品(440ml)混合220ml 6M盐酸胍31分钟。然后加660ml 2M硫酸铵、50mM磷酸钠pH7.0。硫酸铵终浓度为1M，抗体终浓度为5.3mg/ml。取样后，上样体积为1290ml。
柱子用2倍柱体积平衡缓冲液平衡，然后上样。柱子用630ml平衡缓冲液、1000ml洗涤缓冲液、800ml平衡缓冲液冲洗，然后用5柱体积0.75M硫酸铵、50mM磷酸钠pH7.0到50mM磷酸钠pH7.0的梯度洗脱。洗脱过程中收集级分。
结果见表13。产率70％时，蛋白A减少100倍，抗体产率80％时蛋白A减少30倍。
表13
实施例IID部分纯化的CH-CD4单克隆抗体如实施例IIA所示制备。平衡和冲洗缓冲液见实施例IIB。4ml 6M盐酸胍、50mM磷酸铵pH7.0加入8ml 9.5mg/ml部分纯化的CH-CD4单克隆抗体溶液，并保温30分钟。然后缓慢加入12ml 2M硫酸铵、50mM磷酸钠pH7.0。柱直径0.5cm，高20cm(4ml)，所有步骤的流速为0.5ml/min。柱子用2倍柱体积的水和平衡缓冲液冲洗。然后22ml上样缓冲液过柱，接下来用2倍柱体积平衡缓冲液，冲洗缓冲液至柱子流出物pH为3.5。再用平衡缓冲液冲洗至流出液pH7.0。柱子用0.3M硫酸铵、50mM磷酸钠pH7.0洗脱。当UV示踪开始升高，收集12.6ml洗脱液并分析产品和蛋白A。产品产率为80％，蛋白A从28ng/mg降至6ng/mg，减少4.7倍。
权利要求
1.一种从包含相同物质的混合物中纯化单体IgG抗体的方法，包括将所述混合物与疏水相互作用层析支持物接触并从支持物上选择性地洗脱所述单体。
2.根据权利要求1的方法，其中IgG选自抗RSHZ-19和CH-CD4。
3.根据权利要求1的方法，其中HIC支持物选自烷基C2-C8琼脂糖、芳基琼脂糖、烷基硅胶、芳基-硅胶烷基有机聚合物树脂和芳基有机聚合物树脂。
4.根据权利要求3的方法，其中支持物选自丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖和丁基-、苯基和醚-有机聚合物树脂。
5.根据权利要求4的方法，其中支持物为苯基-有机聚合物树脂。
6.根据权利要求4的方法，其中支持物为丁基-有机聚合物树脂。
7.根据权利要求1的方法，其中抗体用低盐缓冲液选择性地洗脱。
8.根据权利要求7的方法，其中抗体用盐减至50mM磷酸盐，pH7.0的梯度选择性地洗脱。
9.一种从包含相同物质的条件细胞培养基中纯化IgG抗体的方法，包括顺次将培养基经(a)蛋白A亲合层析，(b)离子交换层析和(c)疏水相互作用层析处理。
10.根据权利要求9的方法，其中离子交换层析使用的支持物选自CM-23-、CM-32-、CM-52-纤维素；CM-和，SP-交联葡聚糖，CM-和S-琼脂糖；CM-有机聚合物树脂；DEAE-QAE-Q-交联葡聚糖；DEAE-、QAE-、Q-联琼脂糖；及DEAE有机聚合物树脂并使用一种缓冲的盐溶液。
11.根据权利要求10的方法，其中支持物为CM-agarose FastFlow，盐为NaCl。
12.根据权利要求10的方法，其中缓冲的盐溶液为含100mMNaCl的pH6.0的40mM柠檬酸盐。
13.根据权利要求9的方法，其中疏水相互作用层析采用的支持物选自烷基C2-C8-琼脂糖，芳基-琼脂糖，烷基-硅胶，芳基-硅胶，烷基-有机聚合物树脂和芳基-有机聚合物树脂。
14.根据权利要求13的方法，其中支持物选自丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖及丁基-、苯基-和醚-有机聚合物树脂。
15.根据权利要求14的方法，其中支持物为苯基-有机聚合物树脂或丁基-有机聚合物树脂。
16.根据权利要求9的方法，其中支持物为苯基-或丁基-有机聚合物树脂，并且抗体用低盐缓冲液选择性地洗脱。
17.根据权利要求16的方法，其中抗体用减少至50mM的磷酸钠缓冲液pH7.0的梯度选择性地洗脱。
18.根据权利要求9的方法，其中蛋白A层析采用蛋白A联到可控多孔玻璃的支持物，用低pH洗脱液洗脱。
19.根据权利要求18的方法，其中所述缓冲液为25mM柠檬酸盐，pH3.5。
20.一种从条件细胞培养基纯化抗体的方法，包括(a)将抗体吸附到蛋白A层析支持物上；(b)用至少一种缓冲液冲洗吸附的抗体；(c)洗脱来自步骤(b)的抗体；(d)将来自步骤(c)的抗体吸附到离子交换层析支持物上；(e)用至少一种缓冲液冲洗吸附的抗体；(f)选择性地洗脱来自步骤(e)的抗体；(g)将步骤(f)的洗脱液吸附到疏水相互作用层析支持物上；(h)用至少一种缓冲液冲洗吸附的抗体；(i)洗脱吸附的抗体；及(j)回收抗体。
21.根据权利要求20的方法，它包括一步或多步任选的灭活病毒步骤，如果病毒存在的话。
22.根据权利要求21的方法，其中病毒灭活步骤在步骤(f)后和步骤(g)前完成。
23.根据权利要求22的方法，其中所述病毒灭活步骤包括用盐酸胍处理洗脱液一段充足的时间，使病毒失活，再加入硫酸铵溶液。
24.根据权利要求23的方法，其中盐酸胍以2.0M存在，随后处理从步骤(f)得到的洗脱液时调至1.3M硫酸铵。
25.根据权利要求22的方法，其中一个附加的病毒灭活步骤在步骤c后和步骤d前完成。
26.根据权利要求25的方法，其中所说附加的病毒灭活步骤包含用酸处理步骤c的洗脱液。
27.根据权利要求26的方法，其中洗脱液的pH调至pH3.5，并在此pH保持一段充足的时间以灭活病毒，调节pH至5.5以终止处理。
28.根据权利要求20的方法，其中步骤(d)的离子交换支持物选自羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐(P)、二乙氨乙基(DEAE)、季氨乙基(QAE)和季氨(Q)，取代的纤维素树脂，交联葡聚糖、琼脂糖和有机聚合物树脂。
29.根据权利要求28的方法，其中阳离子支持物为CM-琼脂糖。
30.根据权利要求20的方法，其中疏水相互作用层析支持物选自烷基C2-C8-琼脂糖，芳基-琼脂糖，烷基-硅胶，芳基-硅胶，烷基-有机聚合物树脂和芳基-有机聚合物树脂。
31.根据权利要求30的方法，其中支持物选自丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖，以及苯基-、醚-和丁基-有机聚合物树脂。
32.根据权利要求31的方法，其中该支持物为苯基-或丁基-有机聚合物树脂。
33.根据权利要求20的方法，其中所述蛋白用超滤方法通过收集和浓缩从层析步骤(i)得到的含蛋白级分回收。
34.根据权利要求20的方法，其中步骤(a)中的层析支持物为蛋白A联到可控多孔玻璃上。
35.根据权利要求20的方法，其中步骤(h)的吸附抗体用两种缓冲液冲洗，第一种是平衡缓冲液、第二种是低pH冲洗缓冲液。
36.根据权利要求3 5的方法，其中第二种缓冲液的pH小于4.0。
37.根据权利要求36的方法，其中第二种缓冲液为1M硫酸铵、50mM柠檬酸钠，pH3.5。
38.一种从含有蛋白A和抗体的混合物中除去蛋白A的方法，包含将所述混合物与疏水相互作用层析支持物接触，并从支持物选择性地洗脱抗体。
39.根据权利要求38的方法，它包括在洗脱前用pH小于7.0的缓冲液冲洗支持物。
40.根据权利要求39的方法，其中冲洗缓冲液的pH小于4.0。
41.根据权利要求40的方法，其中缓冲液为1M硫酸铵，50mM柠檬酸钠，pH3.5。
全文摘要
本发明涉及应用疏水相互作用层析联用层析纯化抗体分子蛋白。该过程可顺序包括蛋白A亲合层析、离子交换层析和疏水相互作用层析的步骤。纯化的无免疫球蛋白聚集体，错误折叠种类，宿主细胞蛋白和蛋白A的单体IgG抗体可通过该过程回收。
文档编号C07K16/00GK1146730SQ95192680
公开日1997年4月2日 申请日期1995年2月21日 优先权日1994年2月22日
发明者P·J·谢德尔, J·C·艾利森, R·G·施科特, T·M·史密夫 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司