专利名称：环氧琥珀酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的环氧琥珀酸衍生物和用其治疗骨疾病的药物组合物。
背景技术：
在骨组织中，骨吸收和骨生成分别通过破骨细胞和成骨细胞同时进行。骨的结构和数量由其平衡保持。然而，过量的骨吸收将造成骨病，如骨质疏松症，恶性血钙过多症，和佩吉特氏综合征。
由破骨细胞进行的骨吸收(例如，脱钙)过程可分为两步，即矿物质的溶解和骨基质的降解。据认为骨基质的降解是由溶酶体酶的作用进行的。据最新研究所知，在溶酶体酶中，组织蛋白酶L和同功酶是半胱氨酸蛋白酶，起着关键作用〔Kakegawa和Katsunuma，《分子医学》(Molecular Medicine)30(10)，1310-1318(1993)和Tezuka等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.，)269，1106-1109(1994)〕另外，据报道，半胱氨酸蛋白酶抑制剂阻碍骨吸收〔J.M.Delaisse等，《生物化学与生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.，Res.Commun.)，125，441-447(1984)〕。因此，对半胱氨酸蛋白酶如组织蛋白酶L起抑制作用的化合物被认为具有治疗骨疾病如骨质疏松症的作用。
例如，已建议用某些环氧琥珀酸衍生物治疗骨疾病〔日本公开特许公告63-284127和平成2-218610]。然而，关于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的临床研究尚无报道，此项研究最近已开始。
日本专利61-55509公开了环氧琥珀酸衍生物(环氧琥珀酸化合物)作为蛋白酶抑制剂，其中硫醇基参与了其抑制作用。然而，尚未公开在与连接到环氧乙烷环上的N 取代的氨基甲酰基(如二苯基甲基氨基甲酰基和(3-甲基-1-苯基丁基)氨基甲酰基)的氮原子相邻接的碳原子上有一个支链的化合物。
发明概述本发明的目的是提供一种化合物和一种药物组合物，它们可用于预防和治疗骨疾病如骨质疏松症，恶性血钙过多症，和佩吉特氏综合征。
本发明的另一目的是提供一种化合物和一种药物组合物，它们用于治疗伴有组织蛋白酶L活性异常增高的骨关节炎和风湿性关节炎。
本发明的又一目的是提供一种化合物，该化合物可用作药物，治疗组织蛋白酶B和L参与的疾病，如肌肉营养不良和肌肉萎缩病。
本发明者为解决上述问题已认真研究并发现，由下述式(I)代表的其特征在于右端酰胺基上的取代基有支链的环氧琥珀酸衍生物或其盐所具有的抑制骨吸收的活性优于上述日本专利61-55509中所述的环氧琥珀酸衍生物，并适用于治疗和预防骨疾病。本发明是在上述发现的基础上完成的。后面的比较实验中对比化合物X和Y显示了日本专利61-55509中化合物的典型活性。
其中R1代表氢原子、具有1-30个碳原子的烷基，6-40个碳原子的芳香基，或7-40个碳原子的芳烷基；R2和R3各自独立地代表6-40个碳原子的芳基、7-20个碳原子的芳烷基、或含有3-10个碳原子的烷基；X代表-O-或-NR4-；并且R4代表氢原子、1-10个碳原子的烷基、或7-20个碳原子的芳烷基。发明的优选实施方案将下面式(1)的环氧琥珀酸衍生物作进一步描述。
上式中，R1是氢原子、烷基、芳基或芳烷基。优选是氢原子、烷基和芳烷基。烷基、芳基和芳烷基可有取代基(例如，羟基、卤素原子、 1-10个碳原子的烷基、1-10个碳原子的烷氧基，和6-20个碳原子的芳基)。
烷基优选含有1-30个碳原子(如果连接着取代基，包括取代基碳原子数在内的总的碳原子数)，更优选为1-15个碳原子，最优选为1-6个碳原子。烷基可以是链状结构或环状结构。有链状结构的烷基可以有支链形式。
芳基优选含有6-40个碳原子(如连有取代基，包括取代基碳原子数在内的总的碳原子数)。更优选为6-30个碳原子，最优选为6-20个碳原子。芳基实例包括苯基和萘基。
芳烷基优选含有7-40个碳原子(如果连有取代基，包括取代基碳原子数在内的总的碳原子数)，更优选为7-30个碳原子，最优选7-20个碳原子。芳烷基实例包括苄基、苯乙基和二苯甲基。
上式中R2和R3各自独立地是芳基，芳烷基，或含有3-10个碳原子的烷基。烷基，芳基和芳烷基均可带有取代基(例如，羟基，卤素原子，1-10个碳原子的烷基，含有1-10个碳原子的烷氧基，和含有6-20个碳原子的芳基)。
芳基优选含有6～40个碳原子(如果连有取代基，包括取代基碳原子数的总的碳原子数)，更优选为6-30个碳原子，最优选为6-20个碳原子。芳基实例包括苯基和萘基。
烷基含有3-10个碳原子(如果连有取代基，包括取代基碳原子数的总的碳原子数)。烷基更优选含有3-6个碳原子。烷基可以是链状结构或环状结构。有链结构的烷基可以是支链形式。
芳烷基优选含有7-20个碳原子(如果连接取代基，包括取代基碳原子数在内的碳原子的总数)，更优选7-15个碳原子，最优选7-10个碳原子。芳烷基实例包括苄基和苯乙基。
在上式中，X是-O-或-NR4-，R4是氢原子，烷基，或芳烷基，优选是氢原子或烷基，最优选是氢原子。烷基和芳烷基可有如上述的相同取代基。
对于R4，烷基优选含有1-10个碳原子(如果连接取代基，包括取代基碳原子数的碳原子总数)，更优选1-6个碳原子，最优选1-4个碳原子。烷基优选有链结构。有链结构的烷基可以是支链形式。
对于R4，芳烷基优选含有7-20个碳原子(如果连接取代基，包括取代基碳原子数的碳原子总数)，更优选7-15个碳原子，最优选7-10个碳原子。芳烷基的实例包括苄基和苯乙基。
上式中的环氧乙烷环上的两个碳原子都是不对称碳原子。上述式中表示连到环氧乙烷环上的两个羰基是反式构型。因此，本发明的环氧琥珀酸衍生物可以是在下述(T1)形式或(T2)形式的旋光异构体，或它们的混合物
本发明琥珀酸衍生物的实施例示于下列的表1中，其中R1、R2、R3和X具有上式所示的意义。
表1化合物R1X R2R31 H-O- 苯基 苯基2 乙基 -O- 苯基 苯基3 异丁基 -O- 苯基 苯基4 环己基 -O- 苯基 苯基5 苄基 -O- 苯基 苯基6 二苯基甲基 -O- 苯基 苯基7 H-O- 对-氯苯基对-氯苯基8 乙基 -O- 对-甲氧苯基 对-甲氧苯基9 H-O- 异戊基 异戊基10乙基 -O- 异戊基 异戊基11环己基 -O- 异戊基 异戊基12乙基 -NH-苯基 苯基13乙基 -NH-异戊基 异戊基14乙基 -NEt- 苯基 苯基15二苯基甲基 -NH-苯基 苯基16
-NH-异戊基 异戊基17H-O- 异丙基 异丙基18H-O- 苄基 苄基19H-O- 苯基 异丁基20H-O- 苯基 异丙基21乙基 -O- 苯基 异丁基22H-NH-苄基 苄基23H-O- 苯基 苄基本发明的环氧琥珀酸衍生物可以以盐的形式使用，在R1是氢原子和X是-O-的情形，它们与连到环氧乙烷环上的羰基一起可以形成羧基并可与碱形成盐。碱阳离子的实例包括碱金属离子(例如，钠和钾)和碱土金属离子(例如，钙)。
本发明环氧琥珀酸衍生物可以容易地用日本专利61-55509和52-31024所述的相似的合成方法，或用下面所述的实施例1-10的方法或与这些方法相似的方法合成。
现将本发明环氧琥珀酸衍生物的药理学效果描述如下。
本发明环氧琥珀酸衍生物是对硫醇蛋白酶有抑制活性的化合物。硫醇蛋白酶包括组织蛋白酶L和组织蛋白酶B，或需钙蛋白酶。因此，本发明环氧琥珀酸衍生物和其生理上可接受的盐预计对蛋白酶参与的疾病显示出药理学活性。
如在对现有技术的说明中所述，组织蛋白酶L参与的疾病的实例包括骨疾病，如骨质疏松症，恶性血钙过多症，和佩吉特氏综合征。因此，本发明环氧琥珀酸衍生物和其生理上可接受的盐可作为预防和治疗这些骨疾病的药物应用。
据报道组织蛋白L在中性区使构成关节软骨的胶原II型，IX型和XI型降解〔《欧洲生物化学学会联合会通讯》FEBS Lett.，269，189-193(1990)〕。因此，本发明环氧琥珀酸衍生物和其生理上可接受的盐预计可用于治疗伴有组织蛋白酶L活性异常增强的骨关节炎和风湿性关节水(见日本公开特别公告平成5-178757)。
本发明环氧琥珀酸衍生物作为组织蛋白酶B抑制剂也有效果。
更详细地说，除了组织蛋白酶L以外的硫醇蛋白酶(例如组织蛋白酶B)参与的疾病的实例包括肌肉营养不良和肌肉萎缩(其中组织蛋白酶B和需钙蛋白酶参与)、阿耳茨海默氏病(其中需钙蛋白酶参与)，和据认为由神经细胞的脱髓鞘作用造成的疾病，例如，多发性硬化和外周神经系统神经病(其中需钙蛋白酶参与)，白内障(其中需钙蛋白酶参与)，变应性病症(其中硫醇蛋白酶参与)，急性肝炎(其中需钙蛋白酶参与)，乳腺癌、前列腺癌、和前列腺肥大(其中需钙蛋白酶参与)，癌的增生和转移(其中组织蛋白酶B和需钙蛋白酶参与)，血小板聚集(其中需钙蛋白酶参与)(见日本专利暂定公布平成6-239835)。因此，认为本发明环氧琥珀酸衍生物可用于治疗和预防这些疾病。
本发明环氧琥珀酸衍生物和其生理上可接受的盐预计用于预防和治疗上述疾病。特别是它可用于预防和治疗骨疾病例如骨质疏松症，恶性血钙过多症，和佩吉特氏综合征。
本发明环氧琥珀酸衍生物可通过口服或肠道外给药，口服给药的组合物可制成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂或喷雾剂。非肠道给药可通过粘膜，皮肤，血管，或组织进行。粘膜给药可使用眼用溶液，吸入剂，喷雾剂，或栓剂进行。皮肤给药可通过软膏剂进行。用注射剂进行血管和组织给药。
使用常规的赋形剂，崩解剂，粘合剂，润滑剂，染料和稀释剂可制备口服给药的组合物。赋形剂通常是葡萄糖或乳糖。崩解剂可以是淀粉或羧甲基纤维素钙。润滑剂可以是硬脂酸镁或滑石粉。粘合剂可以是羟丙基纤维素，明胶，或聚乙烯醇。
非肠道给药的药物组合物可按常规方法制备。例如，注射剂可用普通的注射用蒸馏水，生理盐水，或林格氏溶液来制备。
本发明环氧琥珀酸衍生物成人的给药剂量注射剂每天为0.01mg～100mg，口服给药每天为0.1-1g。根据病人的年龄、种族，和病情可增加或减少给药量。
实施例1(2S，3S)-3-二苯基甲基氨基甲酰基环氧乙烷-2-羧酸乙酯(2号化合物)向(2S，3S)-3-乙氧甲酰基环氧乙烷-2-羧酸(8.01g，50.0mmol)于乙酸乙酯(120ml)的溶液中，在冰冷却下依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(5.76g，50.0mmol)和N，N′-二环己基碳二亚胺(5.75g，50.0mmol)。将该混合物在5℃搅拌1小时，加入氨基二苯基甲烷(9.17g，50.0mmol)于乙酸乙酯(30ml)的溶液。将混合物在5℃搅拌1小时并于室温下再搅拌1小时。滤出生成的N，N′-二环己脲(DC-Urea)，然后依次用1N盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液，和饱和氯化钠水溶液洗涤滤液，然后用无水硫酸钠干燥。减压下蒸去溶剂，残留物从乙酸乙酯-正己烷中重结晶，得到所需的白色结晶产物(1.25g，产率77％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ1.32(3H，t，J＝7Hz)，3.51(1H，d，J＝2Hz)，3.77(1H，d，J＝2Hz)，4.2-4.3(2H，m)，6.22(1H，d，J＝8Hz)，6.67(1H，d，J＝8Hz)，7.1-7.4(10H，m).实施例2(2S，3S)-3-二苯基甲基氨基甲酰基环氧乙烷-2-羧酸(1号化合物)将得自实施例1的(2S，3S)-3-二苯基甲基氨基甲酰基环氧乙烷-2-羧酸乙酯(5.50g，16.9mmol)溶于乙醇(300ml)中。向该溶液中加入0.5N的氢氧化钠乙醇溶液(40.4ml，20.2mmol)，室温下将该混合物搅拌3小时。减压下蒸去溶剂，加入水(300ml)后用两份100ml的乙醚洗涤。用2N的盐酸将水相的pH调至1-2，然后用3份100ml的乙酸乙酯萃取。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤后加无水硫酸钠干燥。减压下蒸去溶剂得到所需的白色粉状结晶产物(4.76g，产率95％)。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ3.57(1H，d，J＝2Hz)，3.71(1H，d，J＝2Hz)，6.23(1H，s)，7.2-7.4(10H，m).实施例3(2S，3S)-3-二苯基甲基氨基甲酰基环氧乙烷-2-羧酸钠(1号化合物的钠盐)将得自实施例2的化合物(100mg，0.336mol)溶于乙酸乙酯(10ml)。向所得溶液中加入碳酸氢钠(28.2mg，0.336mmol)的水(10ml)溶液。将混合物猛烈振荡。分出水相，然后减压下浓缩至干得到所需的白色粉状产物(106mg，产率99％)。1H-NMR(400MHz，D2O)δ3.47(1H，d，J＝2Hz)，3.63(1H，d，J＝2Hz)，6.15(1H，s)，7.3-7.5(10H，m).IR(KBr)cm-13412，3219，3064，3030，1670，1632，1552，1495，1454，1448，1398，1317，1285，1248，1093，1086，1051，1030，1007，960，899，862，783，758，742，698，677，642，602，571，482.实施例4(2S，3S)-N-乙基-3-二苯基甲基氨基甲酰基环氧乙烷-2-甲酰胺(12号化合物)在冰冷却下向(2S，3S)-3-二苯基甲基氨基甲酰基环氧乙烷-2-羧酸(1.80g，6.05mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(696mg，6.05mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入N，N′-二环己基碳二亚胺(1.25g，6.05mmol)的二氯甲烷(7ml)溶液。室温下将混合物搅拌30分钟。然后在冰冷却下向该混合物中加入盐酸乙胺(493mg，6.05mmol)和三乙胺(0.84ml，6.05mmol)的二氯甲烷(7ml)溶液。将所得混合物在5℃搅拌过夜。减压下蒸去溶剂，加入乙酸乙酯(10ml)后滤出N，N′-二环己脲(DC-Urea)。溶液依次用水，0.5N的盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，和饱和氯化钠水溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥。减压下蒸去溶剂，残留物通过中压硅胶柱层析(氯仿/甲醇＝1/0-50/1)纯化，得到所需白色粉状结晶产物(928mg，产率47％)。
m.p.190.0-195.0℃(分解点)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ1.14(3H，t)，3.30(2H，dq)，3.51(1H，d)，3.55(1H，d)，5.95(1H，br.s)，6.22(1H，d，J＝8Hz)，6.59(1H，br.d，J＝8Hz)，7.1-7.4(10H，m).IR(KBr)cm-13290，3088，3064，3030，2980，2933，2773，1653，1551，1495，1452，1446，1371，1354，1279，1240，1153，1092，1053，1030，999，960，891，864，862，847， 808，754，696，648，598，571，536，478.实施例5(2S，3S)-3-[[4-甲基-1-(3-甲基丁基)戊基]-氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸乙酯(10号化合物)将(2S，3S)-3-乙氧羰基环氧乙烷-2-羧酸钾(1.98g，10.0mmol)悬浮于苯(40ml)中，常压下蒸去苯(13ml)以便除去水。将剩余溶液冷至室温。将溶液搅拌，并在搅拌下滴加亚硫酰氯(0.88ml，12.0mmol)。将该混合物加热回流2.5小时，得到起始物的酰基氯溶液。
将4-甲基-1-(3-甲基丁基)戊胺(2.06g，12.0mmol)和三乙胺(1.67ml，12.0mmol)溶于无水苯(10ml)中。在冰冷却下向该溶液中滴加上述的酰基氯溶液，然后将混合物室温搅拌3小时。向混合物中加水(3ml)，分出有机相，依次用10％的柠檬酸水溶液，水，饱和碳酸氢钠水溶液，水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，并用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂，残余物经中压硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯＝5/1)进行纯化得到所需要的黄色油状化合物(1.40g，产率45％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.8-1.0(12H，m)，1.1-1.4(6H，m)，1.32(3H，t，J＝7Hz)，1.4-1.6(4H，m)，3.42(1H，d，J＝2Hz)，3.68(1H，d，J＝2Hz)，3.83(1H，m)，4.2-4.3(2H，m)，5.78(1H，d，J＝9Hz).实施例6(2S，3S)-3-[[4-甲基-1-(3-甲基丁基)戊基]氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸(9号化合物)用得自实施例5的化合物(1.40g，4.47mmol)和0.5N氢氧化钾乙醇溶液(10.7ml，5.35mmol)重复进行实施例2的反应和处理方法，得到所需无定形淡黄色产物(1.15g，产率90％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.8-0.9(12H，m)，1.0-1.4(6H，m)，1.4-1.6(4H，m)，3.46(1H，d，J＝2Hz)，3.78(1H，d，J＝2Hz)，3.84(1H，m)，6.12(1H，d，J＝9Hz).实施例7(2S，3S)-3-[[4-甲基-1-(3-甲基丁基)戊基]-氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠(9号化合物的钠盐)用得自实施例6的化合物(111mg，0.389mmol)和碳酸氢钠(32.7mg，0389mmol)重复实施例3的反应和处理方法，得到所需粉末状浅黄色产物(产率75％)。1H-NMR(400MHz，D2O)δ0.8-1.0(12H，m)，1.1-1.3(4H，m)，1.4-1.7(6H，m)，3.42(1H，s)，3.51(1H，s)，3.75(1H，m).IR(KBr)cm-13417，3253，3093，2954，2870，1660，1560，1468，1435，1398，1367，1317，1255，1223，1171，962，895，852，795，744，712，679， 482.实施例8(2R，3R)-3-[(3-甲基-1-苯基丁基)氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸乙酯(21号化合物)
用(2R，3R)-3-乙氧羰基环氧乙烷-2-羧酸钾(3.97g，20.0mmol)，亚硫酰氯(2.86g，24.0mmol)，3-甲基-1-苯基丁基胺(4.25g，26.0mmol)，和三乙胺(2.63g，26.0mmol)，重复实施例5的反应和处理方法，得到所需粘性无色油状化合物(5.86g，产率96％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.92(1.5H，d，J＝7Hz)，0.93(1.5H，d，J＝7Hz)，0.94(1.5H，d，J＝7Hz)，0.95(1.5H，d，J＝7Hz)，1.25(1.5H，t，J＝7Hz)，1.31(1.5H，t，J＝7Hz)，1.4-1.7(3H，m)，3.33(0.5H，d，J＝2Hz)，3.47(0.5H，d，J＝2Hz)，3.65(0.5H，d，J＝2Hz)，3.68(0.5H，d，J＝2Hz)，4.2-4.3(2H，m)，5.02(1H，m)，6.21(1H，br，d，J＝8Hz)，7.2-7.4(5H，m).实施例9(2R，3R)-3-[(3-甲基-1-苯基丁基)氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸(19号化合物)用得自实施例8的化合物(2.13g，6.98mmol)和0.5N的氢氧化钾乙醇溶液(18ml，9.0mmol)重复实施例2的反应和处理方法，得到所需白色粘性产物(1.78g，产率92％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.8-1.0(6H，m)，1.4-1.8(3H，m)，3.34(0.5H，d，J＝2Hz)，3.47(0.5H，d，J＝7Hz)，3.67(0.5H，d，J＝2Hz)，3.71(0.5H，d，J＝2Hz)，5.00(1H，dt，J＝8，8Hz)，6.63(0.5H，d，J＝8，8Hz)，6.66(0.5H，d，J＝8Hz)，7.1-7.4(5H，m)，8.19(1H，brs).实施例10(2R，3R)-3-[(3-甲基-1-苯基丁基)氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠(19号化合物的钠盐)用得自实施例9的化合物(1.70g，6.18mmol)和碳酸氢钠(515mg，6.13mmol)重复实施例3的反应和处理方法，得到浅黄色粉末状产物(1.76g，产率96％)。1H-NNR(400MHz，D2O)δ0.9-1.0(6H，m)，1.5-1.8 (3H，m)，3.41(1H，m)，3.55(1H，m)，4.93(1H，m)，7.3-7.5(5H，m).实施例11(2S，3S)-3-[(α-苄基苯乙基)氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸乙酯用(2S，3S)-3-乙氧羰基环氧乙烷-2-羧酸(1.01g，6.31mmol)，N-琥珀酰亚胺(726mg，6.31mmol)，N，N′-二环己基碳二亚胺(1.30g，6.31mmol)，和α-苄基苯乙胺(1.43g，6.31mmol)重复实施例1的反应和处理方法，产物经硅胶柱层析纯化(氯仿/甲醇＝50/1)，得到所需浅黄色油状化合物(2.22g，产率定量地)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ1.30(3H，t，J＝7Hz)，2.65(1H，dd，J＝9，14Hz)，2.86(2H，d，J＝7Hz)，2.87(1H，d，J＝2Hz)，2.92(1H，dd，J＝6，14Hz)，3.51(1H，d，J＝2Hz)，4.2-4.3(2H，m)，4.42(1H，m)，5.78(1H，br.d，J＝9Hz)，7.1-7.3(10H，m).实施例12(2S，3S)-3-[(α-苄基苯乙基)氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸用得自实施例11的化合物(2.22g，6.28mmol)和5N的氢氧化钾乙醇溶液(15.1ml，7.55mmol)重复实施例2的反应和处理方法，得到所要的无定形白色产物(1.78g，产率87％)。1H-NMR(400MHz，D2O)δ2.6-2.8(2H，m)，2.89(1H，s)，3.0-3.1(2H，m)，3.22(1H，s)，4.33(1H，m)，7.2-7.4(10H，m).实施例13(2S，3S)-3-[(α-苄基苯乙基)氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羧酸钠用得自实施例12的化合物(1.78g，5.47mmol)和碳酸氢钠(460mg，5.47mmol)重复实施例3的反应和处理方法，得到所需的白色粉状产物(1.77g，产率93％)。1H-NMR(400MHz，D2O)δ2.7-2.8(2H，m)，2.90(1H，d，J＝2Hz)，3.0-3.1(2H，m)，3.23(1H，d，J＝2Hz)，4.34(1H，m)，7.2-7.4(10H，m).IR(KBr)cm-13398， 3246， 3089，3026，2956，2927，2860，1668，1626，1566，1497，1454，1396，1311，1259，1215，1119，1084，1028，982，957，897，864，847，798，746，698，677，607，519，492.实施例14骨吸收抑制活性在无菌条件下，从ICR鼠(6-7天大的)取下颅盖。除掉结缔组织后将颅盖骨沿着中线分成两部分。在培养基(含有5％灭活的胎牛血浆的改良BGjb培养基)中，按每对骨1ml的量在5％CO2和37℃条件下进行预培养24小时。预培养完成后，将每一块骨放进含有不同浓度试验化合物的0.5ml同种培养基中并在3×10-7M的甲旁腺素(PTH)存在下培养72小时。对照试验在没有试验化合物和PTH下用相同的方法进行培养。
培养完成后，释放在培养72小时的培养基上清液中的钙量及骨中所含的钙量(溶解于1ml的6N的盐酸中)通过邻甲酚酞氨酸配位剂(OCPC)方法进行测定。
按下等式计算钙的释放率(％)释放率(％)＝〔释放在培养基中钙的量〕/〔释放在培养基中钙的量+骨中钙的量〕×100按下等式计算试验化合物对骨吸收的抑制率(％)抑制率(％)＝〔1-(在PTH和试验化合物存在下的释放率-对照的释放率)/(PTH存在的释放率-对照释放率)〕×100其结果列于下面表2中。实施例15组织蛋白酶L抑制活性(1)鼠肝溶酶体成分的制备由驱血法将雄性Wistar种鼠处死并通过门静脉灌入冰冷却的生理盐水来进行循环。然后将它的肝脏取出。此后，在4℃下进行以下步骤。
用剪子将肝脏剪碎。加入体积多达9倍的0.25M蔗糖水溶液后将5g的碎肝放入波特型(Potter type)聚四氟乙烯均化器中均化。将均化过的混合物在800G下离心10分钟。所得上清液在12000G下进一步离心20分钟。将沉淀物在25ml 0.2M蔗糖水溶液中均化，然后在12000G下离心20分钟。所得沉淀物加入100ml 0.25M的蔗糖水溶液后再均化。这样，便得到了溶酶体成分。
将溶酶体成分用含有0.33％的Triton X-100的0.25M蔗糖水溶液稀释以便用于组织蛋白L的活性测定。
(2)组织蛋白酶L活性的测定向含有340mM的醋酸钠，60mM醋酸，4mM EDTA和8mM的二硫苏糖醇的0.25ml溶液(pH 5.5)中加入0.1ml溶酶体成分，5μL试验化合物溶液和0.545ml蒸馏水。将该混合物于30℃预温育15分钟。此后，加入0.1ml 50μM的苄氧羰基-L-苯丙氨酰基-L-精氨酸-4-甲基香豆基-7-酰胺(Z-Phe-Arg-MCA)的溶液，并开始反应。该反应在30℃进行20分钟，然后通过加入含有100mM-氯醋酸钠，30mM醋酸钠和70mM醋酸的1ml水溶液(pH4.3)将反应终止。对最终得到的溶液进行荧光强度测定(激发波长380nm，发射波长460nm)。
Z-Phe-Arg-MCA也被包含在溶酶体成分中的组织蛋白酶B降解。因此，为使组织蛋白酶B的活性完全受到抑制，在10-7M的已知的组织蛋白酶B专属抑制剂CA-074存在下进行测量〔Murata，等.，《欧洲生物化学学会联合会通讯》(FEBS Lett)280，307-310(1991)〕。
下列表2中给出了实施例14和15的结果。
表2试验化合物骨吸收抑制作用组织蛋白L(试验化合物浓度)抑制作用10-6M 10-5M 10-4M IC50(M)实施例3 90 82 95 2.4×10-7实施例7 63 87 82 1.9×10-8对照X 25 40 66 7.8×10-8对照Y 21 38 44 3.5×10-7
正如上述结果所显示的那样，本发明环氧琥珀酸衍生物所显示的骨吸收抑制活性优于比较化合物X和Y(在日本专利61-55509，14页，实施例61和62中说明)。实施例16组织蛋白酶B抑制活性向含有352mM KH2PO4，48mM Na2HPO4，5.32mM EDTA2Na和10mM L-半胱氨酸的0.25ml溶液(pH6.0)中加入0.1ml的溶酶体成分，5μL试验化合物溶液，和0.545ml蒸馏水。将混合物于30℃预温育15分钟。此后，通过加入0.1ml的50μM的苄氧羰基-L-精氨酸-L-精氨酸-4-甲基香豆基-7-酰胺(Z-Arg-Arg-MCA，底物)使反应开始。该反应在30℃进行20分钟，然后加入含有100mM一氯醋酸钠，30mM醋酸钠和70mM醋酸的1ml水溶液(pH4.3)使反应终止。对最终得到的溶液进行荧光强度的测定(激发波长380nm，发射波长460nm)。将结果列于下面表3中。
表 3试验化合物 组织蛋白B抑制作用(IC50)实施例3 2.3×10-7实施例7 3.1×10-7实施例132.0×10-7上述结果表明，本发明环氧琥珀酸衍生物除对组织蛋白酶L有抑制作用外，对组织蛋白酶B也有抑制作用。
权利要求
1.具有下式的环氧琥珀酸衍生物及其盐
其中R1代表氢原子、具有1-30个碳原子的烷基，6-40个碳原子的芳香基，或7-40个碳原子的芳烷基；R2和R3各自独立地代表6-40个碳原子的芳基、7-20个碳原子的芳烷基、或含有3-10个碳原子的烷基；X代表-O-或-NR4-；并且R4代表氢原子、含1-10个碳原子的烷基、或7-20个碳原子的芳烷基。
2.用于治疗骨疾病的药物组合物，其中含有下式的环氧琥珀酸衍生物及其盐
其中R1代表氢原子、有1-30个碳原子的烷基，6-40个碳原子的芳香基，或有7-40个碳原子的芳烷基；R2和R3各自独立地代表6-40个碳原子的芳基、含有7-20个碳原子的芳烷基，或含有3-10个碳原子的烷基；X代表-O-或-NR4-；并且R4代表氢原子、含有1-10个碳原子的烷基、或7-20个碳原子的芳烷基。
全文摘要
具有下式的环氧琥珀酸衍生物:[其中R
文档编号C07D303/48GK1185151SQ9619405
公开日1998年6月17日 申请日期1996年4月1日 优先权日1995年3月31日
发明者野村丰, 高桥俊弘, 原薰, 吉野康, 真崎光夫 申请人:日本化学医药株式会社