专利名称：溶血栓新药-重组人尿激酶原的纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人尿激酶原(Prourokinase，简称pro-UK)的纯化工艺，属医疗保健技术。
通过基因重组技术构建的可生产人尿激酶原的基因工程细胞如大肠杆菌、哺乳动物、酵母、昆虫等细胞在大量培养生产尿激酶原过程中产品的纯化十分重要。已有的类似纯化技术有AvgerinosG.C.等(1990)用快流速磺酸型琼脂糖凝胶珠(S-Sepharose Fast Flow)阳离子交换色谱、对氨基苯甲脒亲和色谱、磺酸型阳离子交换快速蛋白质液相色谱(mono-S FPLC)、第二次对氨基苯甲脒亲和色谱四步法从CHO基因工程细胞培养物中纯化人尿激酶原，但是该四步方法在实际应用中每一步之间色谱柱的衔接操作比较烦琐，例如上mono-S柱之前收集液必须调整pH和离子强度，上对氨基苯甲脒亲和色谱柱之前收集液必须稀释并重新调整pH和离子强度等一些附加的操作步骤，延长了生产操作时间，而且纯化的尿激酶原总产率仅为40％。按此方法进行放大工业化生产，势必受到某些限制。
本发明提供的一种对CHO基因工程细胞(CL-11G细胞株)培养液中重组人尿激酶原的四步纯化工艺，包含第一步羧甲基径向阳离子交换色谱法(CM-径向阳离子交换色谱法)；第二步微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附色谱法；第三步S-200型葡聚糖聚丙烯酰氨高效凝胶(Sephacryl S-200HR)色谱法；第四步对氨基苯甲脒亲和色谱法。其技术要点是CM-径向阳离子交换色谱法及其与其它三种色谱法的组合配套，形成一套完整的四步纯化工艺，能适应人尿激酶原工业化大规模生产纯化，操作技术简易，上下各个色谱柱之间的衔接无需任何附加操作，总产率高于50％。其目的在于克服已有技术放大生产受限制的障碍，迄至目前为止，尚未见到与本发明相同或相似的以CM-径向阳离子交换色谱法为基础和其它方法组合配套后提高生产率的有关文献报道。
以下的技术实施例子可以实现本发明的目的第一步是CM-径向离子交换法，其顺序包括(1)先将CHO基因工程细胞培养液通过3000Xg，4℃离心30分钟，除去细胞碎片；(2)然后取其上清液用6mol/L HCl调至pH5.7；(3)用蠕动泵输入预先用0.15mol/L磷酸缓冲液，pH5.7平衡过的CM-径向阳离子色谱柱，此色谱柱是用聚乙烯与纤维素共聚膜共价结合羧甲基绕在多孔轴管上，并固定于有机玻璃色谱柱管内，其柱床体积为250ml时，其流速为12～15ml/分钟，若柱床体积为700ml时，其色谱柱的流速为25～30ml/分钟；(4)用波长280nm的紫外检测仪监测蛋白吸收峰；(5)然后用平衡缓冲液洗涤至吸收值低于0.005单位以下；(6)再改用0.025mol/L醋酸缓冲液，pH调至6.8(含0.75mol/L硫酸铵，0.005％Tween-80)洗脱目标蛋白，收集蛋白吸收峰流出液。
第二步微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附色谱法(1)将第一步的蛋白收集液不经任何处理，直接上微孔高硅玻璃珠色谱柱；(2)用0.5mol/LTris-HCl，pH9.5的缓冲液洗去杂蛋白；(3)用0.02mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液，含0.1mol/LNaCl，洗至吸收值低于0.005单位以下；(4)改用分别含1mol/L和2mol/L硫酸铵的0.5mol/LTris-HCl，pH9.25的缓冲液进行线性梯度洗脱吸附在玻璃珠上的目标蛋白；(5)收集蛋白吸收峰流出液。
第三步S-200型葡聚糖聚丙烯酰氨沃特斯650型高效凝胶色谱法(W650 Sephacryl S-200HR)(1)用0.092mol/L醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl，pH5.3平衡凝胶柱；(2)然后上第2步收集的吸附蛋白峰流出液；(3)继续用平衡缓冲液淋洗色谱柱；(4)收集第2蛋白峰组份。
第四步对氨基苯甲脒亲和色谱法用0.092mol/L醋酸缓冲液，0.2mol/L NaCl，pH5.3平衡对氨基苯甲脒-Sepharose6B柱；(2)然后上第3步收集的蛋白收集液；(3)继续用平衡缓冲液洗柱；(4)收集穿过蛋白峰流出液；(5)用超滤法浓缩产品，进行冷冻干燥；(6)用纤维蛋白溶解圈法测定以上各收集液中尿激酶原的活性；(7)用改良的Lowry法测定其蛋白含量；(8)用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析产品纯度；(9)然后计算尿激酶原的分子量。
本发明在实际应用中所产生的积极效果1.本发明的尿激酶原四步纯化法操作简便易行，每个操作步骤之间的衔接简单方便。每一步得到的收集液可直接上下一个色谱柱，不需要每一次都调整pH和离子强度，大大缩短了操作时间；2.本发明的第1步采用径向离子交换色谱柱流速快，上样量大。例如柱床体积为250ml的CM-径向离子交换柱，一次可以处理3,000～3,500ml培养上清，流速可达12～15ml/分钟；若柱床体积为700ml的CM-径向离子交换柱则可以处理8,000～10,000ml培养上清，流速可达25-30ml/分钟；3.本发明的第一步可将尿激酶原的比活性提高57.4倍，能除去杂蛋白98％以上，体积浓缩6倍以上，回收率达79％；4.本发明所用的CM-径向柱具有把离子交换与膜分离技术结合起来的优点(即把羧甲基共价结合在聚乙烯纤维素共聚膜上绕在多孔轴管上)，使样品通过膜并结合在羧甲基上，再生柱子时反向冲洗可将离心过程未能除尽的细胞碎片去掉，以保证色谱柱可重复使用，可降低生产成本。
5.本发明的第2步采用微孔高硅玻璃珠吸附色谱法，对目标蛋白吸附量大，3000ml细胞培养液经第1步纯化得到的250～260ml收集液，用5～6克微孔玻璃珠即可全部吸附，平均每克微孔高硅玻璃珠可以结合40～50mg蛋白；6.微孔玻璃珠对目标蛋白吸附相当牢固。当吸附产品后用高pH和高离子强度(0.5mol/LTris-HCl缓冲液洗涤杂蛋白时，目标产品也损失很小，所以回收率可高达88-114％；7.微孔高硅玻璃珠对蛋白液的浓缩作用较强，能将产品浓缩10～20倍；
权利要求
1.一种溶血栓新药—重组人尿激酶原的四步纯化工艺，由羧甲基径向离子交换色谱(CM-RIEC)、微孔玻璃珠吸附色谱(MPG)、葡聚糖聚丙稀酰氨高效凝胶色谱(Sephacryl S-200HR)和对氨基本甲脒亲和色谱(PABZ)四步组成，其特征在于CM-径向离子交换色谱法与其它三个方法的组合配套，
2.如权利要求书1所述一种溶血栓新药—重组人尿激酶原的四步纯化工艺，其特征在于(1).CM-径向离子交换色谱介质是由聚乙烯与纤维素共聚膜共价结合羧甲基组成，(2).将共价结合羧甲基的共聚膜绕在多孔轴管上并固定于有机玻璃色谱柱管内，
3.如权利要求书1所述一种溶血栓新药—重组人尿激酶原的四步纯化工艺，其特征在于CM-径向离子交换色谱柱的柱床体积为250ml时其样品流速为12-15ml/分钟，柱床体积为700ml时，其流速为25-30ml/分钟，
4.如权利要求书1所述一种溶血栓新药—重组人尿激酶原的四步纯化工艺，其特征在于第二步的微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附色谱柱所使用的是(1).含高硅微孔玻璃珠(PG-D-IIC型)，(2).微孔高硅玻璃珠的粒径为74～125μ(120～200目)，
5.如权利要求书1所述一种溶血栓新药—重组人尿激酶原的四步纯化工艺，前两步的特征在于CM-径向离子交换柱的上样量与微孔高硅玻璃珠吸附色谱柱的上样量之比为50∶1。
全文摘要
一种重组人尿激酶原的四步纯化工艺，是以CM-径向离子交换色谱法为基础，结合其它三种色谱法组成，该纯化工艺操作简易，纯化效率较高。纯化后尿激酶原比活性要提高280多倍，能除去杂蛋白98％以上，总回收率达到50％以上。
文档编号C07K1/00GK1164536SQ96104829
公开日1997年11月12日 申请日期1996年5月3日 优先权日1996年5月3日
发明者张正光, 叶建新, 郭志霞, 高丽华, 于芳 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所