专利名称：新型蛋白激酶npk-110的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码一种新型神经元蛋白激酶(NPK)的DNA序列，这种酶能够在与微管结合的关键部位对tau蛋白和其它微管相关蛋白(MAPs)进行磷酸化。本发明还涉及丝氨酸或苏氨酸残基，和所述MAPs上包括被NPK磷酸化的所述残基的表位，涉及与所述蛋白激酶特异结合的抗体，包括所述蛋白激酶抑制剂的、特别适于治疗老年性痴呆和癌症的药用组合物，涉及诊断试剂盒和用于检测老年性痴呆和癌症的体外诊断方法。
微管相关蛋白(MAPs)能调节微管网络的广泛动力学和重排，微管网络被认为能启动轴突生长(见最近Hirokawa所做的综述，1994)。有几条线索表明，MAPs的磷酸化状态由蛋白激酶和磷酸酶以迄今未知的方式平衡，它在所述反应的调节中起着重要作用。Tau蛋白是哺乳动物脑中的一类MAPs(Cleveland等，1977)，在体内可在几个位点上被磷酸化(Butler & Shelanski 1986；Watanabe等，1993)，而且，在体外是很多种蛋白激酶的底物(见Lee的综述，1993；Goedert，1993；Mandelkow和Mandelkow，1993；Anderton，1993)。在老年性痴呆的神经元降解过程中，tau蛋白聚积成成对的螺旋丝(PHFs)，这种螺旋丝是这种典型神经原纤维损害的主要纤维成分(见Lee和Trojanowski的综述，1992)。从所述聚集体中分离的Tau表现出一些生化变化，其中最明显的变化是过磷酸化(Grundke-Iqbal等，1986；Brion等，1991；Ksiezak-Reding等，1992；Goedert等，1992)。所报道的大部分异常磷酸化位点是Ser/Thr-Pro序列(Lee等，1991；Biernat等，1992；Lichtenberg-Kraag等，1992；Gustke等，1992；Watanabe等，1993)，表明有一个针对脯氨酸的激酶调节异常(Drewes等，1992；Mandelkow等，1992；Hanger等，1992；Vulliet等，1992；Baumann等，1993；Paudel等，1993；Kobayashi等，1993)或相应的磷酸酶调节异常(Drewes等，1993；Gong等，1994)。已由几个实验室(Kondo等，1988；Lee等，1991；Mercken等，1992；Greenberg等，1992)制备出能区分“正常的”tau和过磷酸化的、“病理学的”形式的tau的磷酸化依赖型抗体。所有这类抗体都被证实是针对Ser/Thr-Pro类型表位的(Lee等，1991；Biernat等，1992；Lichtenberg-Kraag等，1992；Lang等，1992；Watanabe，1993)。
tau的微管结合片段(
图1)包括3或4个有31个残基的假重复，各自取决于同种型(Lee等，1989；Goedert等，1989；Himmler等，1989)。该片段可能是成对螺旋丝的构件(Kondo等，1988；Wis chik等，1988；Ksiezak-Reding和Yen，1991；Wille等，1992)。它不含有14-16个Ser/Thr-Pro基序中的任一个，这些基序集中在所述重复的侧翼区域。不过，它在第一个重复的序列KIGS中含有一个保守的丝氨酸残基(Ser262)，它被证实是脑组织提取物的主要磷酸化位点之一(Gustke等，1992)。还发现Alzheimer PHF-tau上的该位点被磷酸化，但在“正常”tau或胎tau上的该位点未被磷酸化(Hasegawa等，1992)。它是迄今所发现的在tau的重复域里的唯一病理性磷酸化位点。
最近，用一种定点诱变方法证实，在该位点所发生的tau磷酸化能显著降低其微管结合能力，而在Ser/Thr-Pro基序上的磷酸化仅有很小的作用(Biernat等，1993)。它引发了在具有在Ser262上磷酸化tau的能力的神经元组织中寻找蛋白激酶的努力。本发明要解决的技术问题是提供一种蛋白激酶，这种酶通过将人tau蛋白上关键的丝氨酸262残基磷酸化而导致老年性痴呆的发病，还要提供一种相应的核苷酸序列。
通过提出在权利要求书中所限定的实施方案使上述技术问题得以解决。
因此，本发明涉及一种DNA序列，它编码一种能够将tau、MAP4、MAP2和MAP2c中的KXGS型基序磷酸化的神经元蛋白激酶(NPK)或其功能片段，其特征在于(a)它能编码表6中MARK-1所示的氨基酸序列；
(b)它能编码表6中MARK-2所示的氨基酸序列；或(c)它能与(a)或(b)的DNA杂交。
“DNA序列”一词包括任何DNA序列，如基因组或cDNA，半合成DNA或合成DNA。
我们惊奇地发现，现有激酶中无一能够将tau重复域中的4个KXGS基序磷酸化到足于解释与所述磷酸化相关的生物学和病理学效应的程度。对于丝氨酸残基262来说尤为如此，该残基是老年性痴呆发病的指示物。因此，本发明提供了一种能编码一种具有上述特征的新型蛋白激酶的DNA序列，这种蛋白激酶负责对老年性痴呆发病关键的氨基酸残基进行磷酸化。在本申请中，所述蛋白激酶也被称作NPK、MARK-1或MARK-2。该申请中所涉及到的氨基酸残基的编号由htau40序列而来，htau40是最长的人tau同种型(441个残基，Goedert等，1989)。
在一个优选实施方案中，本发明还涉及一种DNA序列，其中，所述神经元蛋白激酶(NPK)的特征是(a)经SDS-PAGE测定其表观分子量为110kD；(b)它能将人tau蛋白的丝氨酸残基262、293、305、324和356磷酸化；和(c)它包括以下氨基酸序列KLDTFCGSPPYAAPELFQGKDRWMNVGHEEEELKPYAEP(K)SSRQNIPRCRNNI在本发明DNA序列的一种优选实施方案中，所述NPK还具有以下特征(d)它能被磷酸酶PP-2A去活；和(e)它能将与tau有关的微管相关蛋白(MAPs)MAP2、MAP2c和MAP4的下列丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化MAP2/MAP2cS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073(f)它能导致tau、MAP4、MAP2和MAP2c与微管分离。
本发明的另一项惊人发现是NPK是通过对微管相关蛋白而非tau蛋白的磷酸化而导致这些蛋白与微管的分离。这种分离反过来引起所述微管的脱稳定作用，微管的一种增强的动力学不稳定性，并对细胞增殖、细胞分化或细胞退化产生影响。因此，本发明的NPK具有通过对tau或其它MAPs的磷酸化在大脑中调节微管的动力学和重排的能力。上述发现对于本发明的激酶在癌症发生中的作用有着重要的暗示意义。
这是因为，癌症基本上被认为是不受控制的细胞增殖。因此，许多抗癌药物是通过毒杀微管来干扰细胞分裂和增殖。另一方面，“癌基因”通常是其细胞调节受到损害的激酶。与本发明NPK相当或同源的激酶的脱调节化，可能会对各种类型细胞的微管的稳定性产生重要影响。由于微管在细胞分裂中起着重要作用，所述NPK的脱调节化会导致不受控制的细胞分裂并将正常细胞转化成癌细胞。另外，所述NPK的去调节化能够产生有丝分裂后的最终分化细胞，如神经元(它不发生分裂)，刺激其分裂。这种“不正常的”刺激会导致所述神经元直接进入细胞程序死亡(并因此出现类老年性痴呆症状)，因为由于其分化状态，它们不能够分裂。
在本发明DNA序列的另一种实施方案中，所述NPK可通过以下步骤从脑组织中获得(a)对脑提取物进行匀浆，随后进行离心处理；(b)在磷酸纤维素上对在步骤(a)中所获得的上清液进行层析，其中，NPK活性级分由200～400mM NaCl洗脱；(c)用硫酸铵来沉淀在步骤(b)所获得的活性级分，并对沉淀进行透析；(d)在Q-Sepharose(Pharmacia)上对步骤(c)中获得的透析液进行阴离子交换层析，并洗脱NPK活性级分，其中，所述NPK活性级分以单峰形式由大约0.2M NaCl洗脱，随后对活性级分进行透析；(e)在Mono S HR 10/10(Pharmacia)上进行阳离子交换层析；
(f)在Mono Q HR 5/5上进行层析，其中，NPK活性级分由大约250mM NaCl洗脱；(g)在Superdex G-200上进行凝胶过滤层析，其中，NPK活性洗脱物的表观分子量为100kD；和(h)在ATP-纤维素上进行亲和层析，其中，被洗脱的NPK活性级分的表观分子量经SDS-PAGE测定为大约110kD；其中，NPK活性是这样测定的在存在放射性标记的ATP的条件下，温育一种包括人成熟tau的255～267氨基酸残基的肽，并测定掺入该肽中的放射性活性。
在例1中提供了如何分离在一个实施方案中表观分子量为110kD的本发明的NPK(NPK-110)的进一步细节。不过，本领域技术人员从上面的教导中将会知道如何补充所述细节。
本发明的NPK可来自任何脊椎动物脑。在一种优选实施方案中，NPK来自一种哺乳动物脑。
本发明还涉及一种互补于本发明DNA序列的RNA序列。
在一种特别优选的实施方案中，所述哺乳动物脑是人脑或猪脑。
本发明还涉及一种由所述DNA序列编码的多肽或其功能片段或衍生物。所述多肽、片段或衍生物可进行翻译后修饰或化学修饰。在本说明书中，术语NPK或MARK(1或2)也可以包括这些片段或衍生物，即使没有特别说明。
本发明还涉及由tau相关的微管相关蛋白(MAPs) MAP2、MAP2c和MAP4的NPK-110磷酸化的以下丝氨酸或苏氨酸残基MAP2/MAP2CS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073本发明还涉及包括所述磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基的表位。
本发明还涉及与本发明的NPK特异性结合的抗体。
所述抗体可以是一种血清衍生的抗体或一种单克隆抗体。针对一种需要的表位的单克隆抗体和多克隆抗体的生产方法在本领域中是众所周知的(例如，参见Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988)。另外，所述抗体可以是一种天然抗体，或一种由遗传工程技术产生的抗体，如用本领域熟知的技术生产的嵌合抗体。此外，这里所说的抗体一词还指一种抗体的一个片段，该片段保留了其结合特异表位的能力，所述片段如一个Fab、F(ab)2或Fv片段。
另外，本发明涉及一种能特异结合包括MAP2，MAP2C和MAP4的以下磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基的表位的抗体MAP2/MAP2CS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073同样，所述抗体可以是一种多克隆抗体或一种单克隆抗体，或其保留了其结合特异性的片段。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体是一种单克隆抗体或其片段或衍生物。
在本发明的另一种优选实施方案中，所述抗体是一种多克隆抗体或其片段或衍生物。
本发明还涉及一种药用组合物，该组合物含有本发明NPK的特殊抑制剂，该抑制剂选择性地与一种可以药用的载体和/或稀释剂组合。
“本发明NPK的特殊抑制剂”一词是指能专门抑制本发明蛋白激酶的酶促活性的物质。酶，如蛋白激酶的抑制剂及其作用模式在本领域广为人知。例如，这种抑制剂可以与所述酶的催化功能域结合，从而使它不能转化其底物。
可以给需要用药的患者服用所述药用组合物，服用途径及剂量可由熟悉情况的医师合理定酌。可以药用的载体和/或稀释剂在本领域中众所周知，并可以根据服用途径或患者的具体症状进行配制。
在一种优选实施方案中，本发明涉及一种用于治疗老年性痴呆的药用组合物。
同样，可以给需要用药的患者服用所述药用组合物，服用途径和剂量可以用主治医师合理定酌。
在另一种优选实施方案中，本发明的药用组合物被用于治疗癌症。
如上所述，本发明NPK的脱调节可导致各种类型的表达微管相关蛋白的细胞进入一个途径，该途径最终导致所述细胞的致瘤性转化。因此，药物有效量的NPK抑制剂将会抑制和/或逆转所述转化过程。所服用的抑制剂的量由负责相应病例的医师决定。
在本发明药用组合物的另一种优选实施方案中，所述抑制剂是本发明的抗体，一种能将本发明的NPK脱磷酸化的磷酸酶，最好是磷酸酶PP-2A，一种所述NPK的激活激酶的抑制剂，一种tau衍生的包括Ser262残基的肽或一种MAP2、2c或MAP4衍生的包括至少一个下列MAP2、MAP2C或MAP4的丝氨酸或苏氨酸残基的肽MAP2/MAP2CS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073本文所说的“tau衍生的包括Ser262残基的肽和一种MAP2、2c或MAP4衍生的包括至少一个下列MAP2、MAP2c或MAP4的丝氨酸或苏氨酸残基的肽MAP2/MAP2CS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073″是指这样一种肽其三维结构能重建tau蛋白或MAP2、2c或4蛋白包括丝氨酸残基262(tau)或涉及上述(MAP)MAP2、MAP2C和MAP4的其它残基的表位的天然构象。这种肽模拟本发明NPK的天然底物(即tau或tau相关MAPs)，但不表现出任何NPK相关的生物效应。所述肽的合成方法在本领域中众所周知，所合成的肽可以仅由所述表位组成，也可以包括其它侧翼氨基酸。
本发明还涉及一种诊断组合物，它包括(a)本发明的NPK；
(b)本发明的抗体或片段或衍生物；和/或(c)一种包括上述tau、MAP2、MAP2C或MAP4的可磷酸化的丝氨酸或苏氨酸的肽。
例如，所述诊断组合物可用于检测老年性痴呆或癌症或其发病。本发明的抗体可用于检测本发明NPK的异常，特别是高浓度或含量，即所述NPK的高度活性，这种异常是所述疾病的指征。随所述组合物一起输送的NPK可以用作一种内部控制剂。另一方面，上述肽可以用作检测本发明NPK异常活性的底物。同样，所述诊断组合物中所含NPK的活性也可用作一种内部控制剂。
能特异性地结合上述包含于MAP4、MAP2或MAP2C中的磷酸化丝氨酸残基的抗体或用于检测所述微管相关蛋白的异常磷酸化状态或模式，这种异常磷酸化是癌症的指征。
所述诊断组合物的其它用途如下。因此，在一种实施方案中，所述诊断组合物可以包括本发明的一种针对上述表位之一的抗体。例如，可以用一种能识别一个或几个所述表位的抗体处理获自表现出老年性痴呆或癌症相关症状的患者的样品，对这种样品进行检测。可以用针对本发明抗体的第二抗体对所述抗体-表位(半抗原)复合体进行显色，所述第二抗体用本领域已知方法进行标记(例如，参见Harlow和Lane，出处同上)。
在本发明的另一种实施方案中，所述诊断组合物可以由一种上述表位和本发明的一种抗体组成。用所述抗体处理一种样品，可以得出有关患者的病症的结论，如果所述抗体和所述样品的结合与所述抗体和作为对照样品的上述表位的结合有关的话。
在另一种实施方案中，所述诊断组合物可以包括一个上述表位、本发明的NPK和本发明的一种抗体。可以样品磷酸化与本发明表位磷酸化的比较监测激酶活性。根据量化的NPK活性，可以推测出所述样品中所含tau蛋白或MAP2、2c或4的磷酸化状态，并进而推测出疾病状态。例如，可以通过向相同的反应中加入一种底物类似物判断激酶活性，可以根据酶促转化对这种底物进行目测。这些底物类似物在本领域中有广泛应用。另外，也可以在用本发明的激酶处理之后检测样品中磷酸化tau蛋白或MAP2、2c或4的量，处理时采用本发明针对所述磷酸化表位的抗体，并用由所述诊断组合物所提供的抗体-表位复合体的量作为内部标准，或者，例如用本领域已知的放射性示踪方法测定由NPK掺入tau蛋白或MAP2、2c或4的磷酸量。
不过，应当记住，本领域熟悉诊断原理的技术人员可以很容易地以不同方式对上述化合物进行组合，或向该组合物中补充标记过的或未标记过的二级或三级抗体，或酶和底物。这种方案也包括在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于体外诊断和/或监测老年性痴呆的方法，该方法包括分析患者的脑脊髓液提取物或对神经组织进行活检(例如，嗅上皮)，并检测所述组织中本发明NPK的存在。
本发明还涉及一种用于体外诊断和/或监测老年性痴呆的方法，包括分析患者的脑脊髓液提取物或对神经组织进行活检，并检测所述组织中本发明NPK的非生理量，或所述NPK的非生理活性。
适于上述活检的神经组织的一个例子是嗅上皮。
例如，可以用本发明的诊断组合物，特别是针对所述NPK的抗体实施本发明的方法。因此，在本发明的一种优选实施方案中，本发明的NPK是用本发明的特异地结合该NPK的抗体检测。
另外，本发明涉及一种用于体外诊断癌症或癌症发作的方法，该方法包括分析合适的组织或体液，看在以下位置上是否存在与tau有关的微管相关蛋白(MAPs)MAP2、MAP2C和MAP4的磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基MAP2/MAP2CS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073或检测是否存在本发明NPK的非生理量或一种NPK特异性磷酸酶。应当理解，丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化状态必需是非生理性的。测定这种磷酸化状态的方法已详细披露于PCT/EP9202829中，该专利被收作参考。
例如，可以用一种专门识别所述磷酸化残基或包括所述残基的表位的抗体分析所述磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基。
可以用专门针对NPK的抗体测定样品中的NPK量，或者用一种合适的底物测定其活性，例如，所述底物可以是非磷酸化状态的包括上述丝氨酸或苏氨酸的一种肽，或非磷酸化状态的MAP2、MAP2C和MAP4中的任一种。测定蛋白的磷酸化状态的方法详细披露于PCT/EP9202829中。所述磷酸酶，如PP-2A、PPI或钙调磷酸酶的活性，可以通过提供本发明的底物、NPK进行测定，所述底物和NPK包含于本发明的诊断组合物中。
适用于本发明的体外方法的组织或体液是脑脊髓液、血液、活组织(如肝或皮肤)。
本发明的再一个目的是提供一种通过用本发明的NPK处理在体外将正常MAP2、MAP2C或MAP4转化成在以下位置上被磷酸化的蛋白的方法MAP2/MAP2CS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073所述磷酸化状态是癌症或癌症发作的指征。进行所述MAPs的磷酸化的条件，可以通过由本发明所提供的以下一般教导进行测定。磷酸化的MAPs可以由特异的抗体识别。上述体外方法的结果有助于进一步了解癌症的发生。
另外，可以试验能阻止正常MAP转化成在上述位置被磷酸化的MAP蛋白的抑制剂。所述“抑制剂”对于被磷酸化的表位来说可以是特异的，例如，阻遏所述表位，也可以针对本发明蛋白激酶-NPK上的各种结构域，只要其能够抑制或干扰其生物活性。另一种类型的抑制是发生在所述MAPs或NPK上的磷酸酶颉抗作用，或对所述NPK活化激酶的抑制作用。另外，由本发明方法所产生的MAP可用于在体外和体内进行结合微管结构的研究，从而阐释癌症发病的分子基础。
另外，本发明涉及将本发明MAP的磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基或包括所述残基的表位用于产生能指示癌症或癌症发作的特异抗体。
用于获得所述抗体的方法在本领域中广为人知；因此，可以用标准方法(例如，见Harlow和Lane，出处同上)产生多克隆或单克隆抗体。如果将寡肽或多肽用于产生抗体，最好将包括所述表位的肽连接到一种合适的载体分子上，这种分子能够诱发或增强对所述表位的免疫响应，如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白。连接半抗原(包括或等同于所述表位)和载体的方法也是众所周知的(Harlow和lane，出处同上)。可以理解，任何适用产生所需抗体的动物都可用于上述目的。
附图为图1是tau(同种型htau40，中枢神经组织中最大的一种，Goedert等，1989)、结构K18的条图，K18中带有所述4个重复和几个被获自脑的激酶活性磷酸化的位点(Gustke等，1992)。靠近N-末端的画影线的框为插入片段，这些插入片段可由于不同的剪切而缺失，标有1-4的框表示4个重复，其中重复2可以缺失。大部分磷酸化位点在位于所述重复之外的Ser-Pro或Thr-Pro基序中，但是，脑激酶活性也能够将所述重复内的两个位点磷酸化，这两个位点是Ser262和Ser356。
图2从猪脑中提取NPK110。(A)将组织提取物加至磷酸纤维素柱上，并用0.15～1M NaCl分级洗脱。画斜线的条表示洗脱材料的总蛋白浓度，开放的条表示以tau结构K18为底物测得的活性。(B)被0.35～0.5M NaCl洗脱的材料用硫酸铵进行沉淀处理，对沉淀物进行透析，并加注到一个Q-Sepharose柱上。实线符号表示蛋白浓度，虚线符号表示活性曲线。梯度组成表示在右侧轴上。(C)对获自Q-Sepharose的级分8-15进行透析，并加注到一个SP-Sepharose柱上。(D)对获自SP-Sepharose的级分12-16进行透析，并加注到一个Mono Q HR 5/5柱上。(E)将获自Mono Q的级分9-11加注到一个Superdex200凝胶过滤柱上。分子量标记的洗脱位置标在右侧轴上。
图3在ATP-Sepharose上进行亲和层析(SDS PAGE，泳道1-3)对NPK110作最后纯化，并进行凝胶内磷酸化鉴定(放射性自显影，泳道4-6)。将获自凝胶过滤柱的活性最大级分(泳道1)加注到一个ATP亲和柱上。激酶由5mM ATP特异性洗脱(泳道2，3)。银染凝胶显现一条表观分子量约为110kDal的模糊带，和另一条分子量为95kDal的清晰带。泳道4-6表示泳道1-3中样品的凝胶内磷酸化的放射自显影图。tau(5μM)作为一种底物聚合到凝胶基质中。在变性复原并与g-32P ATP一起温育后，清楚地显示，只有110kDal的带表现出针对tau的激酶活性。
图4NPK110对野生型tau和结构K18(微管结合域)的磷酸化。在37℃下，用5μU/ml NPK110和2mM g-32P-ATP磷酸化Htau40(10μM，泳道1，2)和K18(20μM，泳道3，4)2小时。在7-20％ SDS梯度凝胶上对等分样品进行电泳泳道1、2表示磷酸化前后的htau40，泳道3、4表示磷酸化前后的K18。在泳道2和4中发现在磷酸化后发生小的分子量变化。右侧表示同一凝胶的放射自显影；磷酸化htau40和K18如泳道2和4所示。
图5用NPK110磷酸化的野生型tau(htau40)和结构K18的胰蛋白酶磷酸肽谱。在37℃下用0.5μU NPK110对30μg tau进行2小时磷酸化。(A)全长4-重复tau(htau40)，(B)结构K18(MT结合片段，完整长度tau的残基244-372)，(C)更清楚的斑图左上方的斑点1含有Ser262，右上方的斑点2含有Ser356，斑点3(下1)含有Ser305，斑点4(总是为重叠的双联体)含有Ser324，斑点5含有Ser293(这种胰蛋白酶肽CGSK不能从HPLC柱中回收，可能因为其体积小，但所述斑点可以通过定点诱变进行鉴定)。(D)获自(A)和(B)中所示磷酸肽的相同计数量(10,000cpm)的混合物。(C)中所示的磷酸化位点的鉴定是通过对HPLC-纯化的并测序的肽(列于表1中)进行双向分析而进行的。为了进行清楚的鉴定，分别对10,000cpm的纯化肽进行单独分析，并与示于(A)中的磷酸肽的5000cpm等分试样组合在一起进行分析。
图6Ser262的磷酸化破坏tau与微管结合。(A)在下面的例2中所述的共沉降分析中测定tau与紫杉酚稳定的微管(30μM)的结合。预先用NPK110(终浓度为8.5μU/ml)在37℃下对完整长度的野生型tau(‘wt’，htau40)和Ala突变型(A262)的Ser262(10μM)进行磷酸化2小时。通过非线性回归获得曲线(Biernat等，1993)。野生型tau的结合会受到磷酸化的彻底破坏(实心圆)，而A262突变型仍能结合，不过亲和性较低(三角)。为进行比较，还示出了未磷酸化tau的结合(空心圆)。
(B)微管结合的tau在由NPK110进行的磷酸化期间分离。将htau40(10μM)与紫杉酚稳定的微管(30μM)一起温育。在t＝0时，以10μU/ml的终浓度加入NPK110，以1～20小时的时间间隔取出等分试样，并离心沉淀。通过SDS凝胶光密度测定法测定沉淀和上清液中的Tau(实心圆)。通过对凝胶片进行Ceren kov计数测掺入的磷酸(空心圆)，并示于右侧的轴上。证实在没有微管的情况下磷酸能更快地掺入tau中(方形)。
图7是微管的暗视野显微图象和Ser262的磷酸化对tau的效果。在存在2.5μM tau(同种型htau40)和10μU/ml NPK110的条件下，将微管(5μM微管蛋白)在海胆精子轴突上进行成核。A，20分钟无ATP，B，有ATP。在A中，微管连续生长，在B中，Ser262可被磷酸化，导致脱稳定化并缩短微管。线条长度＝10μm。
图8非磷酸化tau和NPK110磷酸化tau对轴突成核微管长度的影响，通过暗视野显微法测得。在每种条件下测500-600个微管加末端的长度，给长度对时间作图。微管蛋白的浓度为5μM；结果发现，在不加tau的情况下，在该浓度下观察不到微管。在所有情况下Tau都是2.5μM。在对照实验中，ATP被省略(‘-ATP’)。
(A)由NPK110预磷酸化的Tau不会促进微管生长(实心圆)，但预磷酸化点突变型A262能够(三角形，根据图6B中的时间分辨结合试验)。
(B)在有(实心圆)或无(空心圆)2mM Mg-ATP的条件下将微管蛋白和Tau在4℃下与10μU/ml NPK110(终浓度)混合。在t＝0时，将温度升高至37℃。在有野生型tau和无ATP的条件下连续生长微管(空心圆)；用突变型Ser262-Ala(三角形)获得相同的结果。然而，野生型tau加ATP可导致初步生长，但随后又萎缩(实心圆)。(C-E)B中相应曲线在5分钟和30分钟时的微管长度直方图。每个样品在5分钟后在20μm附近出现一个显著的峰(空心圆)。如果Mg-ATP缺乏(C)或Ser262突变成Ala(E)，其分布变宽，并在30分钟时变成较大长度。形成对比的是，tau磷酸化可在培养30分钟时间内成功地减少平均微管长度(D)。
图9野生型tau(htau40)和分别用(A)脑提取物、(B)NPK110、(C)PKC或(D)PKA对进行过磷酸化的结构K18的胰蛋白酶磷酸肽谱。斑点的编号与图5中类似(斑点1Ser262，斑点2Ser356，斑点3Ser305，斑点4Ser324，斑点5Ser293)。右侧图表示完整长度tau对每种激酶的相应的双向磷酸氨基酸分析。
图10表示不同磷酸化位点对tau-微管相互作用的影响的示意图。大部分Ser/Thr-Pro基序位于所述重复结构域的侧翼区，其对于tau的结合只有很少影响。重复的结构域含有几个可磷酸化的非Ser-Pro位点，特别是4个KXGS基序。其中，第一个KIGS基序中的Ser对于微管结合具有最大的影响。
图11由NPK-110磷酸化的重组MAP2C的磷酸肽谱。该肽含有以下磷酸化残基I＝Ser1707，II＝Ser1676，III＝Ser37和Ser1536，IV＝Ser1792，Ser1796和Ser1799(残基编号按照Albala等的方法，1993)。
图12由NPK-110磷酸化的MAP4融合蛋白的磷酸肽谱。该肽含有以下磷酸化残基I＝Thr829，II＝Ser941，III＝Ser928，IV＝Thr873，Thr874和Thr876，V＝Ser899和Ser903，VI＝Ser1073，VII＝Ser928(残基编号按照West等的方法，1991)。
图13非磷酸化和NPK-110-磷酸化MAP4、MAP2和MAP2C对轴突成核微管长度的影响，通过暗视野显微法测得。在每种情况下测500～600个微管加末端的长度；用平均长度对时间作图。微管蛋白浓度为5μM；MAPs为1μM。结果发现，不添加MAPs，在该浓度下观察不到微管。
(a)在有(实心圆)或没有(空心圆)2mM Mg-ATP的条件下，在4℃温度下将微管蛋白和MAP4与10μU/ml NPK-110(终浓度)混合。在t＝0时，将温度升高到37℃。在有MAP4和无APT的条件下微管连续生长(空心圆)。不过，MAP4加ATP会导致初步生长，但随后又萎缩(实心圆)，因为MAP4被磷酸化，从微管上脱离下来，而微管脱稳定化。
(b)与(a)中相同的实验，但使用MAP2，取得类似结果。
(c)与(a)中相同的实验，但使用MAP2C，取得了类似结果。
图14以MARK cDNA为探针的成人和人胎组织的Northern印迹。
左侧成人组织泳道1胰腺(Pa)泳道2肾(Ki)泳道3肌肉(Mu)泳道4肝(Li)泳道5肺(Lu)泳道6胎盘(Pl)泳道7脑(Br)泳道8心(H)右侧胎组织泳道9肾(Ki)泳道10肝(Li)泳道11肺(Lu)泳道12脑(Br)图15在受由p110MARK进行的磷酸化的影响下重组野生型MAP2C和MAP2C点突变体与紫杉酚稳定的微管(30μM微管蛋白二体)的结合。空心圆未磷酸化的野生型MAP2C。这种结合是紧密的(KD大约为0.25μM)，并以大约17μM的配体饱和，或以每2个微管蛋白二体约1个MAP2C分子的比例饱和。实心圆野生型MAP2C，预先用p110MARK(2.5毫单位/ml；1单位相当于在30℃下每分钟有1μmol的磷酸盐转移到MAP2C)磷酸化2小时。结果发现，基本上无结合。实心方形和空心方形MAP2CA319和MAP2CA350，预先用p110MARK(2.5毫单位/ml)磷酸化2小时。在所述突变型中，在第一个或第二个重复中的KXGS基序里的Ser319或Ser350经点突变成为丙氨酸。与微管的亲和性明显下降(KD≈7μM)，不过，其化学计量依然与野生型MAP2C相似。三角MAP2C A319/A350，预先用p110MARK(2.5毫单位/ml)磷酸化2小时。在该突变型中，Ser319和Ser350同时突变成丙氨酸。其结合类似于未磷酸化的蛋白，表明对磷酸化的敏感性已不再存在，因为所述两个KXGS基序不再能够磷酸化。
图16未磷酸化的和由p110MARK磷酸化的MAP4(A)、MAP2(B)、MAP2C(C)和MAP2C点突变(D)对自成核微管长度的影响，是通过暗视野显微法测定的。在每种情况下分析500～800个微管，并以平均长度对时间进行作图。在所有情况下微管蛋白的浓度均为10μM，MAP4和MAP2的浓度为1μM，MAP2c的浓度为2μM。在对照实验中，ATP被省略(‘-ATP’)。
A、B和C中的空心圆将MAPs与2.5mU/ml的p110MARK(终浓度)预培养30分钟，其中没有ATP。加10μM微管蛋白使微管成核，平均微管长度在30分钟内可增加高达大约20μM。形成对照的是，如果存在ATP，则不会发生自成核作用，这表明MAPs的磷酸化阻止了微管生成。通过添加轴突(10-100fM凝进接种的成核作用(A、B、C中的空心三角)仅能观察到长约2μm的短微管。
A、B和C中的实心圆在4℃下将微管蛋白和MAP与2.5mU/ml的p110MARK(终浓度)混合，并迅速将温度升至37℃(这样，起初MAPs是非磷酸化的)。在三种情况下微管生长都受到促进，但最终的平均微管长度仅为非磷酸化MAPs的大约一半(比较空心圆)。
DMAP2c的磷酸化位点点突变效果。所有蛋白都按上述方法磷酸化(预培养30分钟)。三角野生型MAP2c，实心圆MAP2cA319(第一个重复里的KXGS突变成KXGA)，方形MAP2cA350(第二个重复里的KXGS突变成KXGA)，实心方形MAP2cA319/A350(在两个重复里的KXGS突变成KXGA)。
实施例说明本发明。
关于实施例中所述的tau蛋白，仅使用在大肠肝菌(E.coli)中表达的人tau蛋白。按照M.Goedert所披露的方法(Goedert等，1989)制备cDNA克隆，并用pET表达载体的变体进行表达(Studier等，1990)。利用tau的热稳定性和Mono S FPLC纯化所述蛋白(Hagestedt等，1989)。结构K18来自4-重复tau同种型，并包括微管结合区，残基244～372(Biernat等，1993)。突变型‘A262’是以最长的人的同种型为基础。用常规技术将单个残基Ser262转变成丙氨酸。按照Mandelkow等(1985)的方法，从猪脑中制备磷酸纤维素纯化的微管蛋白(PC-微管蛋白)。蛋白激酶A催化亚单位(自牛心中提取，基于肯普肽的活性为27nU/μl，基于酪蛋白的活性为100pU/μl)购自Promega公司，蛋白激酶C(自大鼠脑中提取，基于组蛋白H1的活性为80pU/μl)得自Boehringer Mannheim。
例1蛋白激酶NPK110的纯化和鉴定。
所有操作均在4℃下进行。从当地的屠宰场获得新鲜猪脑(约1kg)，并在1升缓冲液A(50mM Tris，pH8.5，含有5mM EGTA，100mM NaF，1mM PMSF，1mM苄脒，1mM Na3VO4，1mM DTT，0.1％Brij-35)中匀浆。在冰上将匀浆液转移到实验室中，并在30,000g离心1小时。通过超速离心(50,000g，30分钟)澄清上清液，将pH调至6.8，并加注到装有150ml Whatman P11的、用缓冲液B(50mM MES pH6.8，2mMEGTA，50mM NaF、1mM PMSF、1mM苄脒、1mM Na3VO4、1mMDTT、0.1％ Brij-35)平衡的Büchner漏斗中，施加小的真空度。用500ml缓冲液B洗涤磷酸纤维素，并分别用含有0.15M-1M NaCl的150ml缓冲液B进行分级洗脱(图2A)。通过对tau结构(K18)进行磷酸化筛选活性级分，所述tau结构由4个微管结合重复组成，基本如上文所述(Drewes等，1992)。通过硫酸铵沉淀分离活性级分，在冰上将所获得的饱和度为30-50％的沉淀用缓冲液A透析过夜。通过超速离心澄清透析液(约50ml)，并用一个Superloop(Pharmacia)加注到一个阴离子交换柱(Q-Sepharose HR，Pharmacia，80×16mm)上。在用100ml缓冲液洗柱，并用0-0.5M NaCl的分级梯度进行洗脱(图2B，流速5ml/分钟，级分体积7ml)后，将活性级分(约40ml)对缓冲液B进行透析，并加注到一个阳离子交换柱(SP-Sepharose HR，Pharmacia，60×16mm)(图2C，流速4ml/分，级分体积7ml)。用0-0.5M NaCl洗脱后，收集活性级分(大约40ml)，在Sephadex G25柱(300×26mm)上换成缓冲液A，并加注到Mono Q HR 5/5柱(Pharmacia)上，用陡NaCl梯度洗脱(图2D，流速0.5m/分，级分体积1ml)。在一个Centricon30微量浓缩器(Amicon)上将活性级分(2-3ml)浓缩2倍，加注到凝胶过滤柱(Superdex200，Pharmacia，300×16mm)上，用缓冲液A(pH7.8，含150mM NaCl和10％甘油)平衡并洗脱。流速为0.2ml/分，级分体积为2ml。已用标记蛋白盒(Pharmacia)预先校准所述柱。收集活性级分，并在Sephadex G25柱(100×16mm)上将缓冲液换成缓冲液C(40mMβ-甘油磷酸盐，10mM MgCl2，2mM EGTA，1mM苄脒，0.2mM DTT，0.1％ Brij-35)。以0.1ml/分的速度将得自G25柱的蛋白收集液(10-15ml)加注到ATP-Sepharose柱(Upstate Biotechnology公司，Lake Placid，USA，15×5mm)上。用5ml缓冲液C洗柱，并用2ml含有5mM MgATP的缓冲液C洗脱。浓缩洗脱液，并在Mono Q PC 1.6/5柱(‘Smart’系统，Pharmacia)上除去ATP和缓冲物质，用25mM Tris-HCl，DH7.4洗脱，其含有250mM NaCl，1mM EGTA，0.2mM DTT，1mM苄脒和0.03％Brij-35。将活性级分与50％(v/v)甘油混合，并在-20℃下保存。在这种条件下，其活性能至少保持1个月。
通过以上6个层析步骤，获得了来自猪脑组织提取物的纯化约10,000倍的Ser262-磷酸化活性。如图2所示，磷酸纤维素(A)，在Q-和SP-Sepharose和Mono Q(B、C、D)上进行离子交换，凝胶过滤(E)，最后用固定化ATP进行亲和层析。在所述组织中该激酶的活性约为0.2mU/mg，亲和纯化的激酶的活性约为2U/mg(1单位为每分钟转移1μmol的磷酸盐)。通过凝胶过滤后该酶的分子量约为90～100kDal，但活性峰较宽，并表现出明显的拖尾(图2E)。在SDS凝胶上，表观分子量约为110kDal(图3)。酶可在凝胶中进行复性；如果将tau作为底物聚合到凝胶基质中，并与γ-32P-ATP一起培养该凝胶，在放射性自显影时，110kDal的带就变得突出(图3，泳道4-6)，而在银染凝胶上所观察到的污染物无可检测的活性。在用NPK-110进行磷酸化之后，在SDS PAGE上完整的tau和结构K18都表现出小但明显的迁移性变化(图4，泳道1-4)。磷酸盐的最终掺入量约为1.8～2.5mol/mole tau，在一定程度上取决于酶的浓度和活性；在大约2小时后能获得这种磷酸化水平。磷酸化反应按以下方式进行磷酸化反应在40mM Hepes，pH7.2中进行，含2mM TAP，5mMMgCl2，2mM EGTA；1mM DTT，0.1mM PMSF，0.03％ Brij-35。当筛选提取物或激酶制剂的粗制级分时，其中含有50mM NaF或1μM冈田酸(LC Services，Woburn，MA，USA)。加热至95℃中止反应。在SDS凝胶(Steiner等，1990)或在磷酸纤维素纸盘(Gibco)(Casnellie，1991)上分析磷酸化。按照Geahlen等的方法(1986)进行凝胶内磷酸化分析。
以下述方法检测NPK110对tau的专一性用胰蛋白酶消化磷酸化蛋白，随后进行双向薄层电泳和层析(图5)。通过比较由重组全长4重复tau的磷酸化形式(图5A)和4重复片段K18的磷酸化形式(图5B)可以看出，大部分磷酸化肽出自重复结构域。通过分析两种样品的混合物证实了这一点(图5D)。在另一种方法中，通过HPLC分辨胰蛋白酶消化物(未显示结果)。更具体地讲，是以以下方式实施上述方法的在磷酸化反应之后，通过在0.5M NaCl/10mM DTT中煮沸样品并离心而将激酶除去。Tau蛋白仍保留在上清液中，用15％TCA进行沉淀。通过过甲酸处理修饰半胱氨酸残基(Hirs，1967)。在有0.1mM CaCl2的条件下用胰蛋白酶(Promega，测序级)消化该蛋白质过夜，使用1∶10-1∶20(w/w)的二酶。按照Boyle等的方法(1991)，在薄层纤维素板(Macherey和Nagel，Duren，FRG)上进行双向磷酸肽作图。简言之，第一向电泳是在甲酸(88％)/乙酸/水(50/156/1794)中，在pH1.9下进行；第二向层析在n-丁醇/吡啶/乙酸/水(150/100/30/120)中进行。为了通过测序对磷酸化位点进行作图，用NPK110和32P-ATP(100Ci/mol)对重组人tau(200μg，克隆htau40)进行磷酸化2小时。通过一个简单的热处理终止磷酸化。将蛋白与6M尿素和2mM DTT一起培养，并通过乙烯吡啶(Tarr等，1983)或过甲酸处理封闭半胱氨酸。在对10mM碳酸氢铵进行透析后，将所述蛋白冻干并在有0.1mMCaCl2的条件下用胰蛋白酶(1∶20)进行消化。通过在μRPC C2/C18SC2.1/10柱(‘Smart’系统，Pharmacia)上进行两轮连续的HPLC进行肽的分离。用乙酸(5％v/v)酸化消化产物，并用在10mM乙酸铵中配制的乙腈梯度通过HPLC进行分离(流速0.1ml/分，0-25％在120分钟内，25-50％在20分钟内)。通过在214、254和280nm处测UV吸收检测肽，并通过在闪烁计数器(Hewlett-Packard Tri Carb1900CA)中测Cerendov辐射测定掺入的磷酸盐。用在TFA中配制的乙腈梯度对流通级分和来自该梯度的放射性峰进行进一步纯化(流速0.1ml/分，0％乙腈/0.075％ TFA～66％ 乙腈/0.05％TFA，在60分钟内)。用一台477A脉冲液相测序仪和一台120A联机PTH氨基酸分析仪(Applied Biosystems)对肽进行序列分析。通过气相测序(Meyer等，1991)以脱氢丙氨酸的二硫苏糖醇加成物的形式鉴定磷酸丝氨酸。
由此产生几种标记肽，通过直接磷酸肽测序和磷酸氨基酸分析对所述标记肽进行分析。磷酸氨基酸分析在6N HCl中对等分消化样品进行部分水解(110℃，60min)，并在pH1.9和pH3.5的条件下进行双向电泳(Boyle等，1991)。磷酸肽测序的结果归纳于表1中。
表1通过HPLC获得用NPK110磷酸化的来自htau40的胰蛋白酶解磷酸肽。序列是主放射活性峰的。列出了第二次纯化后的计数数、材料量、带有加星号的磷酸化残基(鉴定为S-乙基半胱氨酸)的序列、磷酸化位点(按照htau40编号)。结果发现，HPLC检测不到来自第二个重复的胰蛋白酶解磷酸肽CGSK(假设是因为其体积小和它的亲水性)，因此，必须通过磷酸肽作图和定点诱变进行鉴定。
大部分放射活性存在于含有磷酸化Ser262的肽中。还发现Ser356(在第4个重复的KIGS基序中)和Ser324(获自第三个重复的KCGS基序)具有放射性标记。对这些纯化的肽进行双向分析，导致了图5C中所示的斑点的鉴定。它清楚地表明，Ser262(斑点1)是tau上NPK110的主要靶位点，其次是Ser356(斑点2)。斑点3被鉴定为含有Ser305的肽，斑点4为Ser324(在第三个重复的KCGS基序中)，斑点5为Ser293(在第二个重复的KCGS基序中)。不能通过反向HPLC层析直接提取到相应的胰蛋白酶肽(291CGSK)，可能因为其较短和其亲水性。因此，通过定点诱变，用K18的点突变型发现，所有4个KXGS基序中的丝氨酸(Ser262、293、324、356)都转化为丙氨酸。用NPK110进行磷酸化后发现，只有斑点3(Ser305)可见，而斑点1、2、4和5消失，因而证实斑点5中有Ser293(结果未显示)。
例2Tau-微管结合及动力学不稳定性。
以前发现，Ser262的磷酸化会明显降低tau和微管之间的相互作用；即不仅是解离常数提高，而且化学计量也降低。在对tau进行NPK110磷酸化后获得了类似结果，从而证实了以上观察结果。事实上，图6A表明了结合的降低更为明显NPK110在易达到的浓度范围内能完全破坏微管结合。由于结合变得太弱，以致不再能够估计解离常数值和化学计量值。换言之，NPK110能有效导致tau与微管结合力的丧失。按如下方法进行结合研究对30μl样品进行超速离心(Beckman TL100)，通过测紫杉酚稳定的微管(30μM)和tau的共沉降进行结合研究。用SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析沉淀和上清液的等分试样。将光密度扫描的干燥凝胶用于对蛋白的定量分析(详情参见Gustke等，1992)。
为了证实上述结果，将一个点突变(Ser262转变为Ala)引入tau，以使该位点不能再被磷酸化。在这种情况下，与NPK110一起培养突变型，微管结合能力大部分保持不变，但亲和力和化学计量有一定程度的降低(约25％，图6A)。这证实了现有研究中的两点(i)Ser262的磷酸化是控制tau对微管亲和性的主要关键，(ii)由激酶磷酸化的其它位点对所述结合有小的，但可测到的影响(即主要是重复2，3和4的KXGS基序里相当的丝氨酸)。
随后的问题是微管是否能保护tau免受NPK110的磷酸化？如果真是这样的话，则tau一旦与微管结合将会保留其对微管的高度亲和。为了回答这一问题，首先用tau饱和紫杉酚稳定的微管，然后与NPK110一起培养。如图6B所示，随着磷酸化的进行，tau逐步从微管上解离下来。因此，微管能够阻碍激酶对tau的磷酸化，但不能阻止磷酸化的发生。
tau的一个重要作用是稳定微管并抑制其动力学不稳定性(Drechsel等，1992)。因此，如果tau丧失其结合微管的能力，就可以预见稳定的微管会变得活跃。通过对接种在鞭毛轴突上的单个微管进行暗视野显微成象可以证实上述结果(图7)。该实验是这样进行的基本上按公开的方法(Trinczek等，1993)对在轴突上成核的微管进行图象显微。简言之，将5μM PC-微管蛋白，2.5μM tau(未磷酸化或磷酸化)和少量海胆精子轴突(10-100fM)在50mM Na-Dipes，pH6.9中混合，其中含有3mM MgCl2、2mM EGTA、1mMGTP和1mM DTT。将1.0μl样品放在一块载玻片下，用18×18mm的盖玻片覆盖，密封，并在5秒钟内在温度受控的空气流中加热至37℃。由该空气流保持37℃的恒温。在温度改变后在时间为2.5、5、10、15、20、25和30分钟时记录轴突成核的微管。在每种条件和时间下分析一个样品的3-5个轴突和10-20个实验，并测500-600个微管加末端的长度。只考虑明确位于焦平面上的微管。溶液深度为3-4μm，而焦深为1-2μm。
在图8A的实验中，对微管蛋白的浓度进行选择(5μM)，这样，微管自身不会组装，但在添加(未磷酸化的)tau后会生长。由NPK110磷酸化的tau不会支持生长，但突变型Ser262-Ala会。换句话说，在Ser262上发生磷酸化的tau就象“无tau”一样，因为它不与微管相互作用，与此相反的是，突变型能够。更为突出的是，在所述激酶的影响下，微管从非活跃型向活跃型转化。在图8B的实验中，让微管在有tau的条件下长出轴突，而且记录到在20分钟时间里其平均长度增加到大约50μm。在一个平行实验中，将NPK110与ATP一起加入(或没有ATP，作为对照)。在对照实验中(无ATP)，微管能够连续生长，并表现出很小的动力学不稳定性(图8B，空心圆)。随着ATP的加入，其平均长度仅增加到20μm，然后再次下降，因为tau逐步磷酸化同时微管变得活跃(实心圆)。当采用突变型Ser262-Ala时，即使在有激酶和ATP的情况下微管也能正常生长(三角形)。这些结果总结在图8C-D的长度直方图中。在开始组装后的初期，微管短且长度相当均匀(在5分钟时空心圆的峰)，在无间断生长的后期，微管变长并出现一个宽的长度分布(图8C和8E中的实心圆)。不过，当用激酶对Ser262进行磷酸化时(即存在激酶、ATP、和有Ser262的野生型tau)，微管依然较短(图8D中的空心圆)。
例3能将tau的重复结构域磷酸化的其它激酶。
在体外，tau能被很多种激酶磷酸化，可用几个标准对这些激酶进行分类，根据功能、目标等。某些有希望用于诊断老年性痴呆的针对脯氨酸的激酶(因为由其所诱发的抗体反应)能将所述重复两侧的区域磷酸化，但对tau-微管结合的影响似乎很小。相反，可以预见能将所述重复区磷酸化的激酶对微管结合有影响，因为tau重复被认为与该功能有关，而且这是由迄今所披露的NPK110的结果所证实的。随之而来的问题是，该激酶与其它激酶是如何在所述重复结构域对tau进行磷酸化的。到目前为止已有一些有关于此的报道(表2)。
表2磷酸化位点和激酶影响tau重复片段及相邻片段的总结(仅列出了不针对脯氨酸的激酶和位点)。主要位点用X表示，次要位点用(x)表示。注意，这些结果是通过不同方法获得的(1)tau磷酸化，随后是蛋白酶解降解，肽的分离和磷酸肽测序(Steiner等，1990，Steiner，1993，Gustke等，1992；Scott等，1993)。(2)磷酸肽质谱分析结合测序(Hasegawa等，1992；Watanabe等，1993)。(3)合成肽的磷酸化(Correas等，1992)。(4)磷酸肽2D作图结合测序(本文报道)。由于这些数据来自重复结构域K18，其不含有关在所述重复之外的可能的磷酸化位点的信息。
激酶或参考活性 S214 S262 S293 S305 S324 S356 S377 S409 S416KIGS KCGS KCGS KIGSPKA Scott等，1993(x) (x) (x)XXPKA Steiner，1993X(x) (x) (x)XXPKA 本文报道ND (x) (x) (x) XX ND NDPKC Correas等.，1992 XPKC Steiner，1993X (x) (x) (x) XPKC 本文报道ND(x) (x) (x) NDCaMK Steiner等.，1990 X脑提取物，Gustke等.，1992X X脑提取物，本文报道 X XPK35/41 Biernat等，1993X (x) (x) XNPK110本文报道 X (x) (x) (x) X活体脑老年性痴呆Hasegawa等.，1992 X成体Watanabe等，1993 ---在重复片段中无位点---胎儿watanabe等.，1993 ---在重复片段中无位点---
例如，PKA主要磷酸化所述重复之外的Ser214、Ser409和Ser416，但次要位点包括重复内的Ser324和Ser356(Scott等，1993；Steiner，1993)。由于Ser262不是上述位点之一，因此，预计它不会对微管结合产生重要影响，这一结果符合我们的观察。PKC位点包括重复3里的KCGS基序(Correas等，1992；Steiner，1993)，在我们的研究中，它对微管的结合也没有重要影响。早先报导的(Biernat等，1993)部分纯化的激酶活性能够将所有4个KXGS基序磷酸化，最后，获自脑提取物的激酶活性能将Ser/Thr-Pro基序和Ser262及Ser356磷酸化(Gustke，1992)，由于Ser262而具有报导过的对微管结合的重大影响。本研究所采用的方法是，由磷酸化的tau产生蛋白酶解片段，然后通过HPLC分离，并通过测序鉴定。这样通常会产生许多肽，其回收通常不是线性的，因此，难于判断在不同位点上的相对磷酸化量。
由于上述不确定性，因此决定通过不同的方法重新研究磷酸化位点。不仅要通过HPLC和测序分析磷酸肽，而且要通过在薄层纤维素板上双向作图进行分析，它能较清楚地反映出其相对分布。用脑提取物、NPK110、PKC和PKA将全长4-重复tau和重复结构域(K18)磷酸化。这样能够对tau重复结构域里的磷酸化位点进行比较，并显示各种激酶在htau40上的磷酸化程度。结果示于图9中，其中，来自K18的磷酸肽按照图5进行标记。通过让各样品与由NPK110磷酸化的K18样品一起走电泳鉴定由其它酶所产生的磷酸肽斑点(资料未显示)。
图9A中所示的图形是通过用脑提取物对完整长度的tau和K18进行磷酸化而获得的。对完整长度的tau来说，仅有斑点1(Ser262)清晰可见，斑点2(Ser356)几乎不可见。这种现象在K18的磷酸化图形中更为突出。
当检测NPK110对K18的磷酸化时，产生了类似于脑提取物的肽图形(比较图9A和9B)；最明显的斑点是1和2，其含有Ser262和Ser356，而Ser305(斑点3)、Ser324(斑点4)和Ser293(斑点5)表示微量成分。这证实了NPK110是主要的Ser262激酶。形成对比的是，早期激酶活性的重新研究(Biernat等，1993)迄今已产生不一致的结果。尽管它磷酸化与NPK110情形中一样的丝氨酸，但其重量不同，而且脑提取物中的激酶活性至少要低10倍。这能解释上文所述的即使长时间温育tau与该激酶活性仅能部分抑制tau与微管结合的原因。
如图9C所示，PKC只能将K18里的Ser305(斑点3)、Ser324(斑点4)和Ser293(斑点5)磷酸化至显著程度。左侧最外面的不清晰的斑点(箭头所示)不是来自tau的磷酸肽，因为该斑点也出现在对照实验中，而在对照中未加入tau结构(未显示)。其余两个斑点无法确认；右上方的斑点(带星号)不反映Ser262(斑点1)或Ser356(斑点2)。通过将该图形与获自全长tau的图形进行比较发现，PKC的主要磷酸化位点位于重复结构域外面。在该图形中仅Ser305(斑点3)勉强可见(注意，右上方的斑点与来自K18的右上方的斑点(带星号)不一致，如由对照实验所证实的(未显示))。
当用纯化的PKA对完整长度的tau和结构K18进行磷酸化时(图9D)，主要发现Ser356(斑点2)、Ser305(斑点3)、Ser324(斑点4)和Ser293(斑点5)。Ser262(斑点1)仅为次要的磷酸化位点。全长tau的磷酸化(图9D，左侧)产生类似的斑点，加上位于tau重复区外面的其它位点。上述结果大致符合早期的资料(Scott等，1993；Steiner，1993)。上述位点中的某一些在早先报导(Biernat等，1993)的“35/41kDal”激酶活性中也出现过。在随后的实验中证实，41kD的成分是PKA的催化亚单位(采用获自H.Hilz的抗PKA抗体，Hamburg，未显示资料)；该结果能部分解释所述资料的重叠。PKC主要能将Ser305、Ser293和Ser324(后者与Correas等的报导一致)磷酸化，但不能将Ser262磷酸化(图9C)。
例4由激酶NPK110磷酸化的MAP2和MAP4位点。
MAP2和MAP4是两种微管相关蛋白，它们属于与tau相同的MAP-家族，因为它们与3或4个内部重复的片段具有高度的同源性，所述蛋白质通过该片段与微管结合(作为综述，参见Chapin & Bulinski，1992)。MAP2主要出现在脑中，大部分在神经元的体树枝状腔中。与tau类似，MAP2能够因不同的剪接而以不同方式表达(Kindler等，1990)第二个重复可以缺乏(此为“典型的”MAP2)；此外，残基152-1514片段(即1830个残基中的1363个残基)也可以缺失(产生一种有467个残基的蛋白；这种形式通常被称为MAP2c)。本文所述的磷酸化实验是用在大肠杆菌中表达的重组MAP2c进行的(表3)。
表3
注在磷酸化残基后面标有星号。
残基编号按Albala等所述的方法(1993)MAP4是一种普遍存在的MAP，它可能与有丝分裂有关，它也以几种剪接同种型形式存在(West等，1991)。用一个重组MAP4结构进行了磷酸化实验，它含有C-末端的496个残基(包括重复结构域)并在大肠杆菌中表达(表4)。
表4
注在磷酸化残基后加有星号按west等(1991)的方法对残基进行编号。
磷酸化方法与在例2中所述方法相同。用NPK110对MAP2和MAP4进行磷酸化，磷酸化时使用有放射活性的ATP，用胰蛋白酶消化磷酸化蛋白，并通过双向磷酸肽作图进行分析(图11为MAP2c，图12为MAP4结构)。然后用2个HPLC梯度柱进行纯化。对纯化的放射性肽进行测序(用于鉴定磷酸化残基)并通过双向磷酸肽作图进行鉴定。
磷酸化对与微管相互作用的影响NPK110对MAP2和MAP4的磷酸化作用的影响与tau是相同的，也就是说，与微管的亲和性下降几倍，而微管的动力学不稳定性变得更大。例如，这一点可以通过以下现象得到证实在存在相关的MAP、激酶NPK110和ATP(为磷酸化所需)的条件下，微管的平均长度下降。图13表示采用MAP4、MAP2和MAP2c时的例子。微管组装从0时间开始。空心圆表示在缺少ATP时(无磷酸化发生)平均长度的增加。实心圆表示，在有ATP的条件下(因此有磷酸化的MAPs)平均长度仅为对照的大约一半。
所述新型NPK-110的生物学作用可总结如下NPK-110是作用于tau、MAP2、MAP2c和MAP4的重复结构域的有效激酶。它能将tau里的所有4个KXGS基序磷酸化，第一个和第4个(Ser262和Ser356)是最明显的位点。就此而言，该激酶再现了获自脑提取物的激酶活性的早先的观察结果(Gustke等，1992，见图9)。该激酶最为明显的作用是，它能基本上消除tau与微管的结合(图6B)，从而导致tau从微管上释放下来，而且它能将稳定的微管转化为动力学上不稳定的微管，如从显微图象上所能看到的。通过点突变型Ser262-Ala证实，这些作用主要取决于Ser262的磷酸化。这些特征使得NPK110成为可用于控制微管在神经元中的组装状态的候选酶。这些作用也与“老年性痴呆的tau假说”一致，该假说认为，tau不能结合微管且不能使微管稳定会导致其分解并停止轴突运输。上述现象既可因为tau从微管上解离而发生，又可因为抑制新合成的tau与微管结合而发生，这两种情形均因磷酸化而起。根据以上方案，可以减缓NPK110作用或终止其潜在的激活级联系统的措施，将适于治疗老年性痴呆。
另外还发现，基序KXGS不仅保守于tau重复序列中，而且也保守于其它MAPs中，如神经元MAP2和普遍存在MAP4(作为综述，参见Chapin和Bulinski，1992)。因此，NPK-110可能有一个更普通的作用，即影响不同的MAPs和可能的其它蛋白。可以预计的一个作用是，NPK-110参与癌症的发生。
例5对本发明NPK的进一步鉴定cDNA克隆的说明用获自脑-p110MARK肽序列的简并寡核苷酸筛选一个大鼠脑cDNA文库，得到9个克隆，对这些克隆进行测序。这些克隆编码来自至少两个不同基因的至少两种不同的激酶，彼此之间的同源性为70％。该肽序列完全符合被称为MARK-1(相当于NPK-110)的较大克隆，其5′-引导末端丢失(编码蛋白的分子量约为90kDal)。较小的cDNA MARK-2编码一种81kDal的蛋白。在表5中列出了适于设计用于筛选所述cDNA文库的寡核苷酸的肽。被鉴定的克隆的氨基酸序列示于表6中。同源性对数据库进行同源性搜寻，获得两种相关但不相同的序列MMKEM(X70764)即编码一种功能不详的推定蛋白激酶的小鼠cDNA(Inglis等，1993)，表现出与MARK-1有73％的同源性，和与MARK2有96％的同源性。
HUMP78A(M80359)即一种未公开的人cDNA序列，表现出与MARK-1有73％的同源性，和与MARK-2有69％的同源性。所有激酶都表现出较低的(约25％)对获自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的KIN1和KIN2蛋白的同源性(Levin等，1987，1990)。组织分布通过Northern印迹(图14)判断，MARK-1和MARK-2的mRNA能普遍在胎儿组织和成体组织中表达。在肌肉、脑和胎儿(而不是成体)肾中的表达水平最高。活性由脑制得的p110/MARK的活性至少比在大肠杆菌中表达的MARK高100倍。该活性取决于MARK本身在Ser和/或Thr残基上的磷酸化，因为在用磷酸酶脱磷酸化之后，所有活性丧失。
p110/MARK的磷酸化在SDS凝胶上出现110kD的表观分子量，而由cDNA测序预测的分子量为90kD。这种表观分子量的变化常见于磷酸蛋白。目标p110MARK不仅能将tau蛋白磷酸化，而且能将相关的MAPs，如MAP2或MAP2c(神经元MAPs大部分限于体树枝状腔中)和MAP4(一种遍在MAP)磷酸化，表明了这种酶的普遍功能。在这些MAPs中的主要磷酸化位点是类似的，即位于重复结构域中的KXGS基序里的丝氨酸。磷酸化作用也相当，即MAPs的微管结合能力明显降低，因此丧失微管稳定性(作为实例见图15、16)。表5通过LysC降解从猪脑MARK制剂中得到的肽序列。级分序列1 2 3 4 5 6 7 8* 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 202133-12*D R W M N V G H E E E E L K P Y A E P EP41 I A N E L K47-16 A E N L L L D A D M N I K71-09*X S S R Q N I P R C R N N I I85 I L N H P N I V K87-24*L D T F C G S P P Y A A P E L F Q G K120 L F V L N P I K121 L F R E V R I X130-13 Y R I P F Y M S T D C E N
140-9F R Q I V S A V Q Y C H Q K140-20 R I E I M V T M G F L表6与获自大鼠(Rattus norvegicus)cDNA文库的MARK-1和MARK-2的cDNA序列相应的氨基酸序列。
MARK-1(较大，部分cDNA克隆)残基总数779。
MARK-2(较小，完整cDNA克隆)残基总数722。
表示两个对齐的残基的字母相同时用‘|’表示MARK-1 -TENHTSVDGYTETHIPP--------TKSSSRQNIPRCRNSITS -35| | | || | | ||| ||MARK-2 -MSS-ARTPLPTLNERDTEQPTLGHLDSKPSSKSNMLRGRNSATS -43MARK-1 -ATDEQPHIGNYRLQKTIGKGNFAKVKLARHVLTGREVAVKIIDKTQLNPT -85| ||||||||||| |||||||||||||||| ||| |||||||||||||MARK-2 -A-DEQPHIGNYRLLKTIGKGNFAKVKLARRILTGKEVAVKIIDKTQLNSS -92MARK-1 -SLQKLFREVRIMKILNHPNIVKLFEVIETEKTLYLVMEYASGGEVFDYLV -135||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||MARK-2 -SLQKLFREVRIMKVLNHPNIVKLFEVIETEKTLYLVMEYASGGEVFDYLV -142MARK-1 -AHGRMKEKEARAKFRQIVSAVQYCHQKCIVHRDLKAENLLLDADMNIKIA -185||||||||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||MARK-2 -AHGRMKEKEARAKFRQIVSAVQYCHHKFIVHRDLKAENLLLDADMNIKIA -192MARK-1 -DFGFSNEFTVGNKLDTFCGSPPYAAPELFQGKKYDGPEVDVWSLGVILYT -235||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||MARK-2 -DFGFSNEFTFGNKLDTFCGSPPYAAPELFQGKKYDGPEVDVWSLGVILYT -242MARK-1 -LVSGSLPFDGQNLKELRERSCLRGKYRVPFYMSTDCENLLKKLLVLNPIK -285||||||||||||||||||| |||||| |||||||||||||| | ||| |MARK-2 -LVSGSLPFDGQNLKELRERV-LRGKYRIPFYMSTDCENLLKKFLILNPSK -291MARK-1 -RGSLEQIMKDRWMNVGHEEEELKPYSEPELDLNDAKRIDIMVTMGFARDE -335|| ||||||||||||||| ||||| || | | | || || | |MARK-2 -RGTLEQIMKDRWMNVGHEDDELKPYVEPLPDYKDPRRTELMVSMGYTREE -341MARK-1 -INDALVSQKYDEVMATYILLGRKPPEFEGGESLSSGNLCQRSRPSSDLNN -385| | || | | |||||| ||| | | || ||| || |MARK-2 -IQDSLVGQRYNEVMATYLLLGYKSSELEG------DTITLKPRPSADLTN -385MARK-1 -STLQSPAHLKVQRTISANQKQRRFSDHAGPSIPPAVSYTKRPQANSVESE -435| || | |||| ||| |||| || | | || || | | | |MARK-2 -SSAPSPSH-KVQRSVSANPKQRRSSDQAVPAIPTSNSYSKKTQSNNAENK -434MARK-1 -QKEEWDKDTARRLGSTTVGSKSEVTASPLVGPDRKKSSAGPS-NNVYSGG -484||| || | |||| | |||||| | | |MARK-2 -RPEE---ETGRK-----ASSTAKVPASPLPGLDRKKTTPTPSTNSVLSTS -476MARK-1 -SMTRRNTYVCERSTDRYAALQNGRDSSLTEMSASSMSSTGSTVASAGPSA -534|| | | ||| ||MARK-2 -TNRSRNSPLLDRASLGQASIQNGKDST----------------------- -503MARK-1 -RPRHQKSMSTSGHPIKVTLPTIKDGSEAYRPGTAQRVPAASPSAHSISAS -584|||| |||||| || |MARK-2 ---------------------------------APQRVPVASPSAHNISSS -521MARK-1 -T--PDRTRFPRGSSSRSTFHGEQLRERR---SAAYSGPPASPSHDTAALA -629|||| |||| ||||||| ||| | |||||MARK-2 -SGAPDRTNFPRGVSSRSTFHAGQLRQVRDQQNLPFGVTPASPS----GHS -567MARK-1 -HARRGTSTGIISKITSKFVRRDPSEGEASGRTDTAR----GSSGEPKDKE -675||| | | || ||||||| | | | | || | | ||MARK-2 -QGRRGPSGSIFSKFTSKFVRRNLNEPESKDRVETLRPHVVGGGGTDKEKE -617MARK-1 -EGKEAKPR-LRFTWSMKTTSSMDPNDMVREIRKVLDANTCDYEQRERFLL -724| ||||| ||||||||||||| || | |||||||||| | | || |MARK-2 -EFREAKPRSLRFTWSMKTTSSMEPNEMMREIRKVLDANSCQSELHERYML -667MARK-1 -FCVHGDARQDSLVQWEMEVCKLPRLSLNGVRFKRISGTSIAFKNIASKIA -774|||| ||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||MARK-2 -LCVHGTPGHENFVQWEMEVCKLPRLSLNGVRFKRISGTSMAFKNIASKIA -717MARK-1 -NELKL -779|||||MARK-2 -NELKL -722参考文献Albala，J.S.Kalcheva，N.，Schafit-Zagardo，B.(1993).编码两种人微管相关蛋白-2(MAP-2)的转录物的鉴定。Gene136，377-378。
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权利要求
1.一种DNA序列，它编码一种能够将tau、MAP4，MAP2和MAP2c里的KXGS基序磷酸化的神经元蛋白激酶(NPK)或其功能性片段，其特征在于具有以下特点(a)它能编码表6中的MARK-1所示的氨基酸序列；(b)它能编码表6中的MARK-2所示的氨基酸序列；或(c)它能与(a)或(b)的DNA杂交。
2.如权利要求1的DNA序列，其中所述NPK的特征还在于具有如下特点(a)通过SDS-PAGE测得其表观分子量为110KD；(b)它能将人tau蛋白的丝氨酸残基262、293、305、324和356磷酸化；和(c)它包括以下氨基酸序列KLDTFCGSPPYAAPELFQGKDRWMNVGHEEEELKPYAEP(K)SSRQNIPRCRNNI
3.如权利要求1或2的DNA序列，其中，所述NPK的特征还在于具有如下特点(d)它能被磷酸酶PP-2A失活；和(e)它能将与tau有关的微管相关蛋白(MAPs)MAP2、MAP2c和MAP4的下列丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化MAP2/MAP2cS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073(f)它能导致tau、MAP4、MAP2和MAP2c与微管解离。
4.如权利要求1-3中任一项的DNA序列，其中所述NPK可通过以下步骤从脑组织中获得(a)对脑提取物进行匀浆，随后进行离心处理；(b)在磷酸纤维素上对在步骤(a)中所获得的上清液进行层析，其中，NPK活性级分由200～400mM NaCl洗脱；(c)用硫酸铵来沉淀在步骤(b)所获得的活性级分，并对沉淀进行透析；(d)在Q-Sepharose(Pharmacia)上对步骤(c)中获得的透析液进行阴离子交换层析，并洗脱NPK活性级分，其中，所述NPK活性级分以单峰形式由大约0.2M NaCl洗脱，随后对活性级分进行透析；(e)在Mono S HR10/10(Pharmacia)上进行阳离子交换层析；(f)在Mono Q HR5/5上进行层析，其中，NPK活性级分由大约250mM NaCl洗脱；(g)在Superdex G-200上进行凝胶过滤层析，其中，NPK活性洗脱物的表观分子量为100kD；和(h)在ATP-纤维素上进行亲和层析，其中，被洗脱的NPK活性级分的表观分子量经SDS-PAGE测定为大约110kD；其中，NPK活性是这样测定的在存在放射性标记的ATP的条件下，温育一种包括人成熟tau的255～267氨基酸残基的肽，并测定掺入该肽中的放射性活性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的DNA序列，其特征在于所述NPK是获自哺乳动物脑的NPK。
6.如权利要求5的DNA，其中所述哺乳动物脑是人或猪脑。
7.一种由权利要求1-6中任一项的DNA序列编码的多肽或其功能片段。
8.一种被权利要求7的多肽磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基，所述丝氨酸或苏氨酸残基位于与tau相关的微管相关蛋白(MAPs)MAP2、MAP2c和MAP4的下列氨基酸位置MAP2/MAP2cS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073
9.一种包括权利要求8的丝氨酸或苏氨酸残基的表位。
10.一种特异性结合权利要求7的多肽或其片段的抗体.
11.一种特异性结合权利要求9的表位的抗体。
12.如权利要求10或11的抗体，它是一种单克隆抗体或其衍生物或片段。
13.如权利要求10或11的抗体，它是一种多克隆抗体或其衍生物或片段。
14.一种药用组合物，它含有权利要求7的多肽或其片段的特异抑制剂，有选择地与一种可以药用的载体和/或稀释剂组合。
15.如权利要求14的药用组合物用于治疗老年性痴呆。
16.如权利要求14的药用组合物用于治疗癌症。
17.如权利要求11-13中任一项的药用组合物，其中所述抑制剂是权利要求10-13中任一项的抗体；一种能将权利要求7的多肽或其片段脱磷酸化的磷酸酶，最好是磷酸酶PP-2A；一种权利要求7的多肽的活化激酶的抑制剂；一种包括Ser262残基的由tau衍生的肽，或包括至少一个在权利要求8中提及的丝氨酸或苏氨酸残基的由MAP4或MAP2/MAP2c衍生的肽。
18.一种诊断组合物，包括(a)如权利要求7的多肽；(b)如权利要求10-13中任一项的抗体；和/或(c)一种包括权利要求2(e)的丝氨酸残基的肽。
19.一种用于体外诊断和/或监测老年性痴呆的方法，包括分析患者的脑脊髓液提取物或对神经组织(例如，嗅上皮)进行活检，并检测所述组织中权利要求7的多肽或其片段的存在。
20.一种用于体外诊断和/或监测老年性痴呆的方法，包括分析患者的脑脊髓液提取物或对神经组织进行活检，并检测所述组织中权利要求7的多肽或其片段的非生理量或活性的存在。
21.如权利要求19或20的方法，其中所述NPK是用权利要求10、12或13中任一项的抗体进行检测的。
22.一种用于体外诊断癌症或癌症发作的方法，包括分析合适的组织或体液，看其是否在如下位置上有与tau相关的微管相关蛋白(MAPs)MAP2、MAP2c和MAP4的磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基MAP2/MAP2cS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073或者检测其中权利要求7的多肽或其片段的非生理量或所述多肽或片段的特异磷酸酶的存在。
23.一种通过用权利要求7的多肽或片段处理的方式在体外将正常MAP2、MAP2c或MAP4转化成在以下位置上磷酸化的蛋白的方法MAP2/MAP2cS37、S1536、S1676、S1707、S1792、S1796、S1799MAP4T829、T873、T874、T876、S899、S903、S928、S941、S1073所述磷酸化状态是癌症或癌症发作的指征。
24.将权利要求8的MAP的磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基或者权利要求9的包括所述残基的表位用于产生能指示癌症或癌症发作的特异性抗体的用途。
25.一种互补于权利要求1-6中任一项的DNA序列的RNA序列。
全文摘要
本发明涉及一种编码一种神经元蛋白激酶(NPK)的DNA序列，这种酶能够在与微管结合的关键部位对tau蛋白和其它微管相关蛋白(MAPs)进行磷酸化。本发明还涉及丝氨酸或苏氨酸残基和所述MAPs上包括被NPK磷酸化的所述残基的表位，涉及与所述蛋白激酶特异地结合的抗体，包括所述蛋白激酶抑制剂的、特别是用于治疗老年性痴呆和癌症的药用组合物，涉及诊断试剂盒和用于检测老年性痴呆和癌症的体外诊断方法。
文档编号C07K1/14GK1168699SQ95196569
公开日1997年12月24日 申请日期1995年10月30日 优先权日1994年10月28日
发明者E·曼德尔考, E-M·曼德尔考, J·比尔纳特, G·德鲁斯 申请人:马普科技促进协会