GnRH－白细胞毒素嵌合体的制作方法

专利名称：：GnRH－白细胞毒素嵌合体的制作方法总的来说本发明涉及免疫学载体系统。具体地说，本发明涉及白细胞毒素-GnRH嵌合体，它包括一个以上拷贝的GnRH多肽。与单个GnRH多肽相比它显示出具有较强的免疫原性。在脊椎动物中，两种促性腺激素，黄体化激素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成与释放是由称为促性腺激素释放激素(GnRH)(过去命名为LHRH)的多肽调节的。因而，控制动物群体繁殖的一条途径是例如通过抗GnRH免疫法减少GnRH水平，导致LH和FSH水平的减低和伴随着发情周期和精子生成的破坏。参见例如.，Adamsetal.，J.Anim.Sci.(1990)682793-2802。具体地说，对GnRH分子的早期研究已经表明重复注射合成的GnRH肽可能增高抗血清(Arimuraetal.，内分泌学(1973)93(5)1092-1103)。另外，在许多种类中通过将GnRH与适当载体的化学结合并将存在于适当佐剂中的该结合物给药，已产生了GnRH抗体(Carellietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1982)795392-5395)。将包含GnRH或GnRH类似物的重组融合蛋白质用于肽疫苗以对各种驯化动物和农场动物免疫阉割或抑制其生殖功能的方法已有报道(Meloenetal.，疫苗(1994)12(8)741-746；Hoskinsonetal.，Aust.J.Biotechnol.(1990)4166-170；和1992年11月12日公开的国际公开号WO92/19746；1991年3月7日公开的WO91/02799；1990年10月4日公开的WO90/11298；1986年12月18日公开的WO86/07383)。然而，由于GnRH肽的极低的免疫原性和由于化学结合过程难于控制，提供适当的免疫绝育产物的努力已经失败，而得到了基本上不均一的很小确定性的GnRH结合物。另外，基于GnRH的肽疫苗甚至在对动物个体重复接种后获得均一效果的成功率也很低。在这点上，由于GnRH是小的“自身”的分子，通常不能由破试动物的免疫系统识别，便得其免疫原性较小而不能诱导明显的抗内源GnRH的免疫应答，现有的GnRH构建体无法成为成功的免疫绝育疫苗产物。通常认为病毒抗原，小蛋白质或内源物质的免疫原性可以通过制备包含多重拷贝的选定抗原决定基的这些分子的免疫原形式来增强。在这点上，已经证明I型单纯疱疹病毒糖蛋白D的肽9-21的2或4个重复(Ploegetal.，J.免疫方法杂志(1989)124211-217)，Plasmodiumfalciparum的抗原环孢子小体四肽NPNA的2-6个重复(Lowelletal.，科学(1988)240800-802)，口碲疫病毒的VP1的主要免疫原位点的2或4个拷贝(Broekhuijsenetal.，J.gen.Virol.(1987)683137-3143)和类GnRH多肽的串联重复基础上的构建体(Meloenetal.，疫苗(1994)12(8)741-746)能有效地提高这些分子的免疫原性。而且，为了在受激动物中引发明显的免疫应答，小蛋白或内源物质也可以和适当的载体结合。适当的载体一般包含起源于如病毒表面蛋白的感染物质的蛋白质的抗原区或载体肽序列的多肽。这些载体的作用是非特异地刺激T辅助细胞活性并与主要组织相容性复合物(MHC)的分子结合以引导抗原在抗原呈现性细胞的细胞表面对该肽的加工和呈现。为了这一目的已经开发了几种载体系统。例如，小肽抗原通常与如钥孔嘁血清蛋白(Bittleetal.，自然(1982)29830-33)，破伤风类毒素(Mulleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79569-573)，卵清蛋白，和抹香鲸肌红蛋白的蛋白质载体偶联产生免疫应答。这些偶联反应通常导致在每摩尔载体蛋白中掺入几摩尔肽抗原。虽然多重拷贝的肽抗原的出现一般增强免疫原性，但是载体可以引发与肽抗原无关的强免疫性，这可能抑制二次免疫时对肽疫苗的免疫应答(Schutzeetal，免疫学杂志(1985)1352319-2322)。抗原释放系统也是基于特殊载体。例如，预先形成的颗粒已经用作抗原偶联和掺入的平台。已经开发出了基于蛋白体(Lowelletal.，科学(1988)240800-802)、免疫刺激复合物(Moreinetal.，自然(1984)308457-460)、和如HBsAg的病毒颗粒(Neurathetal.，Mol.Immunol.(1989)2653-62)和轮状病毒属内部外壳蛋白(Redmondetal.，Mol.Immunol.(1991)28269-278)的系统。也利用重组生产的自我组装成颗粒的嵌合蛋白质设计了载体系统。例如，酵母逆转座子，Ty，编码一系列组装成类病毒颗粒的蛋白质(Ty-VLPs；Kingsman，S.M.，和A.J.KingsmanVacc.(1988)6304-306)。已经将外源基因插入TyA基因并作为融合蛋白在酵母中表达。融合蛋白保留自我组装成均一大小的颗粒的能力。已经检测了其它嵌合蛋白颗粒如HBsAg(Valenzuelaetal.，Bio/Technol.(1985)3323-326；美国专利号.4,722,840；Delpeyrouxetal.，科学(1986)233472-475)，乙型肝炎病毒核心抗原(Clarkeetal.，疫苗88(Ed.H.Ginsberg，etal.，1988)pp.127-131)，脊髓灰质炎病毒(Burkeetal.，自然(1988)33281-82)，和烟草花叶病毒(Haynesetal.，Bio/Technol.(1986)4637-641)。但是，这些载体的用途受可以插入结构蛋白而不干涉颗粒组装的活性试剂的有限大小的限制。最后，利用与选定的抗原融合的溶血巴士德氏菌白细胞毒素(LKT)多肽设计了嵌合系统。参见，例如，1993年4月29日公开的国际公开号WO93/08290和1992年3月5日公开的WO92/03558，以及美国专利号5,238,823和5,273,889。通过提供具有宽谱种类反应性的T-细胞表位，从而在免疫主体中引发一个T-细胞依赖性免疫应答，包含LKT载体部分的肽抗原嵌合体提供了对该嵌合体增强的免疫原性。在这点上，诱导适当的T-细胞帮助对产生对该嵌合体肽抗原部分的免疫应答是关键，特别是当该抗原是内源分子时。但是，到现在为止，还没有白细胞毒性多肽载体与GnRH肽的多重表位结合的用途的描述。本发明基于溶血巴士德氏菌白细胞毒素基因，及其变异体和编码多重GnRH多肽的核苷酸序列之间的新融合基因的构建。当与GnRH单独给药引发的免疫应答相比，这些构建体产生了表现出惊人地增强免疫原性的嵌合蛋白。所以在一个实施方案中，本发明涉及一个包含与多体融合的白细胞毒素多肽的嵌合蛋白，该多体基本上由一个以上选定的GnRH多肽组成，而嵌合体白细胞毒素部分的作用是增强GnRH多肽的免疫原性。具体地说，GnRH多体可以对应于一个以上拷贝的选定的GnRH多肽或表位，或选定的GnRH多肽或表位的多重串联重复。另外，GnRH多体可以定位在白细胞毒素多肽的羧基或氨基末端或内部位点。GnRH多体也可以对应于通式GnRH-X-GnRH的分子，其中X是选自于由肽键、氨基酸间隔基团和(GnRH)n组成的组，其中n大于或等于1，另外其中“GnRH”可以包括任何GnRH多肽。同时公开的是包含该嵌合蛋白和药学可接受载体的疫苗组合物，和在寄主体中提供选定的GnRH多体的方法，包括施用有效量的本疫苗组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及编码该嵌合蛋白的DNA构建体。该DNA构建体包含与编码一个以上拷贝的GnRH表位的第二个核苷酸序列可操作地连接的编码白细胞毒素多肽的第一个核苷酸。在又一个实施方案中，本发明涉及包含上述(a)的DNA构建体和(b)指导该构建体转录的控制序列的表达盒，从而使该构建体在寄主细胞中可以转录和翻译。在另一个实施方案中，本发明涉及用这些表达盒转化的寄主细胞。本发明的另一个实施方案提供了生产重组多肽的方法。该方法包括(a)提供上面描述的寄主细胞群和(b)在使表达盒编码的多肽表达的条件下培养该细胞群。根据本文公开的内容，本领域普通技术人员很容易想到本发明的这些和其它实施方案。附图的简要说明图1A和1B显示了用于嵌合白细胞毒素-GnRH多肽融合基因的GnRH构建体的核苷酸序列和氨基酸序列。图1A描述了包含单个拷贝的GnRH十肽的GnRH-1；图1B描述了包含当n＝1时四个拷贝的GnRH十肽，和当n＝2时8个拷贝的GnRH的GnRH-2。图2描述了质粒pAA352的结构，其中tac是来自大肠杆菌的杂合trp∷lac启动子；bla代表β-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)；ori是基于ColE1的质粒复制原点；lktA是溶血巴士德氏菌白细胞毒素结构基因；和lac1是E.colilac操纵子阻遏物。箭头表示白细胞毒素基因的转录/翻译方向。每个成份的大小不是按比例画出的。图3-1到3-9表示了白细胞毒素352(LKT352)的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。显示了LKT352的结构基因和侧接载体区的序列。图4表示了携带白细胞毒素-GnRH(LKT-GnRH)融合基因的质粒pCB113的结构。图5-1到5-8表示了来自pCB113的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。来自pCB112的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列与起源于pCB113的嵌合蛋白的序列相同，除了两次插入多重拷贝GnRH的序列，如上面图4所述。图6表示了携带白细胞毒素-GnRH(LKT-GnRH)融合基因的质粒pCB111的结构。图7-1到7-5表示了来自pCB111的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。来自pCB114的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列与上面图6所述的起源于pCB111的嵌合蛋白的序列相同除了两次插入多重拷贝GnRH的序列不同。图8表示了质粒pCB111的截短的白细胞毒素基因的平齐末端的融合点的核苷酸序列和推测的氨基酸序列(图8-2)，通过限制酶BstB1和Nael的消化从LKT352除去一个内部DNA片段(长度约为1300bp)(图8-1)。除非另有说明，本发明的方法将用到分子生物学，微生物学，病毒学，重组DNA技术，和免疫学的常规技术，它们是在本领域技术熟练人员已知的范围之内的。在文献中有这些技术的完全说明。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验室手册；DNA克隆，Vol.I和II(D.N.Glovered.)；低聚核苷酸合成(M.J.Gaited.)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higginseds.)；动物细胞培养(R.K.Freshneyed.)；固定的细胞和酶(IRL出版)；B.Perbal，分子克隆实验指导；丛书，酶学方法(S.Colowick和N.Kaplaneds.，Academic出版社，Inc.)和实验免疫学手册，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwelleds.，Blackwell科学出版)。A.定义在描述本发明时，将用到下面的术语，并如下所述进行定义。术语“促性腺激素释放激素”或“GnRH”是指丘脑下部分泌的十肽，它在脊椎动物中控制黄体化激素(LH)和促卵泡素(FSH)的释放(Fink，G.，英国医学通报(1979)35155-160)。在脊椎动物之间GnRH的氨基酸序列是高度保守的，特别是在哺乳动物中。在这点上，起源于大多数哺乳动物包括人，牛，猪和羊GnRH的GnRH(过去命名为LHRH)具有氨基酸序列pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(Muradetal.，激素和激素拮抗物，治疗学的药理学原理，第六版(1980)和Seeburgetal.，自然(1984)311666-668)。如本文所用，“GnRH多肽”包括起源于天然GnRH序列的分子，以及如下所述具有基本上与天然GnRH同源并保留免疫原性的的氨基酸序列的重组生产的或化学合成的GnRH多肽。所以，该术语包括在肽内部或氨基或羧基末端发生单个或多个氨基酸叠加，替代和/或缺失的GnRH的衍生物和类似物。因此，在本发明中，“GnRH多肽”包括具有天然序列的分子，如图1A描述的分子(具有一个N-末端Gin残基而不是焦Glu(pyroGlu)残基)，和具有其它氨基酸附加，替代和/或缺失的分子，它保留了引发与天然存在的GnRH交叉反应的抗体的形成的能力。本文特别涉及的是如图1B描述的低聚GnRH多肽的重复序列(其中每个选定的GnRH多肽包含一个N-末端Gln替代，另外其中每个其它GnRH多肽在位置2包含一个Asp残基替代)。GnRH的表位也在该定义的范围内。术语“表位”指特异抗体分子结合的抗原或半抗原上的位点。由于GnRH是非常小的分子，利用本领域已知技术很容易完成对其中能引发抗体反应的表位的鉴定。参见例如，Geysenetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)813998-4002(快速合成肽在给定抗原中确定免疫原表位的位置的一般方法)；美国专利号4,708,871(鉴定和化学合成抗原的表位的方法)；和Geysenetal.，分子免疫学(1986)23709-715(鉴定对给定抗体具有高亲和性的肽的技术)。如本文所用，术语“T-细胞表位”是指能诱导对肽构建体或相关的半抗原的T-细胞免疫性的一种肽的特征结构。在这点上，普通技术人员已接受了T-细胞表位包含在MHC分子的肽结合裂缝内具有扩展构型的线性肽决定簇(Unanueetal.，科学(1987)236551-557)。将多肽转化为MHCII类相关线性肽决定簇(长度一般在5-14个氨基酸之间)定义为“抗原加工”，这是由抗原呈现细胞(APC)完成的。具体地说，T-细胞表位是由短肽结构的局部特征如一级氨基酸序列特性，包括电荷和疏水性，和不依赖于整个多肽的折叠的某些类型的二级结构如螺旋性决定的。另外，一般认为能够被辅助T-细胞识别的短肽一般是两亲性结构，包括一个疏水侧链(与MHC分子反应)和一个亲水侧链(与T-细胞受体反应)，(Margalitetal.，计算机推测T-细胞表位，新产生疫苗Marcel-Dekker，Inc，ed.G.C.Woodrowetal.，(1990)pp.109-116)，另外两亲性结构具有一个α-螺旋构型(参见例如，Spougeetal.，J.Immunol.(1987)138204-212；Berkoweretal.，J.Immunol.(1986)1362498-2503)。所以，利用许多计算机程序可以容易地推测包括T-细胞表位的蛋白质片段。(参见例如，Margalitetal.，T-细胞表位的计算机推测，新产生疫苗Marcel-Dekker，Inc，ed.G.C.Woodrowetal.，(1990)pp.109-116)。通常这些程序把肽的氨基酸序列与诱导T-细胞反应的已知序列相比，寻找确信为T-细胞表位所需的氨基酸谱型。“免疫原性蛋白质”或“免疫原性氨基酸序列”分别是在它被施用的主体中引发免疫应答的蛋白质或氨基酸。在本发明中，“GnRH免疫原”是指，当进入寄主时，刺激免疫应答的GnRH分子。在这点上，GnRH免疫原包括对应于一个以上选定的GnRH多肽序列的多体；具体地说，具有多重或串联重复的选定的GnRH多肽序列的多体、多重或串联重复的选定的GnRH表位的多体，或其可预想到的它们的组合的多体。对抗原或疫苗的“免疫应答”是在寄主中产生对所用的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，这样一种应答包括但不局限于一个或更多下面的结果；特异地抗包括在所用组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、阻遏物T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞的产生。可利用本领域已知的多个免疫测定的任何一个检测免疫应答。术语“白细胞毒素多肽”或“LKT多肽”意指包含至少一个T-细胞表位并起源于属于以羧基末端同感氨基酸序列Gly-Gly-X-Gly-X-Asp为特征的分子的家族的蛋白质的多肽(Highlanderetal.，DNA(1989)815-28)，其中X是Lys，Asp，Val或Asn。这些蛋白质包括起源于溶血巴士德氏菌和Actinobacilluspleuropneumoniae的白细胞毒素，以及大肠杆菌α溶血素(Strathdeeetal.，Infect.Immun.(1987)553233-3236；Lo，Can.J.Vet.Res.(1990)54S33-S35；Welch，Mol.Microbiol.(1991)5521-528)及其它。已知这一毒素家族为毒素的“RTX”家族(Lo，Can.J.Vet.Res.(1990)54S33-S35)。另外，术语“白细胞毒素多肽”是指化学合成、从表达它的生物体中分离、或重组生产的白细胞毒素多肽。而且，该术语意指具有基本上与特定天然白细胞毒素分子中存在的邻接序列同源的氨基酸序列的免疫原蛋白质。所以，该术语包括全长和部分序列及其类似物。虽然天然全长白细胞毒素具有白细胞毒素活性，术语“白细胞毒素”也意指保留免疫原性但缺乏天然白细胞毒素的细胞毒性特性的分子。几个白细胞毒素的核苷酸序列和对应的氨基酸序列是已知的。参见例如，美国专利号4,957,739和5,055,400；Loetal.，Infect.Immun.(1985)50667-67；Loetal.，Infect.Immun.(1987)551987-1996；Strathdeeetal.，Infect.Immun.(1987)553233-3236；Highlanderetal.，DNA(1989)815-28；Welch，Mol.Microbiol.(1991)5521-528。在根据本发明生产的嵌合体中，选定的白细胞毒素多肽序列提高了融合GnRH多体的免疫原性，这是通过提供含有长度为5-14个氨基酸的小肽片段的T-细胞表位以及其它东西实现的，所述小肽片段可与MHCII类分子复合，以呈现于并活化T-辅助细胞。如下面进一步讨论，这些T-细胞表位存在于整个白细胞毒素分子中并认为是集中在白细胞毒素的N-末端部分，即在氨基酸残基1-199之间。如本文所用，“缺乏白细胞毒素活性”的白细胞毒素多肽是指如上所述的与天然全长白细胞毒素(如美国专利号5,055,400和4,957,739中描述的全长溶血巴士德氏菌白细胞毒素)相比缺乏明显的细胞毒性，但仍保留免疫原性和至少一个T-细胞表位的白细胞毒素多肽。可利用已知的检测方法如Korzeniewskietal.，免疫学方法杂志64313-320描述的乳酸脱氢酶释放检测来检测白细胞毒素多肽的白细胞毒活性，其中通过从牛嗜中性白细胞乳酸脱氢酶的释放来测定细胞毒性。如果与对照非白细胞毒性分子相比引起具有统计学意义的乳酸脱氢酶的释放，则该分子被鉴定为具有白细胞毒性。在本发明中，包含缺乏白细胞毒素活性的白细胞毒素多肽的LKT-GnRH嵌合体的构建体提供几个重要的益处。首先，由于注射活性毒素进入个体能导致局部细胞死亡(PMN和巨噬细胞)并依次在注射位点引起严重的炎症反应和脓肿，因而需要缺乏白细胞毒素活性的白细胞毒素多肽。在这点上，导致杀死巨噬细胞的白细胞毒素活性可以导致减少抗原呈现，因而引起最适度以下的免疫应答。如在用于生产本发明融合蛋白的非白细胞毒性LKT多肽中发现，除去细胞毒性部分所产生的截短的LKT基因能在远远高于全长LKT的水平表达。另外，在保留足够的T-细胞抗原性的本发明构建的融合体中使用非白细胞毒性LKT多肽减少了白细胞毒性-GnRH抗原的整个量，该抗原量是使寄主产生足够的对选定的GnRH多肽的B-细胞反应所必需的。缺乏白细胞毒素活性的免疫原性白细胞毒素多肽的特殊例子，包括下面非常详细描述的LKT352和LKT111。“LKT352”意指起源于质粒pAA352中的lktA基因的蛋白质(图2，ATCC登记号68283)。在国际公开号WO91/15237中描述了这一基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列如图3所示。该基因编码931个氨基酸，分子量约为99kDa的截短的白细胞毒素，它缺乏分子的细胞毒性部分。这样产生的截短的基因在远远高于全长分子的水平(超过40％的总细胞蛋白，而全长形式为1％的总细胞蛋白)表达并更易于纯化。在本发明中，派生出的LKT352不是必须地物理地起源于质粒pAA352中的序列。相反，它可能以任何方式产生，包括例如，化学合成或重组生产。另外，该蛋白质的氨基酸序列只需要与所描述的序列基本上同源。所以，只要LKT多肽能够增强它所结合的抗原的免疫原性并也缺乏白细胞毒素活性，序列变异是可以存在的。“LKT111”意指起源于质粒pCB111中的基因的白细胞毒性多肽(图6，ATCC登记号69748)。这一基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列示于图7。该基因编码白细胞毒素的一个截短形式，它是通过除去一个长度约为1300bp的内部DNA片段从存在于质粒pAA352中的重组白细胞毒素基因(图2，ATCC登记号68283)发展而来的。LKT111多肽的分子量约为52kDa(与99kDaLKT352多肽相比)，但保留了来自LKT352的含有足够的T-细胞免疫原性所必需的T-细胞表位的N-末端部分和来自LKT352的含有用于生产本发明融合蛋白的适当限制位点的C-末端部分。在本发明中，LKT111白细胞毒性肽不是必须起源于存在于质粒pCB111中的序列。相反，它可以以任何方式产生，包括例如，化学合成或重组生产。另外，该蛋白质的氨基酸序列只需要与所描述的序列基本上同源。所以，只要该蛋白质能够增强它所结合的抗原的免疫原性并也缺乏白细胞毒素活性，序列变异是可以存在的。当白细胞毒素-GnRH多肽嵌合体比对应的单独的GnRH多体具有更高的引发免疫应答的能力时，它显示出“增强的免疫原性”。通过给动物施用特定的白细胞毒素-GnRH多肽和GnRH多体对照和利用如本领域已知的放射免疫测定和ELISA的标准测定比较抗两者的抗体效价可以确定这些增强的免疫原性。“重组”蛋白或多肽是指通过重组DNA技术，即从编码所需多肽的外源DNA构建体转化的细胞生产的多肽。“合成的”蛋白或多肽是那些化学合成制备的。DNA“编码序列”或特定蛋白的“核苷酸编码序列”，是在适当调节序列的控制下体内或体外转录和翻译成多肽的DNA序列。由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定编码序列的分界。编码序列可以包括，但不局限于，原核生物序列，来自真核生物mRNA的cDNA，来自真核生物(如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3’端。DNA“控制序列”是启动子序列，核糖体结合位点，多聚腺苷酸化信号，转录终止序列，上游调节区，增强子，等的总称，它们在寄主细胞中共同调节编码序列的转录和翻译。一个编码序列与另一个编码序列“可操作地连接”是指当RNA聚合酶将两个编码序列转录成mRNA，随后翻译成这两个编码序列编码的嵌合多肽时。编码序列不需要一个接一个的邻接，只要被转录序列最终加工产生所需的嵌合蛋白。当控制序列控制编码序列的转录时，它就是与编码序列“可操作地连接”的。控制序列在细胞中“指导编码序列的转录”是指当RNA聚合酶结合启动子序列并把编码序列转录成mRNA，随后翻译成该编码序列编码的多肽。“寄主细胞”是已经或能够被外源DNA序列转化的细胞。当外源DNA已经导入细胞膜内时，细胞已经被外源DNA“转化”。外源DNA可以或可以不整合(共价连接)到染色体DNA中组成细胞的基因组。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以附加体存在，如质粒。对于真核生物细胞，稳定的转化细胞是其中外源DNA已经整合进染色体中以致通过染色体复制可遗传给子细胞。这一稳定性被真核生物细胞能够形成含有该外源DNA子细胞群的细胞系或克隆的所证实。当在确定长度的分子中至少约80％(优选地至少约90％，最优选至少约95％)的核苷酸或氨基酸匹配时，两个DNA或多肽序列“基本同源”。在Southern杂交实验中，例如对特定系统确定的严馑条件下，可以鉴定基本同源的DNA序列。确定适当杂交条件是本领域技术人员已知的。参见例如，Sambrooketa.，如上所述；DNA克隆，VolI和II，如上所述；核酸杂交，如上所述。DNA构建体的“异源”区是附着于或存在于另一个DNA分子之中的可识别的DNA区段，该另一个分子在天然状态不与其它分子结合存在。所以，当异源区编码细菌基因时，该基因通常与在源细菌基因组中不侧接的细菌基因的DNA侧接。异源编码序列的另一个例子是其本身在自然界中不存在的编码序列(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)的构建体。如本文所用，等位基因变化或自然发生的突变事件不产生DNA的异源区。“脊椎动物主体”是指脊索动物亚门的任何成员，包括，但不局限于，如啮齿动物，牛，猪，羊，山羊，马和人的哺乳动物；如狗，猫的驯养动物；包括如包括小鸡，火鸡的公鸡和母鸡和其它鸡类鸟的驯养、野生和可捕猎鸟的鸟。该术语不表示特殊年龄。所以，成年和新生动物都包括在内。B.总体方法本发明的中心是发现了白细胞毒素多肽当与选定的GnRH多肽重复区(或多体)偶联时，能赋予结合的GnRH组分较高的免疫原性。在这点上，白细胞毒素多肽的作用是以高免疫原形式给主体的免疫系统提供选定的GnRH多体的载体蛋白。所以，本发明构建的嵌合蛋白可以配制成疫苗组合物，它给存在的GnRH多肽提供增强的免疫原性。白细胞毒素基因与选定的GnRH多肽的融合也有利于从表达它的细胞纯化该嵌合蛋白。因此，作为本文的例子的是包括与一个以上GnRH肽序列融合的白细胞毒素的白细胞毒素嵌合体。本发明特别设计的实施方案包括包含与GnRH多体融合的白细胞毒素多肽的嵌合体，其中所说的多体基本由至少一个重复GnRH十肽序列组成，或由至少一个对应于至少一个选定的GnRH分子的表位的序列的重复单位组成。另外，选定的GnRH肽序列可以都相同，或可以对应于GnRH不同的衍生物、类似物、突变体或GnRH的表位，只要它们保持引发免疫应答的能力。图1A描述了一个具代表性的GnRH十肽的核苷酸序列。本发明的GnRH序列是通过N-末端的谷氨酰胺替代天然序列中存在的焦谷氨酸进行修饰的。这一特殊的替代使分子保留了天然谷氨酸结构但也保留了焦谷氨酸的无电荷结构。因此，得到的肽不需要谷氨酸残基的环化并可以在缺乏发生环化所必需的条件下生产。由于GnRH序列相当短，用下面详细描述的合成技术可以容易地生产。在本发明中，为了在脊椎动物中帮助引发对内源GnRH的适当的免疫应答，用白细胞毒素多肽序列赋予对结合的GnRH多肽(作为载体蛋白)免疫原性。以这种方式，用GnRH的免疫接种可以在被接种动物中通过破坏发情周期或精子生成调节繁殖力。在美国专利号4,975,420可以发现有关GnRH的详细讨论。另外，本文特别值得注意的是提供了目前在驯养和农场畜牧业中使用的侵入性绝育方法如外科阉割，外科子宫卵巢切除术和诸如此类的可靠的有效的替代方法。根据本发明的在脊椎动物中利用白细胞毒素-GnRH嵌合体对免疫抑制再生活性提供了一个有效替代方法，其中该构建体实现在免疫动物中产生再生活性的均一失活。在这点上，为了提供成功替代外科方法的手段，在个体动物对少量接种疫苗应答时合适的绝育疫苗产物必须均一地使再生能力失活。这一特性对群体动物的免疫绝育特别重要，特别是，它如人所愿地免疫阉割雄性小猪，以防止在雄性小猪的正常功能睾丸中雄性类固醇的合成产生的“未阉割猪沾染”。参见例如Meloenetal.，疫苗(1994)12(8)741-746。由于GnRH肽和/或有关的载体系统的不充分的免疫原性，和由此产生的各种现有的基于GnRH的疫苗不能对内源GnRH诱导足够的免疫应答，过去的开发这一产品的努力还没有产生恒定的结果。因此，为了得到更高免疫原性的GnRH肽抗原，本发明设计的白细胞毒素-GnRH多肽嵌合体含有对应于一个以上选定的GnRH多肽序列的GnRH部分。这一特性是基于这样的认识，内源蛋白一般可以通过它们的表位的多体化而有效地赋予其自身抗原性，如上所述。具体地说，本发明设计的新嵌合体的GnRH部分可以包含多重或串联重复的选定的GnRH序列，多重或串联重复的选定的GnRH表位，或其任何适当的组合物。在这点上，利用上面详细描述的技术可以鉴定GnRH表位，或者可以测试GnRH蛋白的片段的免疫原性和可以替代整个多肽的用于组合物中的的活性片段。图1B描述了本发明特定的GnRH部分的序列，其中四个GnRH序列、分别由(1)、(2)、(3)和(4)表示，被三个一组的氨基酸间隔序列隔开，该间隔序列含有各种丝氨酸和甘氨酸残基组合。在该低聚物中，每隔一个的GnRH序列(分别用(2)和(4)表示)在GnRH十肽的第二位置含有一个非保守氨基酸替代，由Asp残基替代天然GnRH序列中存在的His残基。这样产生的相间GnRH多体序列提供了一个可用于本发明融合蛋白的高免疫原性GnRH抗原肽。本发明人也特别设想了可用于重复或相间多体序列的其它对应于任何单个或多个氨基酸附加、替代和/或缺失的GnRH类似物。此外，图1B描述的特定的GnRH部分在GnRH部分之间含有间隔序列。为了赋予该构建体增强的免疫原性，本发明人特别设想了选定的GnRH多肽之间的各种间隔序列的使用策略。因此，在本发明中，选定的间隔序列可以编码长度为一个或更多氨基酸的部分的各种类型。选定的间隔基团可以优选地提供酶切割位点以便在体内可由蛋白水解酶(APC’s或诸如此类)加工该表达的嵌合体，产生多种肽——各含有至少一个起源于载体部分(白细胞毒素部分)的T-细胞表位——并优选的是与基本上完整的GnRH多肽序列融合。另外，可以构建间隔基团以便在选定的GnRH组分之间的联结区含有对免疫接种的动物来说为明显的外来序列，从而赋予联合的GnRH肽增强的免疫原性。另外，为了提供T-细胞抗原性，可以构建间隔序列，如编码两亲性和/或α-螺旋肽序列的序列，本领域一般认为该序列提供免疫原性的辅助T-细胞表位。在这点上，由这样的间隔序列提供的特定T-细胞表位的选择可以依赖于所接种的特定脊椎动物种类而变化。虽然，举例说明了含有间隔序列的特定的GnRH部分，本发明人也设想了包括直接邻接的GnRH序列(没有介入间隔序列)的GnRH多体。可以容易地重组生产嵌合蛋白形式的白细胞毒素-GnRH多肽复合物。嵌合体的GnRH部分可以融合于该分子的白细胞毒素部分的5’或3’端，或者GnRH部分可以定位于白细胞毒素分子的内部位点。编码全长溶血巴士德氏菌A1白细胞毒素的核苷酸序列已被确定，参见例如，Lo，感染免疫(1987)551987-1996；美国专利号5,055,400。另外，本文公开了几个变异型白细胞毒素基因序列。同样，猪，牛，羊GnRH的编码序列已被确定，(Muradetal.，激素和激素拮抗物，治疗学的药理原理，第六版(1980))，以及人GnRH的cDNA已被克隆，所以已经很好地建立了它的序列(Seeburgetal.，自然(1984)311666-668)。已知序列的其它GnRH多肽已经公开，如存在于鲑鱼和鸡中的GnRH分子(1986年12月18日公开的国际专利申请公开No.WO86/07383)。在这点上，值得注意的是脊椎动物，特别是哺乳动物中GnRH是高度保守的，另外，猪，牛，羊和人GnRH序列完全相同。利用本领域一般技术人员已知的重组技术可以将所需要的白细胞毒素和GnRH基因克隆分离、和连接到一起。参见例如，Sambrooketal.，如上所述。另一种可选的方法，可以合成制备而不是克隆编码嵌合蛋白的DNA序列。用编码特定氨基酸序列的适当密码子可以设计该DNA序列。总的来说，如果序列将用于表达，人们将为预定的寄主选定优选密码子。从由标准方法制备的重叠低聚核苷酸组装完整的序列并组装成完整的编码序列。参见例如，Edge，自然(1981)292756；Nambairetal.科学(1984)2231299；Jayetal.J.Biol.Chem.(1984)2596311。一旦制备或分离了嵌合蛋白的编码序列，可以把它们克隆进任何合适的载体或复制子。本领域熟练技术人员已知众多克隆载体，使用何种载体只是一个选择的问题。用于克隆的重组DNA载体和它们转化的寄主细胞的例子包括lambda噬菌体(大肠杆菌)，pBR322(大肠杆菌)，pACYC177(大肠杆菌)，pKT230(革兰氏阴性菌)，pGV1106(革兰氏阴性菌)，pKAFR1(革兰氏阴性菌)，pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性菌)，pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，pBD9(芽孢杆菌)，pIJ61(链霉菌)，pUC6(链霉菌)，YIp5(酵母菌)，YCp19(酵母菌)和牛乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)。一般可参见DNA克隆Vols.I和II，如上所述；T.Maniatisetal.，如上所述；B.Perbal，如上所述。将融合基因置于启动子，核糖体结合位点(用于细菌表达)和可任选的操纵基因(本文总称为“控制”元件)的控制下，以便编码嵌合蛋白的DNA序列在由含有这一表达构建体的载体转化的寄主细胞中转录成RNA。该编码序列可以或可以不含有信号肽或引导序列。利用例如，天然溶血巴士德氏菌启动子，大肠杆菌tac启动子或蛋白质A基因(spa)启动子和信号序列可以表达本发明的嵌合蛋白。引导序列可以在翻译后加工中被细菌寄主除去。参见例如，美国专利号4,431,739；4,425,437；4,338,397。除了控制序列，也可能需要加入调节序列，以对该蛋白质序列的表达相对寄主的生长进行调节。调节序列是本领域技术人员已知的，例子包括应答化学或物理刺激，包括调节化合物是否存在，而使基因的表达开始或关闭的那些序列，其它类型的调节元件也可以存在于载体中，例如增强子序列。构建了表达载体使特定的融合编码序列定位于具有适当调节序列的载体中，编码序列相对于控制序列的位置和方向应使该编码序列在控制序列的“控制”下转录(即，在控制序列上与DNA分子结合的RNA聚合酶转录该编码序列)。为达到这一目的，可能需要修饰编码所感兴趣的特定嵌合蛋白的序列。例如，在某些情况下，可能需要修饰该序列使它能够以适当的方向连接于控制序列，即保持读码框架。控制序列和其它调节序列可以在插入载体(如上所述的克隆载体)之前与编码序列连接。另一种可选的方法，编码序列可以直接克隆进已经含有控制序列和适当的限制位点的表达载体。在某些情况下，需要加入可引起多肽从寄主生物体分泌，随后切割分泌信号的序列。也可能需要制备所需嵌合蛋白的突变体或类似物。由一部分编码蛋白质的序列的缺失、序列的插入、和/或在序列内替代一个或多个核苷酸可以制备突变体或类似物。修饰核苷酸序列的技术，如位点特异性诱变，是本领域技术人员已知的。参见例如，T.Maniatisetal.，如上所述；DNA克隆，Vols.I和II，如上所述；核酸杂交，如上所述。许多原核生物表达载体是本领域已知的。参见例如，美国专利号4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,418,149；4,411,994；4,366,246；4,342,832；同时参见英围专利申请GB2,121,054；GB2,008,123；GB2,007,675；和欧洲专利申请103,395。酵母表达载体也是本领域已知的。参见例如，美国专利号4,446,235；4,443,539；4,430,428；同时参见欧洲专利申请103,409；100,561；96,491。根据所选择的表达系统和寄主，通过在表达所需蛋白质的条件下生长由上面描述的表达载体转化的寄主细胞生产本发明的蛋白质。然后从寄主细胞分离该嵌合蛋白并纯化。如果表达系统分泌蛋白质进入生长培养基，可从培养基中直接纯化蛋白质。如果蛋白质没有被分泌，由细胞裂解物分离。适当的生长条件和回收方法的选择是本领域的公知技术。根据确定的氨基酸序列，通过如固相肽合成的化学合成方法也可以生产本发明的嵌合蛋白。这些方法是本领域技术人员已知的。参见例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第二版，PierceChemicalCo.，Rockford，IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，肽分析、合成、生物学，编者E.Gross和J.Meienhofer，Vol.2，学术出版社，纽约(1980)，pp.3-254，用于固相肽合成技术；和M.Bodansky，肽合成原理，Springer-Verlag，Berlin(1984)和E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，肽分析、合成、生物学，上述文献，Vol.1，用于典型的溶液合成。对动物个体可用根据本发明构建的嵌合蛋白通过施用包含所说蛋白质的疫苗组合物进行免疫接种。在免疫接种之前，可能需要进一步增强特定的嵌合蛋白的免疫原性。这可以用本领域技术人员已知的几种方法中的任何一种完成。例如，白细胞毒素-GnRH多肽融合蛋白可以与一个二级载体结合给药。例如，一个片段可以与大分子载体结合。适当的载体典型地是大的代谢慢的大分子，如蛋白质；多糖，如琼脂糖，琼脂，纤维素，纤维素小珠和诸如此类；聚合氨基酸，如聚谷氨酸，聚赖氨酸，和诸如此类；氨基酸共聚物；和失活的病毒颗粒。特别有用的蛋白质底物是血清白蛋白，钥孔嘁血蓝蛋白，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，和其它本领域技术人员熟知的蛋白质。这些蛋白质底物可以以它们的天然形式使用或者可以通过例如赖氨酸残基的琥珀酰化或与Cys-硫内酯反应修饰它们的功能基团。通过例如功能氨基与2-亚氨基thiolane或3-(4-二硫吡啶基)丙酸盐的N-羟基琥珀酰亚胺酯的反应也可以把巯基掺入载体(或选定的GnRH多肽)。合适的载体也可以被修饰以便掺入间隔臂(如己撑二胺或其它同样大小的双功能分子)用于结合肽。用于本发明的嵌合蛋白的其它合适载体包括如美国专利号5,071,651公开的轮状病毒的VP6多肽，或其功能片段。同时有用的是病毒蛋白质和白细胞毒素-GnRH免疫原的融合产物，其中该融合产物是由美国专利号4,722,840公开的方法制造的。还有其它合适的载体包括细胞如淋巴细胞，因为这一形式的呈现模仿了产生免疫接种状态的个体中存在的天然呈现方式。另一种可选的方法，本发明的融合蛋白可以与红细胞，优选地个体自身的红细胞偶联。肽与蛋白质或细胞偶联的方法是本领域技术人员已知的。本发明的新嵌合蛋白也可以通过表达它们的载体病毒给药。可用于本发明的载体病毒包括，但不局限于，痘苗和其它痘病毒，腺病毒，疱疹病毒。例如，可以如下构建表达该新嵌合蛋白的疫苗病毒重组体。首先把编码特定白细胞GnRH嵌合蛋白的DNA插入适当的载体使它与痘苗启动子邻接，并且和如编码胸腺嘧啶激酶的DNA序列侧接。然后用这一载体转染同时用痘苗感染的细胞。通过同源重组把痘苗启动子加上编码本发明嵌合蛋白的基因插入病毒基因组。通过在5-溴脱氧尿苷存在时培养该细胞并挑选具有抗性的病毒噬菌斑可以选择得到的TK-重组体。单独或与药学可接受载体或赋形剂混合给药，将根据本发明生产的嵌合蛋白免疫接种个体也是可能的。典型地，疫苗被制备成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备成在注射之前适于溶于液体载体或悬浮于液体载体的固体形式。也可以将制剂乳化或将活性成份包裹于脂质体载体中。活性免疫原性成份经常与含有药学可接受的和与活性成份相容的赋形剂的载体混合。合适的载体是例如，水，盐，葡萄糖，甘油，乙醇，或诸如此类，和它们的联合。另外，如果需要，载体可以含有最小量的辅助物质如增湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，或增强疫苗效果的佐剂。佐剂可以包括例如，胞壁酰二肽，avridine，氢氧化铝，油，皂角苷和其它本领域已知的物质。制备这些药剂形式的具体方法是已知的，或者是本领域技术人员显而易见的。参见例如，Remington的药学科学，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，第18版，1990。在任何情况下，给药的组合物或配方中将含有一定量的适于在治疗的个体中获得所希望的免疫接种状态的蛋白质。适于其它给药方式的其它的疫苗制剂包括栓剂和，某些情况下，烟雾剂，鼻内的，口服的配方，和持续释放配方。对于栓剂，载体组成将包括传统结合物和载体如，聚碱性乙二醇，或三酰甘油酯。可以从含有约0.5％-约10％(w/w)，优选地约1％-约2％范围的活性成份的混合物中形成这些栓剂。口服的载体包括那些通常使用的赋形剂，例如，药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，镁，硬脂酸盐，糖精纤维素钠，碳酸镁，和诸如此类。这些口服疫苗组合物可以以溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊，维持释放配方，或粉末的形式服用，并含有约1％-约30％的活性成份，优选地约2％-约20％。鼻内给药的配方通常包括既不引起鼻粘膜刺激也不明显打乱纤毛功能的载体。稀释剂如水，盐水或其它已知物质可以用于本发明。鼻配方也可以含有防腐剂如，但不限于，三氯叔丁醇，杀藻铵。表面活性剂可能表现出增强鼻粘膜对主体蛋白的吸收。通过把嵌合蛋白掺入载体如脂质体，不吸收的密封的聚合体如乙烯乙烯基乙酸共聚物和Hytrel共聚物，可吸胀的聚合物如水凝胶，或可吸收的聚合物如胶原和某些多元酸或如那些用于制造可吸收缝合线的聚酯制造控制的或持续释放的制剂。嵌合蛋白也可以用本领域已知的植入小泵来提供。此外，嵌合蛋白(或其复合物)可以以中性或盐形式配制成疫苗组合物。药学可接受盐包括酸加成盐(用活性多肽的游离氨基形成)和那些用无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸，草酸，酒石酸，苯乙醇酸，和诸如此类形成的。从游离羧基形成的盐也可以起源于无机碱如，氢氧化钠，钾，铵，钙，或铁，和有机碱如异丙胺，三甲胺，2-乙胺基乙醇，组氨酸，普鲁卡因，和诸如此类。为了免疫接种个体，将选定的GnRH-白细胞毒素嵌合体以合适的载体中非肠胃，通常肌肉内注射给药。但是，其它给药方式如皮下，静脉注射和鼻内释放也是可接受的。可注射疫苗制剂将含有存在于载体中的有效量活性成份，准确量是容易被本领域技术人员确定的。典型的活性成份的范围为约1％-约95％(w/w)的组合物，或如果合适甚至更高或更低。给药的量根据被治疗的动物，动物的免疫系统合成抗体的能力，和需要的保护程度来确定。对于该疫苗制剂，在给药时对于产生免疫应答，每ml注射溶液含有大约1μg-1mg，更通常5μg-200μgGnRH多肽是适当的。在这点上，该疫苗制剂的白细胞-GnRH抗原中GnRH对白细胞毒素的比例将根据选择的用于构建这些分子的特定白细胞毒素和GnRH多肽组分而变化。具体地说，在根据本发明用于生产疫苗制剂的白细胞毒素-GnRH多肽中，每个融合分子大约有1-25％GnRH，优选地约3-20％和最优选地约7-17％GnRH多肽。存在于LKT-GnRH抗原中的GnRH的百分数的增加减少了为了引发有效的对GnRH的B-细胞应答必须给个体施用的总抗原量。通过建立剂量应答曲线的常规试验，本领域普通技术人员可以容易地确立有效剂量。通过施用至少一个剂量，和优选地两个剂量的白细胞-GnRH多肽可以免疫接种个体。此外，可以对动物进行多次给药，以维持免疫状态。下面是实现本发明的特殊实施方案的例子。这些例子只为了说明目的，不打算以任何方式限制本发明的范围。C.实验材料和方法酶从商业途径购买并根据制造商的说明使用。同时从商业途径购买放射性核苷酸和硝酸纤维素滤纸。在DNA片段的克隆中，除有说明以外，所有的DNA操作都根据标准方法进行。参见Sambrooketal.，如上所述。从商业供应商购买并根据制造商的说明使用限制酶，T4DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段，和其它生物学试剂。在琼脂糖凝胶上分离双链DNA片段。分别在pUC13和λgt11噬菌体中用标准技术制备cDNA和基因组文库。参见DNA克隆VolI和lI，如上所述。从死于肺炎巴士德菌病的牛的肺中分离得到溶血巴士德氏菌生物型A，血清型1(“A1”)菌株B122并在-70℃储存于去纤维蛋白的血液中。在血液琼脂平板或用5％马血清(GibcoCanadaLtd.，Burlington，Canada)补充的脑心浸出肉汤(Difco实验室，Detroit，MI)中进行常规繁殖。所有的培养在37℃温育。实施例1分离溶血巴士德氏菌白细胞毒素基因为了分离白细胞毒素基因，利用标准技术构建了溶血巴士德氏菌A1(菌株B122)的基因文库。参见，Loetal.，Infect.Immun.，如上所述；DNA克隆Vol.I和II，如上所述；和Sambrooketal.，如上所述。在质粒载体pUC13中构建了基因组文库并在噬菌体λgt11中构建了DNA文库。将得到的克隆用于转化大肠杆菌并且收集和筛选了与来自幸免于溶血巴士德氏菌感染的并用溶血巴士德氏菌的浓缩培养上清液加强以便增加抗白细胞毒素抗体水平的牛的血清反应的单个克隆。通过将细胞裂解物与牛中性白细胞培养并随后测量后者乳酸脱氢酶的释放来检测阳性克隆产生白细胞毒素的能力。鉴定了几个阳性克隆并制作限制性核酸内切酶图谱分析这些重组体。一个克隆似乎与过去克隆的白细胞毒素基因相同。参见，Loetal.，Infect.Immun.，如上所述。为了证明，再克隆了更小的片段并比较限制图。证实了约4kb的DNA已被克隆。为了分离长度约8kb的全长重组体，通过进行染色体步移(5’-3’方向)逐渐分离了更大的克隆。该最后的构建体命名为pAA114。这一构建体含有整个白细胞毒素基因序列。用DNA聚合酶I的Klenow片段加三磷酸核苷酸处理lktA，一个来自pAA114的含有整个白细胞毒素基因的MaeI限制性核酸内切酶片段，并连接到克隆载体pUC13的SmaI位点。将这一质粒命名为pAA179。由此，在用SmaI消化的基于ptac的载体pGH432lacI中制备两个表达构建体。一个是pAA342，含有lktA基因的5’-AhaIII片段，而另一个是pAA345，含有上面描述的整个MaeI片段。克隆pAA342以高水平表达截短的白细胞毒素肽，而pAA345以低水平表达全长白细胞毒素。所以，lktA基因(来自pAA345的StyIBamHI片段)的3’末端与StyIBamHI消化的pAA342连接，产生质粒pAA352。图2表示了pAA352的结构，图3表示了产自pAA352构建体(下文中称为LKT352)的溶血巴士德氏菌白细胞毒素的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。实施例2构建LKT-GnRH融合体代表性的LKT-GnRH融合体构建如下。用标准的氨基磷酸酯(phosphoramidite)化学方法在Pharmacia基因组装器上构建了含有对应于单个拷贝GnRH和四个多重重复的GnRH的序列的低聚核苷酸。图1A和1B显示了这些低聚核苷酸的序列。把该低聚核苷酸退火并且连接到已经用限制性核酸内切酶BamH1消化的载体pAA352(ATCC号68283，如上所述)。这一载体含有溶血巴士德氏菌白细胞毒素基因。利用连接的DNA转化大肠杆菌菌株MH3000。制作限制性核酸内切酶图谱鉴定含有该低聚核苷酸插入体的转化体。通过将四个拷贝的GnRH低聚核苷酸退火并把它们连接到已经用限制性核酸内切酶BamH1消化的载体上而制备一个八个拷贝的GnRH串联重复序列。把低聚物设计成在插入时使上游BamH1位点失去功能并保证其它拷贝的低聚物的插入将定向于正确的读码框架。图1B显示了该低聚核苷酸的序列。然后分离来自大肠杆菌MH3000菌株的质粒DNA并用于转化菌株JM105。将该重组质粒命名为pCB113(LKT3524个拷贝的GnRH，ATCC登记号69749)和pCB112(LKT3528个拷贝的GnRH)。图4显示了重组质粒pCB113，质粒pCB112与pCB113相同，所不同的是多个拷贝GnRH序列(对应于图1B的低聚物)如上所述插入两次。图5显示了pCB113的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列。pCB112的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列是相同的，所不同的是多个拷贝的GnRH序列插入两次。实施例3构建截短的LKT载体肽从存在于质粒pAA352(如上所述)的重组基因构建重组白细胞毒素肽的一个截短形式。通过如下所述从重组LKT基因中切除长度约为1300bp的内部DNA片段产生截短的LKT基因。用限制酶BstBl(NewEnglandBiolabs)消化质粒pCB113(ATCC登记号69749)，它含有与四个拷贝的GnRH多肽融合的LKT352多肽。然后用绿豆(mungbean)核酸酶(Pharmacia)消化得到的线性化质粒，以除去BstB1消化产生的单链突出末端。然后用限制酶Nae1(NewEnglandBiolabs)消化该平齐的DNA。并把该消化的DNA加到1％的琼脂糖凝胶上，电泳分离DNA片段。用基因清洁试剂盒(Bio101)从琼脂糖凝胶上分离和纯化约6190bp的大DNA片段，并用噬菌体T4DNA连接酶(Pharmacia)使纯化片段自我连接。用得到的连接混合物转化感受态E.coliJM105细胞，根据产生具有分子量约57KDa的聚集蛋白的能力鉴定阳性克隆。这样形成的重组质粒命名为pCB111(ATCC登记号69748)，它产生与四个拷贝的GnRH多肽融合的截短的白细胞毒性多肽(下文称为LKT111)。图6显示了pCB111的结构。质粒pCB114与pCB111相同，不同的是多重拷贝GnRH序列(对应于图1B的低聚物)插入两次。图7显示了pCB111的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列，pCB114的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列是相同的，所不同的是多重拷贝GnRH序列插入两次。用噬菌体T7聚合酶测序试剂盒(Pharmacia)测序，已经证实了该克隆的连接融合点的核苷酸序列。图8显示了这些融合点的核苷酸序列。实施例4LKT-抗原融合体的纯化用下面的方法纯化实施例2和3的重组LKT-GnRH融合体。对每个融合体，在10ml用100mg/ml的氨苄青霉素补充的TB肉汤中接种5-10个转化的E.coli菌株菌落，并在37C在G10摇床，220rpm上温育6小时。把4ml该培养物稀释进两个含有400mlTB肉汤+氨苄青霉素的涂保护层的(batfled)Fernbach烧瓶中，并如上所述温育过夜。用SorvallGS3离心机在500ml体积的聚丙烯瓶中，以4000rpm，离心10分钟收集细胞。将沉淀重悬浮于等体积的已经预热到37℃的含有氨苄青霉素的TB肉汤(即，2×400ml)，如上所述温育细胞2小时。为了诱导重组融合蛋白的合成，在每个培养物中加入溶于水中的3.2ml异丙基-B，D-巯基吡喃半乳糖苷(IPTG，Gibco/BRL)，500mM(最后浓度＝4mM)。温育培养物2小时。如上所述离心收集细胞，重悬浮于30ml50mMTris-HCl，25％(w/v)蔗糖，pH8.0，-70C冰冻。在-70℃放置60分钟后，在室温融化冰冻细胞，加入5ml溶菌酶(Sigma，20mg/ml于250mMTris-HCl中，pH8.0)。高速涡旋该混合物10秒，然后放于冰上15分钟。然后把细胞加入1000ml烧杯中的500ml溶解缓冲液中并用2ml的移液管搅拌混合。把含有溶解的细胞悬浮液的烧杯放置于冰上，并用Braun超声波器，大探针设定在100瓦特功率，声处理共2.5分钟(处理5-30秒间歇1分钟)。把等体积的溶液放置在TeflonSS34离心管中并在SorvallSS34转头中在10000rpm离心20分钟。在总共100ml无菌重蒸馏水中通过高速涡旋重悬浮沉淀，重复离心步骤。弃去上清液，沉淀合并入20ml10mMTris-HCl，150mMNaCl，pH8.0(Tris缓冲盐)，并在-20℃冰冻该悬浮液过夜。在室温下融化该重组悬浮液并加入到100ml溶于Tris-缓冲盐中的8M盐酸胍(Sigma)并剧烈混合。在瓶中放一磁性搅拌棒，在室温下将溶解的样品混合30分钟。把溶液转移到2000mlErlenmyer烧瓶中，快速加入1200mlTris-缓冲液。在室温下再搅拌混合物2小时。把500ml等分试样放入透析袋(作用谱(Spectrum)，63.7mm直径，6000-8000MW截止值(cutoff)，#132670，来自Fisher科学)，把这些放入含有3500mlTris-缓冲盐水+0.SM盐酸胍的4000ml烧杯中。把烧杯放于4℃室内在磁性搅拌器上过夜，在这之后，用Tris-缓冲盐水+0.1M盐酸胍代替透析缓冲液并继续透析12小时。然后将缓冲液用Tris-缓冲液+0.05M盐酸胍替换，并继续过夜透析。将缓冲液用Tris-缓冲液(不含胍)替换，并继续透析12小时。把这一做法重复3次以上。把最后的溶液倒入2000ml的塑料滚筒瓶(Coming)中并加入13ml100mMPMSF(在乙醇中)抑制蛋白酶活性。以100ml等分试样将溶液储存于-20℃。为了证明融合蛋白已经分离，把每个制剂的等分试样在重蒸馏水中稀释20倍，与等体积的SDS-PAGE样品缓冲液混合，放置于沸水浴5分钟并于12％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。同时也对重组白细胞毒素对照进行电泳。所有的融合蛋白以内含体形式高水平表达。根据融合蛋白DNA序列推测的分子量是104869(LKT352∷4个拷贝的GnRH，来自pCB113)；110392(LKT352∷8个拷贝的GnRH，来自pCB112)；57542(LKT111∷4个拷贝的GnRH，来自pCB111)；63241(LKT111∷8个拷贝的GnRH，来自pCB114)。重组体LKT352分子的推测分子量是99338，重组体LKT111分子的推测分子量是51843。实施例5LKT-GnRH融合体的体内免疫活性为了测试体内LKT-GnRH融合体体内诱导抗GnRH免疫应答的能力，并且为了将它对其它GnRH载体结合物的应答进行比较，进行了下面的免疫接种试验。利用了三组8个约8周龄(35-50kg)的雄性猪，它们无特异病原体。在最不易感染疾病的设施中喂养这些动物并用下面的配方在试验的第0和21天接种组1——由用EmulsigenPlus佐剂配制的盐组成的安慰剂(2ml)，该佐剂含有15mgDAA；组2——用同样的佐剂配制的LKT352-GnRH(250μgLKT，如前面的实施例所述制备)(2ml)；组3——VP6-GnRH，0.5μgVP6和5μgGnRH，用同样佐剂配制(2ml)。用美国专利号5,071,651描述的结合肽制备VP6制剂。在第0，21和35天采取血样，凝集，在1500g离心，除去血清。用Silversidesetal.，J.Reprod.Immunol.(1985)7171-184的RIA方法测定抗GnRH的血清抗体效价。这一试验的结果表明只有那些用LKT352-GnRH配方免疫接种的动物产生了显著的抗GnRH的效价(效价＞1∶70)。安慰剂和VP6-GnRH组都不产生抗GnRH效价。过去，为了诱导抗激素效价需要用超过100μg的GnRH剂量，与其它载体蛋白结合重复接种。这些结果表明LKT-GnRH载体系统提供了大大先进于过去的载体系统的免疫原。实施例6与LKT连接的多重串联GnRH重复的体内免疫效果为了测试含有多重GnRH多肽重复的重组LKT-GnRH融合蛋白体内诱导抗GnRH免疫应答的能力，进行了下面的接种试验。如上所述制备了含有质粒pCB113和pCB175(分别具有与LKT352连接的4和8个拷贝的GnRH)，和具有与LKT352连接的1个拷贝的GnRH的质粒的E.coli的培养物。配制上面每一种培养物的疫苗，使之在0.2mlEmulsigenPlus中含有5μgGnRH等同物。给3组10个雌性鼠两次相隔23天进行皮下注射并在初次注射后的第23，35和44天收集血样。用标准放射免疫测定方法在最终稀释度1∶100和1∶1000测定抗GnRH的血清抗体效价。如果结合了少于5％的碘化GnRH，认为抗体是不可测的。这样得到的抗体效价概括于表1。这一研究的结果表明，等剂量的以多重串联重复存在的GnRH(4或8个拷贝的GnRH)所产生的抗体比单个拷贝的GnRH显著提高(如结合至碘化天然GnRH的测定)。进一步，上面的结果表明，含有与LKT352连接的4个拷贝GnRH串联重复的融合蛋白代表了最佳免疫原GnRH抗原形式，虽然免疫原性可能受剂量或受试个体种类影响。</tables>*平均应答是那些以超过5％结合I125-GnRH的动物的平均结合。表1实施例7LKT352∷GnRH和LKT111∷GnRH融合体的体内免疫活性和生物学效应为了测试含有多重串联重复的GnRH的融合蛋白(与LKT352或LKT111连接)在体内引发抗GnRH免疫应答的能力和证明体内的生物学效应，进行了下面的接种试验。如上所述制备了含有质粒pCB113和pCB111(分别与LKT352或LKT111连接的4个拷贝的GnRH)的E.coli的培养物。配制上面每个培养物的疫苗；使0.2mlVSA-3佐剂(改良的EmulsigenPlus佐剂)中含有5μgGnRH等当物，也制备了含有0.2ml佐剂的对照免疫苗。给3组5个雄性Swiss小鼠以21天间隔皮下注射两次，在5-6周龄时给予首次注射(0天)。在49天杀死这些受试动物。用标准放射免疫测定方法，以1∶1000血清稀释度通过测定抗GnRH抗体效价测定该GnRH-LKT融合体的免疫活性。以25pg/ml的敏感度通过血清睾丸激素水平的放射免疫测试定量检测该GnRH-LKT融合体的生物学效应，并且称重和组织学检测睾丸组织。这一试验的结果归纳在表2。在试验中，所有用GnRHLKT抗原注射的动物个体具有可容易检测的抗体水平；然而，如应答和效价的均一性表明LKT111∷GnRH融合体(来自质粒pCB111)表现出突出的免疫原性。血清睾丸激素(由睾丸Leydig细胞产生)以波动的方式分泌，因此，在正常动物个体中可以预料血清水平值低并特别易变。在试验中，对照组(接受0.2ml佐剂疫苗注射)具有正常血清睾丸激素水平，而两个处理个体组具有基本上检测不到的血清睾丸激素。另外，在试验中，睾丸组织的组织学估价结果表明Leydig细胞呈现不同程度的衰退，生精子的小管直径减小和被处理个体的精子生成的中断；但是，被处理动物的睾丸重量仍然接近正常-甚至在存在高抗GnRH抗体效价时-虽然在接受LKT111∷4个拷贝GnRH融合体的5个个体中的2个有明显的睾丸退化迹象。因此，这些结果显示与LKT352或LKT111连接的多重拷贝的GnRH组成了强有力的免疫原；另外表明了用本发明的融合蛋白的接种可引发能在体内中和内源GnRH的抗体的产生，并且接受这样的接种的动物个体可伴随有可识别的体内生物学效应的产生。</tables>*在1∶1000血清稀释度时I125-GnRH的％结合表2实施例8在猪个体中LKT∷GnRH融合体的体内免疫活性为了测试猪个体中含有多重串联重复的GnRH的融合蛋白(与LKT352或LKT111连接)引发体内抗GnRH免疫应答的能力，进行了下面的接种试验。如上所述制备了含有质粒pCB113，pCB111，pCB175和pCB114(分别为LKT352∷4个拷贝GnRH，LKT111∷4个拷贝的GnRH，LKT352∷8个拷贝的GnRH，和LKT111∷8个拷贝的GnRH)的大肠杆菌培养物。配制上面每个培养物的疫苗，使之含有50μgGnRH等同物，并以2.0ml体积的溶于VSA-3佐剂中形式给药。在试验的第0天注射和在21天注射4组5个雄性和5个雌性的35天龄(在第0天时)的刚断奶的小猪。在0，21和35天收集血样，用标准放射免疫测定最终稀释度为1∶1000的抗GnRH抗体效价。测定结果概括在表3。在试验中，在免疫接种之前，任何个体都不能测得抗GnRH抗体，而在第35天时大多数个体都容易地测到(处理组4的一个个体死于与处理无关的感染)。这一试验结果表明，含有与LKT352或LKT111载体多肽连接的多重GnRH重复的融合蛋白在猪个体中形成有用的免疫原。根据十肽GnRH(1,200)，LKT111多肽(52,000)和LKT352多肽(100,000)的推测分子量，GnRH在LKT-GnRH抗原融合体中的百分数如下4.9％(LKT352∷4个拷贝的GnRH)；8.5％(LKT111∷4个拷贝的GnRH)；9.3％(LKT352∷8个拷贝的GnRH)；和15.7％(LKT111∷8个拷贝的GnRH)。因此，这样得到的实际结果表明用含有LKT111多肽载体的LKT-GnRH融合体，给个体施用抗原(LKT-GnRH)的整个量可以减半(与用LKT352载体多肽系统的疫苗组合物相比)即可获得相同的抗-GnRH应答。</tables>表3实施例9在重组LKT352和LKT111分子中的T-细胞表位的预测为了预测用于本发明的LKT-GnRH嵌合体的白细胞毒素多肽序列中的潜在的T-细胞表位，如表4描述将对应于LKT分子1-199的氨基酸序列实施Margalit和合作者建议的方法(Margalitetal.，J.Immunol(1987)1382213)。在该方法中，把白细胞毒素多肽序列的氨基酸序列与其它已知的诱导T-细胞反应的序列和确信是T-细胞表位所需要的氨基酸谱型相比。表4描述了比较结果。正如所看到的预测结果，根据Margalitetal(如上所述)建议的原则鉴定了白细胞毒性多肽的几个短序列是潜在的T-细胞表位。具体地说，鉴定9个序列具有(带电/Gly-疏水的-疏水的-极性/Gly)序列(如表4的谱型“1”所指)，并且鉴定了3个序列具有(带电/Gly-疏水的-疏水的-疏水的/Pro-极性/Gly)序列(如表4的谱型“2”所指)。把这些数据与上面实施例7和8的LKT352和LKT111载体系统产生的体内抗GnRH活性结合，可看出，关键的T-细胞表位保留在截短的LKT111分子中，那些表位可能包含在LKT352和LKT111分子的N-末端部分。表4对应于潜在的T-细胞表位的LKT序列图谱显示谱型“1”的LKT氨基酸序列GTID(aa′s27-30)GITG(aa′s66-69)GVIS(aa′s69-72)HVAN(aa′s85-88)KIVE(aa′s93-96)DLAG(aa′s152-155)KVLS(aa′s162-165)DAFE(aa′s171-174)KLVQ(aa′s183-186)GIID(aa′s192-195)显示谱型“2”的LKT氨基酸序列RYLAN(aa′s114-118)KFLLN(aa′s124-128)KAYVD(aa′s167-171)D.工业应用当给脊椎动物寄主给药时，本发明的白细胞毒素-GnRH嵌合体可用作免疫原进行针对内源性GnRH的免疫，从而抑制寄主的生殖功能或生殖能力。尽管本说明书举例说明的特异用途，本文公开的新嵌合分子提示了提供含有一个以上多重或串联重复存在的GnRH肽序列的融合蛋白的方式，其中该GnRH肽序列与分子的白细胞毒素多肽部分(某些情况中，是存在于选定的GnRH序列间的间隔肽序列)提供的免疫原表位融合。本发明构建的该嵌合蛋白提供给融合GnRH肽序列增强的免疫原性，使被接种的脊椎动物寄主增强了对内源GnRH的有效免疫应答；使两种促性腺激素，黄体化激素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成和释放终止，从而使寄主暂时不育。以这种方式，新白细胞毒素-GnRH构建体可用于免疫绝育疫苗，用于替代目前用于驯养和农场动物畜牧业的侵入性绝育方法。本发明融合分子的其它的用途包括群体控制，例如破坏野生啮齿动物群体的再生能力。在这点上，LKT-GnRH融合分子可以用来替代目前使用的群体控制措施如毒害等。本发明的融合产物也可以具有慢和快释放成份的构建体形式给药。以这种方式，可以避免多次接种的需要。另外，由于GnRH的氨基酸序列在种类之间是高度保守的，可以生产一种具有广泛的种类交叉效果的白细胞毒素-GnRH融合疫苗产物。所以，本文公开了含有与选定的GnRH多肽融合的白细胞毒素的各种嵌合蛋白。虽然已经详细描述了本发明的优选实施方案，但仍可以做一些明显的改变而不脱离后附的权利要求所限定的范围。用于实施本发明的菌株的保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301ParklawnDrive，Rockville，Maeyland对下述菌株的生物学纯培养物进行了保藏。所标明的登记号是在成功的存活力测试，付了申请费后登记的。本保藏是在国际公认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其实施细则的规定下进行的。这保证了从保藏日起存活的培养物维持30年并且要求保藏单位提供保藏样品后至少维持5年。在布达佩斯条约的条款下可从ATCC获得这些微生物，该条约保证由美国专利和商标委员会根据35USC§122和委员会的规则(包括37CFR§1.12)决定给予资格的人永久和不受限制地可获得这些培养物。这些保藏仅是为了方便本领域技术人员，并不是承认为了满足35USC§112的要求而进行的保藏。这些质粒的核酸序列以及它们编码的多肽氨基酸序列引入本文中作为参考，并在与本文的描述的存在不一致时为对照。制造、使用、或销售保藏材料均需得到许可，但这样的许可是不会授予的。菌株保藏日期ATCCNo.溶血巴士德氏菌血清型1B1221989年2月1日53863在大肠杆菌W1485中的pAA3521990年3月30日68283在大肠杆菌JM105中的pCB1131995年2月1日69749在大肠杆菌JM105中的pCB1111995年2月1日69748权利要求1.一种含有与多体融合的白细胞毒素多肽的嵌合蛋白，该多体基本上由一个以上的选定的GnRH多肽组成，其中所说的嵌合蛋白的白细胞毒素部分的作用是增强所说的GnRH多体的免疫原性。2.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所说的白细胞毒素多肽缺失了白细胞毒素活性。3.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中所说的白细胞毒素是LKT352。4.根据权利要求2的嵌合蛋白，其中所说的白细胞毒素是LKT111。5.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所说的GnRH多体含有通式为GnRH-X-GnRH的分子，其中X是选自于由肽键，氨基酸间隔基团，白细胞毒素多肽和(GnRH)n组成的组，其中n大于或等于1，另外其中GnRH包括任何GnRH多肽。6.根据权利要求5的嵌合蛋白，其中X包括含有至少一个辅助T-细胞表位的氨基酸间隔基团。7.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所说的嵌合蛋白包括图5描述的氨基酸序列，或与其基本同源和功能相当的氨基酸序列。8.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中所说的嵌合蛋白包括图7描述的氨基酸序列，和与其基本同源和功能相当的氨基酸序列。9.含有根据权利要求1-8中任何一项的嵌合蛋白和药学可接受载体的疫苗组合物。10.一种给受试动物提供选定的GnRH多体的方法，包括给所说的动物施用有效量的根据权利要求9的疫苗组合物。11.编码权利要求1-8中任何一项嵌合蛋白的DNA构建体。12.一种表达盒，包括(a)根据权利要求11的DNA构建体；和(b)指导所说的构建体的转录的控制序列，其中所说的构建体可以在寄主细胞中转录和翻译。13.用权利要求12的表达盒转化的寄主细胞。14.生产重组多肽的方法，包括(a)提供权利要求13的寄主细胞群；和(b)在使所说表达盒编码的多肽表达的条件下培养所说的细胞群。全文摘要本发明公开了新免疫学载体系统,编码它们的DNA,和这些系统的用途。该载体系统包括嵌合蛋白质,该嵌合蛋白质包含一个与选定的GnRH多体融合的白细胞毒素多肽,该多体基本上由至少一个重复GnRH十肽序列组成,或由至少一个对应于选定的GnRH分子的至少一个表位的序列的重复单位组成。在本发明中,选定的GnRH序列可能都相同,或可能对应于GnRH不同的衍生物,类似物,变异体或GnRH的表位,只要GnRH序列能引发免疫应答。白细胞毒素的功能是增强其中融合的GnRH多体的免疫原性。文档编号C07K19/00GK1179181SQ96192680公开日1998年4月15日申请日期1996年1月24日优先权日1996年1月24日发明者安德鲁·A·波特,约翰·G·曼斯申请人:萨斯喀彻温大学