具有更长半衰期的变异多肽的制作方法

专利名称：：具有更长半衰期的变异多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及被突变以含有补救受体结合表位的多肽。更具体地，本发明涉及这样的多肽，它通过肾脏而被清除，并具有来自IgG分子Fc区的表位，从而有更长的循环半衰期。相关文献的描述1964年提出，与血管内间隙快速相平衡地存在着特异性受体，它们保护IgG分子不被降解。Brambell等人，Nature，2031352-2355(1964)。还参见Brambell，TheLancet，1087-1093(1965)。已表明，肾脏是免疫球蛋白片段分解代谢的主要场所，负责约90％的内源分解代谢。Wochner等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，126207(1967)。受体的存在暗示，Ig分子具有必须与这种受体结合的特异性序列或构象决定簇。因为蛋白酶解所产生的IgG的Fc区具有与完整IgG分子一样的体内半衰期而且Fab片段被快速地降解(Spiegelberg和Wiegle，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，121323-338；Waldmann和Ghetie，“免疫球蛋白的分解代谢”(＂CatabolismofImmunoglobulins＂)，ProgressinImmunol.，11187-1191[AcademicPress，NewYork1971]；Spiegelberg，AdvancesinImmunology，Vol.19，F.J.Dixon和H.G.Kinkel，eds.[AcademicPress，NewYork1974]，pp.259-294；并总结于Zuckier等人，Semin.Nucl.Med，19166-186)，所以据信小鼠IgG2b的相关序列位于CH2或CH3结构域，而且缺失一个或另一个结构域会导致快速降解。事实上，用胰蛋白酶消化Fc片段而生产的人IgG的CH2结构域片段，与Fc片段或IgG分子一样始终存在于兔的循环中；与之相反，用胰蛋白酶消化Fc片段也生产的人IgG的CH3结构域片段(pFc′)被快速清除，这表明人IgG的分解代谢位点在CH2结构域中。Ellerson等人，J.Immunol.，116510(1976)；Yasmeen等人，J.Immunol.，116518(1976)。其他研究已表明，CH3结构域的序列，在确定IgG2bT和IgG2bh抗体在小鼠中的不同血管内半衰期方面至关重要。Pollock等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，202021-2027(1990)。不与高亲和性Fc受体FcR1或C1q结合的IgG变异体的分解代谢率，不同于亲代野生型抗体的清除速率，这表明分解代谢位点不同于FcR1或C1q结合中所涉及的位点。Wawrzynczak等人，Molec.Immunol.，29221(1992)。而且，从IgG分子或Fc片段上去除碳水化合物残基对体内半衰期没有影响或影响很小，影响的程度取决于IgG分子的同种型。(Nose和Wigzell，美国科学院院报，806632(1983)；Tao和Morrison，免疫学杂志(J.Immunol.)，1432595(1989)；Wawrzynczak等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)，29213(1992))。已发现，葡萄球菌A蛋白-IgG复合物与未复合的IgG分子相比，能更快地从血清中清除掉。Dima等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，13605(1983)。为了确定靠近Fc-SpA界面处的残基是否与IgG清除有关，Kim等人(欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，24542-548(1994))进行了定点诱变，以改变衍生自鼠免疫球蛋白G1分子的重组Fc-铰链片段的氨基酸残基，并确定这些突变对Fc-铰链片段的药物动力学方面的影响。作者表明，IgG1分子的控制分解代谢速率的位点(分解代谢位点)位于CH2-CH3结构域界面，而且与葡萄球菌A蛋白结合位点是重迭的。还请参见1993年11月11日出版的WO93/22332。在Zuckier等人癌症(Cancer)，73794-799(1994)中还研究了集中分解代谢现象。Masson，J.Autoimmunity，6683-689(1993)中也论述了IgG分解代谢。WO94/04689公开了一种具有细胞毒结构域、配体结合结构域和连接这两个结构域的肽的蛋白质，它含有IgG恒定区结构域，其有在哺乳动物血清中的半衰期增加的特性。人Fc片段及其与金黄色葡萄球菌A蛋白的片段B所形成的复合体的立体图，由Deisenhofer提供(生物化学(Biochemistry)，202364(1981))。已表明，当有效分子大小超过70kDa(肾小球过滤截断大小)时，清除被大大降低。Knauf等人，＂用水溶性聚合物化学修饰的重白细胞组介素-2在在鼠中的全身清除与有效分子大小的关系(RelationshipofEffectiveMolecularSizetoSystemicClearanceinRatsofRecombinantInterleukin-2ChemicallyModifiedwithWater-solublePolymers)＂J.Biochem.，26315064-15070(1988)。发明概述因此，在一个例子中，本发明提供了一种感兴趣多肽的多肽变异体，该感兴趣的多肽是从肾脏被清除掉的而且不含IgG的Fc区，该变异体含有IgG的Fc区的补救受体结合表位，而且该变异体具有比感兴趣多肽更长的体内半衰期。在另一方面，本发明提供了一种编码多肽变异体的核酸、含有该核酸的可复制载体、含有核酸的宿主细胞和产生多肽变异体的方法，该方法包括在培养基中培养宿主细胞和从宿主细胞培养物中回收多肽变异体。核酸分子可以是未标记的或用可检测分子标记的。另一方面，本发明提供了一种不是Fc的多肽，该多肽含有一个或多个下列序列(5′至3′)HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，而且该多肽还含有序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。在另一方面，本发明提供了一种制备多肽变异体的方法，它包括对从肾脏被清除的而且不含IgG的Fc区的感兴趣多肽进行改变，从而使其含有IgGFc区的补救受体结合表位，而且体内半衰期更长。在另一例子中，本发明提供了一种制备具有更长体内半衰期的多肽变异体的方法，它包括(1)鉴别出IgG分子Fc区上的补救受体结合表位的序列和构象；(2)改变从肾脏被清除的而且不含IgG的Fc区的感兴趣多肽，使其含有所鉴别的结合表位的序列和构象；(3)测试步骤(2)中改变的多肽是否有比感兴趣多肽更长的体内半衰期；和(4)如果该多肽没有更长的体内半衰期，进一步改变感兴趣多肽的序列以包含所鉴别的结合表位的序列和构象，并测试是否有更长的体内半衰期，直到获得更长的体内半衰期。在另一方面，本发明提供了一种测试LFA-1-介导的疾病的方法，它包括给需要这种治疗的哺乳动物尤其是病人，施用有效量的上述变异体，其中该多肽是Fab、(Fab′)2、二体、Fv片段、单链Fv片段或受体，并且该多肽作为LFA-1拮抗剂。更佳地，该变异体是具有此处所述更长血清半衰期的抗-LFA-1的Fab或(Fab′)2(如抗-CD18的Fab或(Fab′)2)。在另一例子中，本发明提供了一种体外或体内检测CD11a或CD18的方法，它包括将此处的抗CD11a或CD18抗体片段变异体与怀疑含有CD11a或CD18样品(尤其是血清样品)接触，然后检测是否发生结合。Fc区被置于(移植于)不会改变其构象从而不会丧失其生物活性的、感兴趣多肽的某一区域，而且这种放置不干扰多肽与配体或抗原结合的能力，从而维持多肽的生物活性。附图简述图1A和1B显示了在一次静脉内给药2mg/kg之后，5种Fab或F(ab′)2构建物在小鼠中的血清药物动力学情况。在图1A中，Fabv1B变异体用实心方块表示，Fab对照用实心菱形表示，Fabv2变异体用实心三角形表示，Fabv2变异体用实心圆圈表示，而双-二硫化合物F(ab′)2用空心圆圈表示。在图1B中，Fab对照用实心三角形表示，Fabv2变异体用空心圆圈表示；Fabv1变异体用空心方块表示；Fabv1B变异体用实心圆圈表示，而双-二硫化合物F(ab′)2用实心方块表示。这些分子在本文的表格中有更详细的描述。图2描述了下列区域的共有氨基酸序列相关部分与衍生自抗-CD18抗体(SEQIDNO10)的Fabv1b变异体进行序列对比情况(描述于实施例中)人IgG1CH1结构域(SEQIDNO4)、人IgG2CH1结构域(SEQIDNO5)、人IgG3CH1结构域(SEQIDNO6)、人IgG4CH1结构域(SEQIDNO7)、人κCL结构域(SEQIDNO8)、和人λCL结构域(SEQIDNO9)。在该图中，在Fabv1b序列(即SEQIDNO3和1)中与本发明有关和最重要的氨基酸残基和/或位置，分别用下划线和星号表示。优选实施例的详细描述定义如本文所用，“感兴趣多肽”指具有生物活性、从肾脏被清除而且不含有IgG的Fc区的多肽。如抗体
技术领域：
的技术人员所熟知的那样，“IgG的Fc区”指同种型IgG免疫球蛋白的Fc部分。这种多肽的例子是肽和蛋白质，不论其来源于真核生物如酵母、鸟类、植物、昆虫或哺乳动物，还是来自细菌如大肠杆菌。感兴趣多肽可以是从天然来源中分离出的，或者用人工合成或重组方法制备而得。在一个优选例子中，感兴趣多肽含有Ig结构域或Ig样结构域，如抗原结合结构域。从肾脏中清除感兴趣多肽，至少部分取决于多肽的分子量。分子量过大的多肽不会被哺乳动物的肾脏清除。一种确定感兴趣多肽(或变异体)是否在肾脏中被清除的测试方法是临床研究，其中用可检测的标记物标记感兴趣多肽或变异体，然后用与实际处理相同的处理方案，将其施用于待处理的相同类型的哺乳动物。随后，采集哺乳动物的临床尿样，加以分析以确定是否可在其中检测到标记物。如果检测到标记物，则感兴趣多肽或变异体已被肾脏清除。原则上，被肾脏清除的多肽的分子量在约5,000-10,000道尔顿，但是分子量稍大或稍小的分子，如果它们能通过所述的肾清除测试，那么也符合本发明的标准。如果感兴趣多肽有由多肽(不论其处于天然或变性构象)或其片段直接或间接造成的体内效应子或抗原功能或活性，那么它就是有生物活性的。效应子功能包括受体结合以及任何的载体结合活性、感兴趣多肽的促效或拮抗作用，尤其是传导增殖信号(包括复制)、DNA调控功能、各种生长因子生的物活性的调控、受体激活、灭活、正调控或负调控、细胞生长或分化等。生物活性拥有占据能够与抗体交叉反应的表位或抗原位点，其中该抗体是针对感兴趣多肽或其哺乳动物等价物而产生的。感兴趣的哺乳动物多肽包括诸如例如肾素(renin)之类的分子，生长激素如人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链，胰岛素原；血小板生成素；促卵泡激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和vonWillebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心钠素；肺表面活性剂(fungsurfactant)；纤溶酶原激活物，如尿激酶或者人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；α-和β-肿瘤坏死因子；脑啡肽酶；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏(Muellerian)抑制物；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin)；鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3，-4，-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神经生长因子如NGF-β；心脏营养因子(cardiotrophin)(心脏肥大因子)如心脏营养因子-1(CT-1)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；上皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IgF-I和IgF-II)；脱(1-3)-IgF-I(脑IgF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子(osteoinductivefactors)；免疫毒素；骨形态形成蛋白(BMP)；干扰素如α-，β-和γ-干扰素；集落刺激因子(CFS)，如M-CFS、GM-CFS和G-CFS；白细胞介素(IL)如IL-1至IL-10；没有天然IgG的Fc区的抗-HER-2抗体；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；没有天然IgG的Fc区的抗体；以及上述所列多肽的片段。优选的感兴趣多肽是哺乳动物多肽。这种哺乳动物多肽的例子包括抗体片段如没有IgGFc区的Fv、Fab、(Fab)2和抗-HER-2片段、t-PA、gp120、DNA酶、IGF-1、IGF-II、脑IGF-I、生长激素、松弛素链、生长激素释放因子、胰岛素链或胰岛素原、尿激酶、免疫毒素、神经营养因子、和抗原。更佳地，多肽是Fab、(Fab)2、二体(diabody)、Fv片段、单链Fv片段、或受体。进一步优选地，多肽是抗-IgE、抗-HER2、或抗-CD18Fab或(Fab′)2，而且最佳地是人的或人源化的。如本文所用，“多肽变异体”指感兴趣多肽的氨基酸序列变异体，包括有一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失的变异体。这种变异体有如上所述的生物活性，而且必须与感兴趣多肽有小于100％的序列相同性。在一个优选例子中，有生物活性的多肽变异体，其氨基酸序列与感兴趣多肽有至少70％氨基酸序列相同性，较佳地至少75％，更佳地至少80％，再好至少85％，还要好为至少90％，最好为至少95％。“体内半衰期”指感兴趣多肽或多肽变异体在给定哺乳动物的血液中循环的半衰期。如本文所用，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)Fc区的表位，它负责增加IgG分子的体内血清半衰期。作为例子，图2用下划线显示了代表性表位，用星号显示了重要的残基。IgG1、IgG2和IgG4同种型被优选用于确定补救受体结合表位。“聚合酶链反应”或“PCR”指按1987年7月28日授权的美国专利No.4,683,195中所描述的那样，对少量的一种特定片段的核酸，即RNA和/或DNA进行扩增的方法或技术。一般，需要有关于感兴趣区域末端或之外的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物与待扩增模板的相反链的序列可以相同或相似。两个引物的5′端核苷酸可与扩增物质的末端相符合。PCR可用来扩增特异性RNA序列、来自总基因组DNA的特异性DNA序列以及从细胞总RNA、噬菌体或质粒序列等转录而得的cDNA。一般可参见Mullis等人，ColdSpringHorborSymp.Quant.Biol.，51263(1987)；Erlich编辑，PCRTechnology(StocktonPress，NY，1989)。如本文所用，PCR被认为是用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应方法的一种(但不是唯一一种)例子，它包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶来扩增或产生特定片段的核酸。“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体表现出对特异性抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和其他缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一种类的多肽是，例如，由淋巴系统低水平地产生的以及由骨髓瘤较高水平地产生的。“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”一般是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，它由2条相同的轻链(L)和2条相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键而连于重链，而在不同的免疫球蛋白同种型的重链中，二硫键的数目是不同的。每一重链和轻链也有有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一端有可变区(VH)，然后是多个恒定区。每条轻链在一端有可变区(VL)，在另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对应，而轻链可变区与重链的可变区相对应。据信，有特定的氨基酸残基在轻链可变区和重链可变区之间形成界面(Clothia等人J.Mol.Biol.186651-663；Novotny和Haber，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，824592-4596)。术语“可变的”指这样的事实，即可变区的某些部分在抗体之间有很大的序列差异，而且该部分被用于每种具体抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，该可变性并不分布于整个抗体的可变区。它集中地存在于轻链和重链可变区的3个被称为互补决定区(CDR)或高变区的片段中。可变区的较高度保守区域被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变区都含有4种FR区，大多采用β-折叠构型，它们被3个CDR(它们形成环状连接，而在某些情况下成为β-折叠结构的一部分)所连接。每条链中的CDR被FR区紧密地维系在一起，并且与来自其他链的CDR一起对形成抗体的抗原结合位点作出贡献(参见Kabat等人，同上)。恒定区在抗体结合于抗原过程中并不直接相关，但是它们表现出各种不同的效应子功能，如参与抗体的抗体依赖性细胞毒。用木瓜蛋白酶消化抗体会产生2个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每个片段有一个抗原结合位点；以及一残余的“Fc”片段，其名称反映了它能方便地结晶。用胃蛋白酶处理会产生一个F(ab′)2片段，它有2个抗原结合位点，而且还能与抗原交联。“Fv”是最小的抗体片段，它含有完整的抗原识别位点和抗原结合位点。该区域由紧密地、非共价缔合的一条重链和一条轻链可变区的二聚体所构成。它处于这样的构型，其中每个可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体的表面上界定出一个抗原结合位点。总之，这6个CDR将抗原结合特异性赋予抗体。然而，甚至单个可变区(或仅含有3个对抗原特异的CDR的半Fv)也有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性比完整的结合位点要低。Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。通过在重链CH1结构域的羧基端添加一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，可使Fab片段不同于Fab片段。Fab′-SH是此处给恒定区的半胱氨酸残基具有一个游离疏基的Fab′的名称。F(ab′)2抗体片段最初是以Fab′片段对形式产生的，它们之间有绞链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联物也是已知的。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单多肽链形式存在。一般，Fv多肽还含有VH和VL结构域之间的多肽接头，它使sFV可形成抗原结合所需的结构。对于sFv的总结，请参见Pluckthun，A.，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，vol113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)。来自任何脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据恒定区氨基酸序列，可以被归为2种截然不同类型中的一种，称为κ和λ。根据它们重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同的类别。有5中主要的免疫球蛋白类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中某些还可被进一步划分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。术语“抗体”被广义地使用，具体地它包括单克隆抗体(包括促效和拮抗抗体)、具有多表位特异性的抗体复合物、双特异性抗体、二体、和单链分子，以及抗体片段(如Fab、F(ab’)2和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性。如本文所用，术语“单克隆抗体”指从一群基本均质的抗体中获得的抗体，即构成该群体的各抗体是相同的，除了可能存在少量天然发生的突变形式。单克隆抗体是高特异性的，它针对单一抗原位点。此外，与常规的(多克隆)抗体制剂一般含有针对不同决定簇(表位)的不同抗体相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了特异性，单克隆抗体的优点是可由杂交瘤培养法合成，不会被其它免疫球蛋白所污染。修饰词“单克隆”表示从基本均质的抗体群中获得的抗体性质，不应理解为需要用某种具体方法所产生。例如，用于本发明的单克隆抗体可以用Kohler和Milstein，自然，256495(1975)首先描述的杂交瘤方法产生，也可以重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567[Cabilly等人])产生。“单克隆抗体”还可从噬菌体抗体文库中，用例如Clackson等人，自然，352624-628(1991)和Marks等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222581-597(1991)所述的技术分离出。此处的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分，与衍生自一特定物种的或属于一特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列是相同的或同源的；而链的其余部分与衍生自另一物种的或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这些抗体片段中的相应序列是相同的或同源的，从而使其表现出所需的生物活性(Cabilly等人，同上；Morrison等人，美国科学院院报，816851-6855)。“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是含有来自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合的亚序列)。对于绝大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)中的残基被来自非人种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的，具有所需特异性、亲和性和容量的CDR的残基所置换。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所置换。此外，人源化抗体可含有既不在受体抗体中也不在引入的CDR或框架序列中的残基。进行这些修饰是为了进一步地改善和优化抗体的性能。一般，人源化抗体可含有几乎所有的至少一个(典型地为2个)可变区，其中所有或几乎所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的CDR区域，而且所有或几乎所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还含有至少一部分免疫球蛋白(一般是人免疫球蛋白)的恒定区(Fc)。对于进一步的细节，参见Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。人源化抗体包括PrimatizedTM抗体，其中抗体的抗原结合区来自用感兴趣抗原免疫猕猴而产生的抗体。“在人中无免疫原性”指，当在药学上可接受的载体中的感兴趣多肽或多肽变异体以治疗有效量与人的合适组织接触后，在一段潜伏期(如8-14天)之后第二次施用感兴趣多肽或其变异体时，没有表现出对感兴趣多肽或其变异体的敏感或抗性症状。术语“二体(diabody)”指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，该片段含有在同一多肽链(VH-VL)上连于轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)。通过使用一个太短从而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，就迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，从而形成2个抗原结合位点。在例如EP404，097；WO93/11161；和Holliger等人，美国科学院院报，906444-6448(1993)中有更完整的描述。术语“LFA-1介导的疾病”指因LFA-1受体在淋巴细胞上的细胞粘附作用而造成的病理状态。这种疾病的例子包括T细胞炎症应答，如包括牛皮癣在内的炎症皮肤疾病；与炎症肠疾病有关的应答(如Crohn氏疾病和溃疡性结肠炎)；成年人呼吸窘迫综合症；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；过敏症状如湿疹和哮喘以及其他涉及T细胞过滤和慢性炎症应答的症状；皮肤过敏反应(包括毒长春藤和毒橡树)；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；自身免疫疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化、Reynaud氏综合症、自身免疫甲状腺炎、实验性自身免疫脑脊髓炎、Sjorgen氏综合症、青少年型糖尿病和与由细胞因子和T淋巴细胞介导的迟发型过敏有关的免疫应答，一般见于痨病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎；恶性贫血；与白细胞渗出有关的疾病；CNS炎症疾病、继发于败血病或创伤的多发性器官受伤综合症；自身免疫性溶血性贫血；myethemiagravis；抗原-抗体复合物介导的疾病；各种类型的移植，包括移植物抗宿主或宿主抗移植物疾病；出血性休克；肺氧毒症；肺纤维化；伤口修复；B-细胞淋巴瘤；等等。具体地，对CD11a或CD11b抗体的优选指征是牛皮癣、移植排斥、哮喘、伤口修复和肺纤维化；对CD18抗体的优选指征是出血性休克、脑膜炎；脑炎；多发性硬化；哮喘；和肺氧毒症；而对CD20抗体的优选指征是B-细胞淋巴瘤。“处理(治疗)”指治疗性处理和预防或防御性措施。需要处理的包括那些早已有疾病的、以及那些可能患该疾病的、以及那些待预防该疾病的。出于处理目的，“哺乳动物”指任何划为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物和宠物，如狗、马、猫、羊、猪、牛等。较佳地，此处的哺乳动物为人。术语“LFA-1拮抗剂”一般指一种针对CD11a或CD18，或两者的抗体，但是也包括可溶性的ICAM-1(如ICAM-1胞外结构域)、针对ICAM-1的抗体、及其片段，或者其他能够抑制LFA-1与ICAM-1相互作用的分子。术语“抗-LFA-1抗体”或“抗-LFA-MAb”指针对CD11a或CD18、或两者的抗体。抗-CD11a抗体包括例如，MHM24(Hildreth等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，13202-208)、R3.1(IgG1；Rothlein，BoehringerIngeIheimPharmaceuticals，Inc.，Ridgefield，CT)、25-3(或25.3；来自Immunotech，France的IgG1；参见Olive等人编辑，HumanTcellClones.AnewApproachtoImmuneRegulation，Clifton，NJ，Humana，p.173)、KBA(IgG2a；Nishimura等人，细胞免疫(Cell.Immunol.)，10732；Nishimura等人，细胞免疫(Cell.Immunol.)，94122)、M7/15(IgG2b；Springer等人，Immunol.Rev.，68171)、IOT16(VermotDesroches等人，斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)，33277-286)、SPVL7(VermotDesroches等人，同上)、和M17(IgG2a；可从ATCC获得，它是大鼠的抗-鼠CD11a抗体)。抗-CD18抗体的例子包括MHM23(Hildreth等人，同上)、M18/2(IgG2a；Sanches-Madrid等人，J.Exp.Med.，158586)、H52(Fekete等人，临床实验免疫杂志(J.Clin.Lab.Immunol.)，31145-149)、Mas191c(VermotDesrocnes等人，同上)、IOT18(VermotDesroches等人，同上)、60.3(Taylor等人，临床实验免疫(Clin.Exp.Immunol.)，71324-328)和60.1(Campana等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，16537-542)。包括抗体在内的、合适的LFA-1拮抗剂的其他例子描述于，Hutchings等人，自然，348369(1990)、WO91/18011(91年11月28日出版)、WO91/16928(91年11月14日出版)、WO91/16927(91年11月14日出版)、加拿大专利申请2,008,368(1991年6月13日出版)、WO91/15076(90年12月13日出版)、WO91/10652(90年9月20日出版)、EP387,668(90年9月19日出版)、EP379,904(90年8月1日出版)、EP346,078(89年12月13日出版)、美国专利No.5,071,964、美国专利No.5,002,869、澳大利亚专利申请8815518(88年11月10日出版)、EP289,949(88年11月9日出版)和EP303,692(89年2月22日出版)。实施本发明的方式1.发明的一般性描述本发明涉及将IgGFc区的补救受体结合表位掺入感兴趣多肽，从而增加其循环半衰期，但是不丧失其生物活性。这可用任何手段，如在感兴趣多肽的合适区域进行突变以模拟Fc区，或者通过将表位掺入肽标记物中，然后将该标记物融合于感兴趣多肽的任何一端或者中间，或者通过DNA或肽合成。一种制备具有更长体内半衰期的多肽的系统方法包括几个步骤。首先涉及鉴别出IgG分子Fc区补救受体结合表位的序列和构象。一旦鉴别出这样的表位，便可修饰感兴趣多肽的序列以含有鉴别出的结合表位序列和构象。在序列突变之后，测试多肽变异体是否比原始多肽即感兴趣多肽有更长的体内半衰期。如果测试表明多肽变异体没有更长的体内半衰期，那么进一步改变序列以包含鉴别出的结合表位序列和构象。测试改变的多肽是否有更长的体内半衰期，并且继续该过程直至获得更长半衰期的分子。这样被掺入感兴趣多肽中的补救受体结合表位可以是任何合适上述表位，而且其性质取决于，例如，待修饰的多肽类型。这种转化应维持感兴趣多肽的生物活性，即转化的部分不会危害感兴趣多肽的构象或者危害该多肽结合于赋予其生物活性的配体。例如，如果感兴趣多肽是抗体，那么补救受体结合表位的放置不应干扰抗体的抗原结合位点。较佳地，感兴趣多肽含有Ig结构域或Ig样结构域，而且补救受体结合表位被置于该Ig结构域或Ig样结构域中。更佳地，该表位构成一个区域，在该区域中，来自Fc区的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基被转移至感兴趣多肽Ig结构域或Ig样结构域的类似位置。更加好的是，被转移的是来自Fc区一个或两个环的三个或多个氨基酸残基。还要好的是，该表位来自Fc区(如IgG的Fc区)CH2结构域，并且被转移至Ig或Ig样结构域的CH1、CH3或VH区，或者一个以上这样的区域。或者，该表位来自Fc区CH2结构域，并且被转移至感兴趣多肽Ig或Ig样结构域的CL区或VL区，或者两者。例如，为了讨论感兴趣多肽是抗-CD18时的变异体，参见图2。该图显示了各种Ig的相关共有一级结构，即人IgG1CH1结构域、人IgG2CH1结构域、人IgG3CH1结构域、人IgG4CH1结构域、人κCL结构域、人λCL结构域、以及Fabv1b(一种此处优选的抗-CD18Fab变异体)的具体序列。此外，图2显示了感兴趣和最重要的Fabv1b的残基。在一个优选例子中，重要的残基是那些在图2中带星号的残基，即在Fabv1b的一个环中的MIS和距MIS一个氨基酸C-端的T残基，以及在Fabv1b的另一个环中的HQN和距HQN两个氨基酸C-端的D残基和距D残基一个氨基酸C-端的K残基。在一个最佳例子中，补救受体结合表位含有序列(5′至3′)PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)，而且可任选地含有选自下组的序列HQSLGTQ(SEQIDNO11)、HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，尤其当感兴趣多肽是Fab或(Fab′)2时。在另一最佳例子中，补救受体结合表位是这样的多肽，该多肽不是Fc但含有序列(5′至3′)HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)和序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。该表位适合融合于感兴趣多肽，而且在一个优选方面它被包含在已融合于感兴趣多肽的多肽上。适合该目的的感兴趣多肽的例子包括那些如果突变其序列会导致二级或三级结构改变并有不利影响的多肽，例如生长激素或神经生长因子。在一个例子中，变异体可用重组方法制备。因此，制备编码变异体的核酸，然后将其置于可复制的载体中，再用该载体转染或转化合适的宿主细胞以表达。通过在培养基中培养宿主细胞，并从宿主细胞培养物中回收多肽变异体而产生多肽变异体。如果多肽变异体是被分泌的，可从培养基中回收。在另一例子中，多肽变异体的制备是通过改变在肾脏中被清除且不含IgGFc区的感兴趣多肽，使其含有IgGFc区的补救受体结合表位并有更长的体内半衰期。改变步骤优选用Kunkel诱变、定点诱变、盒式诱变或PCR诱变进行。Kunkel诱变描述于例如，Kunkel，美国科学院院报，82488-492(1985)。2.制备感兴趣多肽及其变异体下面的绝大部分论述涉及感兴趣多肽或多肽变异体的生产，即通过培养用含有编码感兴趣多肽或多肽变异体的核酸的载体所转化的细胞，然后从细胞培养物中回收感兴趣多肽或多肽变异体。还可想像，感兴趣多肽可用同源重组方法产生，如在1991年5月16日出版的WO91/06667中所提供的方法。简而言之，该方法涉及用一构建物(即载体)来转化含有内源多肽的原代哺乳动物细胞(例如，人细胞如果所需的多肽是人的话)，该构建物含有可扩增的基因(如二氢叶酸还原酶[DHFR]或其他下面论述的基因)和至少一个长度不小于约150bp、与感兴趣多肽基因编码区域的基因座上的DNA序列同源的侧翼区域，从而扩增编码感兴趣多肽的基因。可扩增的基因必须处于不干扰编码感兴趣多肽基因的表达的位置。转化的进行使构建物被同源地整合入原代细胞的基因组中，从而界定出一个可扩增区域。然后，通过可扩增基因或存在于构建物的其他标记，筛选含有构建物的原代细胞。存在标记基因就表明在宿主基因组中存在了和整合了构建物。没有必要进一步选择原代细胞，因为选择将在第二代宿主上进行。当存在来自正确同源整合体的DNA时，如果需要，可用PCR并测序得到的扩增DNA序列或确定PCR片段的合适长度并且扩增仅含有这些片段的细胞，来确定同源重组事件的发生。而且，如果需要，选择的细胞可在此时通过用合适的扩增剂(如氨甲蝶呤，如果可扩增基因是DHFR的话)应激(stress)细胞而加以扩增，从而获得多拷贝的靶基因。然而较佳地，也可在下述的第二次转化之后再进行扩增步骤。在选择步骤之后，从选择的原代细胞中分离出基因组的DNA部分(应足够大以包含整个可扩增区域)。再用这些基因组DNA部分来转化第二代哺乳动物表达宿主细胞，并克隆，然后选择含有可扩增区域的克隆。接着，如果在原代细胞中没有扩增过，那么通过扩增剂而扩增可扩增区域，最后，使现在含有多拷贝可扩增区域(该扩增区域含有感兴趣多肽)的第二代表达宿主细胞生长，以表达基因并产生多肽。A.分离编码感兴趣多肽的DNA编码感兴趣多肽的DNA可从任何cDNA文库中获得，该文库是从据信含有编码感兴趣多肽的mRNA并以可检测水平表达该多肽的组织中制备的。编码感兴趣多肽的基因也可从基因组文库中获得，或者通过体外寡核苷酸合成(假设已知道完整的核苷酸或氨基酸序列)而获得。用设计用于鉴别感兴趣基因或其编码的蛋白质的探针，来筛选文库。对于cDNA表达文库，合适的探针包括识别并特异性地与感兴趣多肽结合的单克隆或多克隆抗体；长约20-80碱基的、编码来自相同或类似物种感兴趣多肽的cDNA的已知或可疑部分的寡核苷酸；和/或编码相同或类似基因的互补或同源cDNA或其片段。合适的筛选基因组DNA文库的探针包括(但并不限于)编码相同或相似基因的寡核苷酸、cDNA、或其片段，和/或同源基因组DNA或其片段。用选定的探针来筛选cDNA或基因组文库，可采用Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)10-12章中所描述的标准程序进行。另一种分离编码感兴趣多肽的基因的方法，是用Sambrook等人(同上)14章中所述的PCR方法。该方法需要利用与感兴趣多肽杂交的寡核苷酸探针。选择寡核苷酸的策略在下面描述。一种优选的实施本发明的方法是使用精心选定的寡核苷酸序列来筛选来自不同组织的cDNA文库。选择作为探针的寡核苷酸序列应有足够的长度和足够的明确性，从而降低假阳性。实际的核苷酸序列一般基于保守的或高度同源的寡核苷酸序列。寡核苷酸可在一个或多个位置上是简并的。当筛选的文库来自一个不知道其优选密码子使用情况的物种时，使用简并寡核苷酸就特别重要。寡核苷酸必须被标记，从而当其与被筛选的文库中的DNA杂交时可以被检测。优选的标记方法是用本领域熟知的32P-标记的ATP和多聚核苷酸激酶来放射性标记寡核苷酸。但是，其他方法也可用于标记寡核苷酸，其中包括(但并不限于)生物素化或酶标。特别感兴趣的情况是，编码感兴趣多肽的核酸可编码全长的多肽。在某些优选例子中，核酸序列包括感兴趣多肽的信号序列。具有所有蛋白质编码序列的核酸的获得是通过用此处第一次公开的推导的氨基酸序列来筛选cDNA或基因组文库，而且如果需要，可用常规的引物延伸方法(如在Sambrook等人(同上)7.79章节中所述的方法)来检测mRNA前体并处理没有被逆转录成cDNA的mRNA中间体。B.制备感兴趣多肽变异体可通过将合适的核苷酸变化(如上述的用于Fc区的变化)引入编码感兴趣多肽的DNA中，或者通过体外合成所需的多肽变异体而适宜地制备感兴趣多肽变异体。这样的变异体包含例如，感兴趣多肽氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代，从而含有合适的表位并具有更长的血清半衰期。可进行缺失、插入和取代的任何组合，以制备最终的构建物，只要最终构建物具有所需的特性。氨基酸改变也可改变感兴趣多肽翻译后的加工过程，例如改变糖基化位点的数目。此外，与大多数哺乳动物基因相同，感兴趣多肽可能是由多外显子基因编码的。对于涉及感兴趣多肽的氨基酸序列变异体，突变位点的位置和突变的性质将取决于具体的待修饰的感兴趣多肽。例如，免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域，可以通过设定结构上与IgGCH2中2个含有补救受体表位的环相类似的环而进行最初的修饰。突变位点可个别或一系列地进行修饰，例如通过(1)用选择的保守性氨基酸置换第一个氨基酸，然后根据所得到的结果用更广选择的残基进行置换，(2)缺失靶残基，(3)在设定的位置附近插入相同或不同类别的残基，或者方法1-3的组合。一种有用的、确定感兴趣多肽中那些残基或区域是适合诱变的优选位置的方法，是Cunningham和Wells，科学，2441081-1085(1989)中描述的“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，确定一个或一组靶残基(如带电荷的残基如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最佳的是丙氨酸或聚丙氨酸)加以替换，以影响氨基酸与细胞中或细胞外周围水性环境的相互作用。那些在功能上表现出对替换敏感的结构域，再通过在置换位点处引入进一步的或其他的突变而进行结构的精细研究。这样，尽管引入氨基酸序列变异的位点被预先确定，但是突变本身的性质不必被预先确定。例如，为了优化给定位点处突变的性能，可以对靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，然后筛选产生的变异体是否有更长的循环半衰期。氨基酸序列缺失一般为约1-30个残基，更佳地为约1-10个残基，而且一般是连续的。连续缺失一般是偶数数目的残基，但是单个或奇数数目的缺失也在范围之内。作为例子，可在LFA-1抗体的低同源区域中引入缺失，它们与感兴趣多肽的氨基酸序列共享最大的序列相同性，从而改变多肽的半衰期。来自与其他配体结合位点中某一位点基本同源的感兴趣多肽区域的缺失，一般更可能会更明显地改变感兴趣多肽的生物活性。可选择连续缺失的数目，以保留感兴趣多肽在受影响的结构域中的三级结构，如β-折叠或α-螺旋。氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，长度为一个残基至含100个或更多残基的多肽，还包括在序列内插入单个或多个氨基酸残基。序列内插入(即插入在成熟多肽序列中)一般为约1-10个残基，更佳地1-5个，最佳地1-3个。插入最好以偶数个残基进行，但这并不是必须的。插入的例子包括插入感兴趣多肽的内部、以及与融合后会导致半衰期更长的、含有所需表位的蛋白质或肽在N端或C端融合。第三组变异体是氨基酸置换变异体。这些变异体至少有一个多肽分子中的氨基酸残基被移去并在其位置上插入不同的残基。置换诱变最感兴趣所位置包括抗体上的一个或两个环。其他感兴趣的位置是这样的位置，其中来自不同物种的多肽的具体残基在所有具有感兴趣多肽的动物物种中都是相同的，这种保守程度暗示在达到这些分子共同的生物活性中所起的重要性。这些位置，尤其是那些在至少3个其他同样保守位置处的序列中的位置，被以较保守的方式进行置换。这种保守性置换示于表1，开头的是优选的置换。如果这种置换导致生物活性的改变，那么就引入更明显的变化、表1中指出的代表性置换、或下面进一步按氨基酸类型给出的置换，然后筛选产物。表1</tables>对感兴趣多肽功能的基本修饰，可以通过选择在下列方面的效应上差别明显的置换而实现(a)维持取代区域中多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)维持靶位置处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。根据共同的侧链特性，天然存在的残基被分成下列几类(1)疏水的正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水的cys，ser，thr；(3)酸性的asp，glu；(4)碱性的asn，gln，his，lys，arg；(5)影响链取向的残基gly，pro；和(6)芳香类的trp，tyr，phe非保守性取代需要用这些类别中一类的某种氨基酸替换另一类的的某种氨基酸。这样的置换残基可以被引入保守性置换位置，或者更佳地被引入其余的(非保守的)位置。有时可能需要使存在于分子中的一个或多个蛋白酶切割位点失活。这些位点可以通过检查所编码的氨基酸序列而鉴别出，例如在胰蛋白酶的情况下是精氨酰基或赖氨酰基。当鉴别出蛋白酶切割位点后，可以用其他残基(最好用碱性残基如谷氨酰胺或亲水性残基如丝氨酸)置换靶残基；或者缺失掉该残基；或者在该残基后立刻插入一个脯氨酰基，使它们对蛋白酶切割失活。在另一例子中，除了信号序列的起始甲硫氨酰基之外的任何甲硫氨酰基，或者位于每个这样的甲硫氨酰基每个N端或C端约3个残基之内的任何残基，可以用其他的残基(尤其根据表1)加以取代或被缺失掉。或者，在这些位点附近插入约1-3个残基。在维持感兴趣多肽的适当构象中不涉及的任何半胱氨酸残基也可被取代，一般是用丝氨酸取代，以便改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。在第一个例子中，编码感兴趣多肽氨基酸序列变异体的核酸分子是用本领域中已知的各种方法制备的。这些方法包括(但并不限于)通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变制备、PCR诱变、和对早期制备的变异体或多肽的非变异体形式(作为此处变异体的基础)(“感兴趣多肽”)进行盒式诱变。寡核苷酸介导的诱变是一种优选的、制备此处的置换、缺失和插入型多肽变异体的方法。该技术是本领域中公知的，并且由Adelman等人，DNA，2183(1983)描述。简而言之，DNA的改变是通过，将编码所需突变的寡核苷酸与DNA模板相杂交，其中模板是含有待改变多肽的未改变或天然DNA序列的、单链形式的质粒或噬菌体。在杂交之后，用DNA聚合酶来合成模板的完整的第二条互补链，该互补链中会因此掺入寡核苷酸引物，从而会编码选定的DNA改变。一般，使用至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸，在编码突变的核苷酸两侧，含有12-15个与模板完全互补的核苷酸。这保证了寡核苷酸会合适地与单链DNA模板分子杂交。用本领域中已知的技术，如Crea等人，美国科学院院报，755765(1978)中所描述的技术，可以轻易地合成寡核苷酸。可用那些衍生自噬菌体M13载体的载体(市售的M13mp18和M13mp19是合适的)，或者那些含有单链噬菌体复制起点的载体(如Viera等人，Meth.Enzymol.，1533(1987)中所述)，来制备DNA模板。因此，可将待突变的DNA插入这些载体的一种中，以产生单链模板。单链模板的产生描述于Sambrook等人(同上)4.21-4.41章节。或者，也可用标准技术使双链质粒(或其他)DNA变性，而产生单链DNA模板。为了改变原始DNA序列以生产本发明的多肽变异体，可在合适的杂交条件下使寡核苷酸与单链模板杂交。然后加入DNA聚合酶(一般是DNA聚合酶I的Klenow片段)，将寡核苷酸作为合成用引物而合成模板的互补链。这样形成了异源双链体分子，其中一条DNA链编码突变形式的多肽，而另一条链(原始模板)编码原始的、未改变的多肽序列。然后将该异源双链分子转化入合适的宿主细胞，一般用诸如大肠杆菌JM101之类的原核生物。在细胞生长后，将它们置于琼脂糖平板上，用32P放射标记的寡核苷酸引物进行筛选，以鉴别出含有突变DNA的细菌克隆。然后将突变区域取出，再置于合适的用于产生蛋白质的载体中，一般是在转化合适宿主中典型采用表达载体类型。上面描述的方法可以加以改进，以便产生质粒的两条链都含有突变的同源双链。改进如下如上所述，将单链寡核苷酸与单链模板进行退火。将3种脱氧核糖核苷酸(脱氧腺苷(dATP)、脱氧鸟苷(dGTP)和脱氧胸苷(dTTP))的混合物，与修饰过的、称为dCTP-(αS)的硫代脱氧胞苷(可从AmershamCorporation获得)混合。将该混合物加至模板-寡核苷酸复合物。一旦将DNA聚合酶加至该混合物中，会产生与模板相同(除了突变的碱基)的DNA链。此外，该新的DNA链含有dCTP-(αS)而不是dCTP，这用于保护它不被限制性内切酶所消化。在双链的异源双链体的模板链被合适的限制酶所切时，模板链可用ExoIII核酸酶或其他合适的、通过含有待诱变位点的区域的核酸酶加以消化。然后终止反应，从而形成一个仅部分为单链的分子。然后在所有4种脱氧核糖核苷三磷酸、ATP和DNA连接酶都存在的情况下，用DNA聚合酶形成完整的双链DNA同源双链体。接着，如上所述，可将该同源双链分子转化入合适的宿主细胞如大肠杆菌JM101。编码具有一个以上待置换氨基酸的多肽突变体的DNA，可用几种方法中一种加以产生。如果这些氨基酸在多肽链上位置靠得很近，可以用一个编码全部所需氨基酸置换的寡核苷酸同时进行突变。但是，如果这些氨基酸相互之间隔开一定距离(隔开约10个氨基酸以上)，则难以形成一个编码全部所需变化的寡核苷酸。取而代之，可采用另外2种方法中的一种。在第一种方法中，对于每个待取代的氨基酸，分别合成一个寡核苷酸。然后将这些寡核苷酸同时与单链模板DNA退火，因而从模板合成的第二条DNA链含有全部所需的氨基酸置换。另一种方法涉及2轮或更多轮的诱变以生产所需的突变体。第一轮是如上所述用于单个突变体的将野生型DNA用作模板，将编码第一个所需氨基酸取代的寡核苷酸与该模板退火，然后产生异源双链DNA分子。第二轮诱变采用第一轮诱变中所生产的突变型DNA作为模板。因此，该模板早已含有一个或多个突变。将编码另外的所需氨基酸置换的寡核苷酸与该模板退火，这样形成的DNA便编码第一轮和第二轮诱变中的突变。这样形成的DNA可用作第三轮诱变的模板，依此类推。PCR诱变也适用于制造本发明的氨基酸变异体。尽管下面的论述针对DNA，但是应理解这些技术也可用于RNA。PCR技术一般指下列的程序(参见Erlich，同上，R.Higuchi的章节，p61-70)当少量模板DNA被用作PCR的原料时，可使用与模板DNA相应区域上的序列稍有差别的引物，来产生较大量的特异性DNA片段，它与模板序列的差别仅在于引物不同于模板的位置。为了将突变引入质粒DNA，一个引物被设计成覆盖突变位置并含有突变；而另一引物的序列必须与质粒相反链的一段序列相同，但是该序列可以位于质粒DNA的任何地方。然而，较佳的是，第二个引物序列位于第一个引物序列附近200个核苷酸以内，这样完整的、被引物结合的DNA扩增区域最后可以被方便地测序。使用类似上述的引物对来进行PCR扩增，可形成一群DNA片段，它们在引物所限定的突变位置上是不同的，而且还可能在另外位置上也不同，因为模板复制有时会有偏差。如果模板与产物材料之比极低，那么绝大多数产物DNA片段会掺有所需的突变。通过标准DNA进行，可将该产物材料用于替换作为PCR模板的质粒中的相应区域。通过使用第二个突变引物，或用不同的突变引物进行第二轮PCR，然后在3组分(或多组分)连接中将2个形成的PCR片段同时连于载体片段，可以同时引入不同位置上的突变。在PCR诱变的具体例子中，用限制性内切酶消化而使模板质粒DNA(1微克)线性化，其中该限制酶在质粒上的待扩增区域外有唯一的识别位点。将100ng这种材料加至含有PCR缓冲液和25pmol各种寡核苷酸引物的PCR混合物中至终体积为50微升，其中PCR缓冲液含有4种脱氧核苷三磷酸并且包括在GeneAmp试剂盒中(得自Perkin-ElmerCetus，Norwalk，CT和Emeryville，CA)，反应混合物上覆盖35微升的矿物油。将反应混合物在100℃变性5分钟，快速置于冰上，然后在矿物油层下加入1微升栖热水生菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶(5单位/微升，购自Perkin-ElmerCetus)。反应混合物再插在DNA热循环仪上(购自Perkin-ElmerCetus)，程序如下2分钟55℃30秒72℃，然后19个以下的循环30秒94℃30秒55℃，和30秒72℃。在程序结束时，将反应管从热循环仪上取下，将水相转至新的管中，用苯酚/氯仿(50∶50体积比)抽提，再用乙醇沉淀，用标准方法回收DNA。随后将该材料进行适当的处理以便插入载体。另一种制备变异体的方法，即盒式诱变基于Wells等人，Gene34315(1985)中所述的技术。起始原料是含有待突变DNA的质粒(或其他载体)。鉴别出待突变DNA中的密码子。在每个鉴别出的突变位点两侧必须有唯一的限制性内切酶位点。如果不存在这样的限制性位点，可以用上述的寡核苷酸介导的诱变方法来将它们引入DNA的适当位置，从而产生限制性位点。在将限制性位点引入质粒之后，在这些位点出切割质粒以线性化。编码位于限制性位点之间的DNA序列的、但含有所需突变的双链寡核苷酸，用标准方法合成。分别合成2条链，然后用标准技术将其杂交在一起。这种双链寡核苷酸被称为“盒”。这种盒被设计成其3′和5′端与线性化的质粒末端相对应，从而可以直接连入质粒。这样形成的质粒就含有突变的DNA序列。C.将核酸插入可复制的载体编码多肽变异体的核酸(如cDNA或基因组DNA)被插入可复制的载体，以便进一步克隆(扩增DNA)或表达。已有许多种质粒，而且选择合适的载体取决于(1)它是否用于DNA扩增或DNA表达，(2)待插入载体的核酸的大小，和(3)待被该载体所转化的宿主细胞。根据其功能(扩增DNA或表达DNA)以及与其相容的宿主细胞，每种载体可含有各种不同的元件。载体元件一般包括(但并不限于)一种或多种下列元件信号序列、复制起点、一种或多种标记基因增强子元件、启动子和转录终止序列。(i)信号序列元件本发明的多肽不仅可以直接产生，而且可以作为与异源多肽形成的融合蛋白形式产生，较佳地该融合蛋白含有信号序列或在成熟多肽变异体的N-末端处有特异性切割位点的其他多肽。一般，信号序列可以是载体的一部分，或者它也可以作为DNA的一部分而插入载体。选定的异源信号序列应是可被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶所切割)的信号序列。对于不识别和加工感兴趣多肽的信号序列的原核宿主细胞，可用选定的原核信号序列替换该信号序列，例如用选自下组的原核信号序列所替换碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp、或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，原始的或野生型信号序列可被例如酵母转化酶前导序列、酵母α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(kluyveromyces)α-因子前导序列，后者描述于1991年4月23日授权的美国专利No.5,010,182中)、酵母酸性磷酸酶前导序列、鼠唾液淀粉酶前导序列、羧肽酶前导序列、酵母BAR1前导序列、Humicolalanuginosa脂酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列(EP362,179，1990年4月4日出版)或在1990年11月15日出版的WO90/13646中所描述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，原始的人信号序列(如通常在体内指导这些天然感兴趣多肽(从其得到感兴趣的变异体)从人细胞中分泌出来的多肽前序列)是令人满意的，尽管其他的哺乳动物信号序列(如来自其他动物多肽的信号序列或来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列)以及病毒分泌前导序列如单纯疱疹病毒gD信号序列也是合适的。将这些前体区域的DNA按阅读框连于编码成熟多肽变异体的DNA。(ii)复制起点元件表达载体和克隆载体两者都含有能使载体在一种或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般而言，在克隆载体中，这种序列是能使载体独立于宿主染色体DNA而进行复制的序列，而且它包括复制起点或自我复制序列。对于各种不同的细菌、酵母和病毒，这类序列是众所周知的。质粒pBR322(ATCC37,017)的复制起点、或其他市售的细菌载体如pKK223-3(PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(PromegaBiotech，Madison，Wis.)适用于绝大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适用于酵母，而各种不同的病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般对于哺乳动物表达载体，不需要使用复制起点元件(使用SV40起点仅仅是因为它含有早期启动子)。大多数表达载体是“穿梭”载体，就是说它们能够在至少一类生物体中复制而且能够被转至另一种生物体以便表达。例如，某个载体被克隆在大肠杆菌中，然后同一载体又被转染入酵母或哺乳动物细胞以便表达，即使它不能独立于宿主细胞染色体进行复制。还可以通过插入宿主基因组而扩增DNA。这可方便地将芽胞杆菌(Bacillus)属用作宿主，通过例如在载体中包含一个与芽胞杆菌基因组DNA的序列相互补的DNA序列而得以实现。用该载体转染芽胞杆菌会在基因组DNA和插入的DNA之间产生同源重组。但是，回收编码多肽变异体的基因组DNA比回收外源复制载体要复杂得多，因为需要限制性酶消化来切取DNA。(Iii)选择基因元件表达载体和克隆载体应包含选择基因，也称为可(供)选择的标记(基因)。该基因编码转化的宿主细胞在选定的培养基中存活或生长所需的蛋白质。没有被含有选择基因的载体所转化的宿主细胞不会在培养基上存活。典型的选择基因所编码的蛋白质是(a)赋予对抗生素或其他毒素如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤、或四环素抗性的蛋白质，(b)互补营养缺陷型的缺陷的蛋白质，或(c)提供复合培养基中没有的关键营养物的蛋白质，如杆菌属(Bacilli)的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。一个选择方案的例子是，采用药物来抑制宿主细胞的生长。那些成功地被异源基因所转化的细胞会产生赋予抗药性的蛋白质，因而可以在选定方式中存活下来。这类显性选择的例子使用药物新霉素(Southern等人，J.Molec.Appl.Genet.1327)、霉酚酸(Mulligan等人，科学，2091422)或潮霉素(Sugden等人，分子细胞生物学，5410-413)。上面给出的3个例子采用了在真核控制下的细菌基因，以分别赋予对合适药物G418即新霉素(遗传霉素(geneticin))、xgpt(霉酚酸)、或潮霉素的抗性。另一种对哺乳动物细胞合适的可选择标记基因的例子，是那些能够鉴别出细胞组分有能力摄取核酸的标记基因，如DHFR或胸苷激酶。将哺乳动物转化子置于选择压力下，使得仅有转化子因为摄取了标记基因而能够唯一地存活。选择压力的施加是通过在一定的条件下培养转化子，其中培养基中选择剂的浓度连续地变化，从而导致扩增选择基因和编码多肽变异体的DNA。扩增是这样的过程通过该过程，大量需要的、产生对生长至关重要的蛋白质的基因，在续代重组细胞的染色体中变得串联重复。从扩增的DNA合成出大量的多肽变异体。其他可扩增基因的例子包括金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II(较佳的是灵长目的金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，用DHFR选择基因转化的细胞，先通过将所有的转化子在含有氨甲蝶呤(Mtx)(一种DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养而被鉴别出。当采用野生型DHFR时，一种合适的宿主细胞是在DHFR活性方面有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其制备和繁殖如Urlaub和Chasin，美国科学院院报，774216(1980)中所述。再将转化的细胞暴露于更高浓度的氨甲蝶呤。这导致合成多拷贝的DHFR基因，同时还合成了多拷贝的构成表达载体的其他DNA，如编码多肽变异体的DNA。如果使用对Mtx有高抗性的突变型DHFR基因，则这种扩增技术可用于任何其他原本不合适的宿主细胞如ATCCNo.CCL61CHO-K1，尽管该细胞存在内源的DHFR(EP117,060)。或者，用编码多肽变异体、野生型DHFR蛋白和其他可选择标记如氨基糖苷3-磷酸转移酶(APH)的DNA序列所转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源DHFR的野生型宿主)，可以通过在含有针对可选择标记的选择剂的培养基中让细胞生长而选择出，其中选择剂可以是例如氨基糖苷类抗生素如卡那霉素、新霉素或G418。参见美国专利No.4,965,199。合适的用于酵母中的选择基因，是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，自然28239；Kingsman等人，基因，7141；或Tschemper等人，基因10157)。trp1基因提供了一种用于不能在色氨酸中生长的酵母突变株如ATCCNo.44076或PEP4-1的选择标记(Jones，遗传学8512)。通过在没有色氨酸下的生长，在酵母宿主细胞基因组中存在的trp1损伤便提供了一种有效的、检测转化的环境。类似地，可用已知的含有Leu2基因的质粒来互补Leu2-缺陷型的酵母株(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体也可用于转化克鲁维酵母属的酵母。Bianchi等人，Curr.Genet.12185(1987)。最近，报道了一种用于乳克鲁维酵母(K.lactis)的、大规模生产重组牛凝乳酶的表达系统，VandenBerg，Bio/Technology8135(1990)。还公开了由克鲁维酵母属的工业菌株分泌成熟的重组人血清白蛋白的、稳定的多拷贝表达载体。Fleer等人，Bio/Technology9968-975(1991)。(iv)启动子元件表达和克隆载体常含有启动子，它为宿主生物体所识别并可操作地连于核酸。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′)的非翻译序列(一般为约100-1000bp)，它控制与其可操作地相连的具体核酸序列的转录和翻译，如本文的多肽变异体的核酸序列。这些启动子通常被分成2类，诱导型和组成型。诱导型启动子是这样的启动子，在其对应于培养条件的某些变化(如存在或缺乏某种营养成分，或者温度变化)的控制下，它会开始高水平地转录DNA。目前，大量为各种潜在宿主细胞所识别的启动子是众所周知的。用限制性酶消化从源DNA中切取启动子，然后将分离出的启动子序列插入载体，这样便可将这些启动子可操作地连于编码多肽变异体的DNA。感兴趣多肽的启动子以及许多异源启动子都可用于指导DNA的扩增和/或表达。但是，优选的是异源启动子，因为与感兴趣多肽的启动子相比，它们一般可更高地转录和更大量重组地产生多肽变异体。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等人，自然275615；和Goeddel等人，自然281544)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，核酸研究84057和EP36,776)以及杂合启动子如tac启动子(deBoer等人，美国科学院院报8021-25)。然而，其他已知的细菌启动子也是合适的。它们的核苷酸序列已经被出版，从而可使技术人员将它们可操作地连于编码多肽变异体的DNA(Siebenlist等人，细胞20269)，其中可使用接头或衔接头来提供任何所需的限制性位点。用于细菌系统启动子还可含有可操作地连于编码多肽变异体的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。用于真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因含有位于转录起始位点上游约25-30碱基处的富含AT的区域。另一种在许多基因的转录起始位置上游70-80碱基处发现的序列是CXCAAT区域，其中X可以是任何核苷酸。在许多真核基因的3′端的是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加polyA尾的信号。所有这些序列都适合插入于真核表达载体中。适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.2552073)或其他糖酵解酶(Hess等人，J.Adv.EnzymeReg.7149；和Holland，生物化学174900)如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、葡糖磷酸异构酶和葡糖激酶的启动子。其他的酵母启动子，即具有额外的由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，它们是乙醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、与氮代谢关联的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶等的启动子区域。用于酵母表达的合适载体和启动子还描述于Hitzeman等人，EP73,657A中。酵母增强子也可与酵母启动子一起有利地使用。在哺乳动物宿主细胞中从载体上转录出多肽变异体，是被从病毒如多瘤病毒、禽痘病毒(UK2,211,504，1989年7月5日出版)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和最佳的猴病毒40(SV40)的基因组中获得的启动子；从异源哺乳动物启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子中获得的启动子；从热激启动子中获得的启动子；或从通常与多肽变异体相关的启动子所控制，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地以SV40限制性片段的形式获得，它还含有SV40病毒复制起点。Fiers等人，自然273113(1978)；Mulligan和Berg，科学2091422-1427(1980)；Pavlaskis等人，美国科学院院报787398-7402(1981)。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地以HindIIIE限制性片段的形式获得。Greenaway等人，基因18355-360(1982)。用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利No.4,419,446。这种系统的一种改良形式描述于美国专利No.4,601,978。还可参见Gray等人，自然295503-508(1982)，内容为在猴细胞中表达编码免疫干扰素的cDNA；Reyes等人，自然297598-601(1982)，内容为在单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下，在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA；Canaani和Berg，美国科学院院报795166-5170(1982)，内容为在培养的小鼠和兔细胞中表达人干扰素-β1基因；以及Gorman等人，美国科学院院报796777-6781(1982)，内容为在CV-1猴肾细胞、鸡胚胎成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞和小鼠NIH-3T3细胞中，用Rous肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子，表达细菌的CAT序列。(v)增强子元件通过将增强子序列插入载体，通常可以在更高级真核生物中，增加转录编码本发明多肽变异体的DNA的水平。增强子是顺式作用的DNA元件，一般为10-300bp，它作用于启动子以增强其转录作用。增强子取向和位置是相对独立的，已发现可位于转录单元的5′端(Laimins等人，美国科学院院报78993)和3′端(Lusky等人，Mol.CellBio.31108)，可位于内含子(Banerji等人，细胞33729)，也可位于编码序列本身(Osborne等人，Mol.CellBio.41293)。现在，许多哺乳动物基因的增强子序列是已知的(珠蛋白、弹性蛋白、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，典型地，人们可使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点后侧(碱基对100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多瘤病毒增强子、和腺病毒增强子。还可参见Yaniv，自然29717-18(1982)，内容为用于激活真核启动子的增强子元件。增强子可以被剪接入载体中多肽变异体编码序列的5′或3′的位置，但是最好位于启动子5′端的某个位置。(vi)转录终止元件用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其他多细胞生物体的有核细胞)的表达载体，还含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。这样的序列一般可从真核或病毒DNA或cDNA的5′(以及偶尔的3′)不翻译区域中获得。这些区域，含有在编码多肽变异体的mRNA的不翻译部分中以聚腺苷酸片段形式转录的片段。(vii)载体的构建和分析可采用标准的连接技术构建含有一个或多个上述元件的合适载体。分离出的质粒或DNA片段被切割、剪裁并重新连接成所需的形式，从而产生所需的质粒。为了分析以证实在构建的质粒中序列正确，用连接混合物转化大肠杆菌K12株294(ATCC31,446)，并且合适的话，用氨苄青霉素或四环素抗性选择出成功的转化子。制备来自转化子的质粒，用限制性内切酶消化法和/或用Messing等人，核酸研究9309(1981)或Maxam等人，酶学方法65499(1980)的方法测序而加以分析。(viii)瞬时表达载体在实施本发明中特别有用的是，在哺乳动物细胞中瞬时表达编码多肽变异体的DNA的表达载体。一般，瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，从而在宿主细胞中积累许多拷贝的表达载体，并因而可合成高水平的由表达载体编码的所需多肽。Sambrook等人，同上，pp16.17-16.22。瞬时表达系统包括合适的表达载体和宿主细胞，它可方便地正确鉴定出克隆的DNA所编码的多肽变异体，以及快速地筛选具有所需生物特性或生理特性的变异体。因此，为了鉴别出有生物活性的多肽变异体，瞬时表达系统在本发明中特别有用。(ix)合适的代表性脊椎动物细胞载体适用于在重组脊椎动物细胞培养中合成多肽变异体的其他方法、载体和宿主细胞，描述于Gething等人，自然293620-625(1981)；Mantei等人，自然28140-46(1979)；EP117,060；和EP117,058。对于在哺乳动物细胞培养中产生多肽变异体特别有用的质粒是pRK5(EP307,247)或pSVI6B(PCT出版物No.WO/08291，1991年6月13日出版)。pRK5的衍生质粒pRK5B(Holmes等人，科学，2531278-1280)在此处特别适合用于这种表达。D.宿主细胞的选择和转化用于克隆或表达此处载体的其他合适宿主细胞是上述的原核、酵母或其他更高级的真核细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escheriachia)(比如大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志贺氏菌属(Shigella)，以及芽胞杆菌属如枯草杆菌和藓样芽胞杆菌(B.licheniformis)(如1989年4月12日出版的DD266,710中所公开的藓样芽胞杆菌41P)、假单胞菌属如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其他的菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)、大肠杆菌DH5α、和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子仅仅是阐述性的，并不起限制作用。菌株W3110是特别优选的宿主或亲代宿主，因为它是用于重组DNA产品发酵的常用宿主菌株。较佳地，宿主细胞应分泌最少量的蛋白酶。例如，可以修饰菌株W3110，从而在编码宿主内源蛋白质的基因上造成遗传突变，其中这类宿主的例子包括大肠杆菌W3110株1A2，其完整基因型是tonAΔ；大肠杆菌W3110株9E4，其完整基因型是tonAΔptr3；大肠杆菌W3110株27C7(ATCC55,244)，其完整的基因型是tonAΔptr3phoAΔE15Δ(argF-1ac)169ΔdegPΔompTkanr；大肠杆菌W3110株37D6，其完整的基因型是tonAΔptr3phoAΔE15Δ(argF-lac)169ΔdegPΔompTΔrbs7ilvGkanr；大肠杆菌W3110株40B4，它是无卡那霉素抗性、具有degP缺失突变的株37D6；和在美国专利No.4,946,783(1990年8月7日授权)中所公开的、具有突变的外周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。另外，体外克隆方法，如PCR或其他核酸聚合酶反应，也是适用的。除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适用于多肽变异体编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵(Saccharomycescerevisiae)，即常见的发面酵母，是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，大量其他属、种或株通常是可供此处使用的，如裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach和Nurse，自然，290140；EP139,383，1985年5月2日出版)；克鲁维酵母属宿主(美国专利No.4,943,529；Fleer等人，同上)如乳克鲁维酵母(K.lactis)[MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt等人，细菌学杂志737(1983)]、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wicheramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906；VandenBerg等人，同上)、K.thermotolerans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；yarrowia[EP402,226]；巴士德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)(EP183,070；Sreekrishna等人，J.BasicMicrobiol.28265-278)；念珠菌属；Trichodermareesia[EP244,234]；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)(Case等人，美国科学院院报765259-5263)；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(Schwanniomycesoccidentalis)(EP394,538，1990年10月31日出版)；和丝状真菌如链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(penicillium)、Tolypocladium(WO91/00357，1991年1月10日出版)和曲霉属(Aspergillus)如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.112284-289；Tilburn等人，基因26205-221；Yelton等人，美国科学院院报811470-1474)和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，欧洲分子生物学协会杂志4475-479)。适用于产生多肽变异体的宿主细胞可衍生自多细胞生物体。这种宿主细胞能够进行复杂的加工并有糖基化活性。原则上，任何高级的真核生物细胞都可行，无论是来自脊椎动物还是来自无脊椎动物培养物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫的细胞。已经鉴别出许多杆状病毒株和变异株，以及相应的来自宿主(如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(蠋)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori))的允许性昆虫宿主细胞。可参见例如Luckow等人，Bio/Technology647-55(1988)；Miller等人，遗传工程(GeneticEngineering)，Setlow等人编辑，Vol8(PlenumPublishing，1986)，pp.277-279；和Maeda等人，自然315592-594(1985)。用于转染的各种不同的病毒株是公众可以获得的，如苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5株，而且这类病毒可根据本发明在此处用作病毒，尤其是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物可以被用作宿主。典型地，通过与细菌根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的某些株一起孵育而转染植物细胞，其中事先已对农杆菌进行操作使其含有该DNA。在将植物细胞培养物和根瘤农杆菌一起孵育时，将编码多肽变异体的DNA转入植物细胞宿主中，从而使其被转染并且在合适的条件下表达该DNA。此外，与植物细胞相容的调控序列和信号序列是可以获得的，如胭脂碱合成酶启动子和聚腺苷酸信号序列。Depicker等人，J.Mol.Appl.Gen.1561(1982)。此外，从T-DNA780基因的上游区域中分离出的DNA片段，能激活或增加在含重组DNA的植物组织中可被植物表达的基因的转录水平。EP321,196，1989年6月21日出版。然而，脊椎动物细胞是最感兴趣的，而近年来通过培养繁殖脊椎动物细胞(组织培养)已经成为一种常规的程序(TissueCulture，AcademicPress，Kruse和Patterson，编辑者)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是被SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾细胞系(293或亚克隆的悬浮培养生长的293细胞，Graham等人，J.GenVirol.3659)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，美国科学院院报，774216)；小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251)；猴肾细胞(CV1ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)；水牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(HepG2)。宿主细胞用本发明的上述表达或克隆载体加以转染以及更佳地加以转化，然后在常规的营养培养基上培养，其中培养基被加以改进以便诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。转染指表达载体被宿主细胞所摄入，而不论任何编码序列是否真的被表达。对于本领域的一般技术人员而言，有许许多多转染方法是已知的，例如磷酸钙法和电穿孔法。当宿主细胞中有这种载体操作的迹象，一般便认为是成功的转染。转化意味着将DNA引入某个生物体，从而使该DNA作为染色体外元件或因整合到染色体上而被复制，取决于所用的宿主细胞，用适合该细胞的标准技术进行转化。如在Sambrook等人(同上)1.82章节所描述的用氯化钙进行的钙处理法，或者电穿孔法，一般可以用于原核或其他含有基本细胞壁屏障的细胞。用根瘤农杆菌进行的感染，可用于转化某些植物细胞，如Shaw等人，基因23315(1983)和WO89/05859(1989年6月29日出版)所述。此外，植物可用超声波处理进行转染，如1991年1月10日出版的WO91/00358中所述。对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，优选的是Graham和vanderEb，Virology52456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的总体情况，已经描述于1983年8月16日授于Axel的美国专利No.4,399,216中。转化酵母通常是按VanSolingen等人，J.Bact.130946(1977)和Hsiao等人，美国科学院院报763829(1979)的方法进行。然而，其他将DNA引入细胞的方法，如核微注射、电穿孔、用完整的细胞进行细菌原生质体融合、或聚阳离子如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚鸟氨酸等也可使用。对于用于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人，酶学方法(MethodsinEnzymology)(1989)，Keown等人，酶学方法185527-537(1990)和Mansour等人，自然336348-352(1988)。E.培养宿主细胞用于产生本发明的多肽变异体多肽的原核细胞，在合适的培养基如在Sambrook等人(同上)中所述的培养基中，进行培养。用于产生本发明的多肽变异体的哺乳动物细胞可在各种不同培养基中培养。市售的培养基如Ham′sF10(Sigma)、F-12(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，Sigma)和D-MEM/F-12(GibcoBRL)都适合培养这些宿主细胞。此外，任何在例如下列文献中描述的培养基也可用作宿主细胞的培养基Ham和Wallace，Meth.Enz.5844(1979)，Barnes和Sato分析化学(Anal.Biochem)102255(1980)，美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469；或4,560,655；美国专利RENo.30\985；WO90/03430；WO87/00195。所有这些培养基都可按需要添加激素和/或其他的生长因子(如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子[EGF])、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(GentamycinTM)药物)、痕量元素(定义为以微摩尔级的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等价的能量源。任何其他必要的补充物也可以合适的浓度加入，这是本领域技术人员知晓的。培养条件如温度、pH等是以往用于选择用于表达的宿主细胞的条件，这是一般技术人员所熟知的。一般而言，用于扩大体外哺乳动物细胞培养物产量的原则、方案和实际技术可在MammalianCellBiotechnologyaPracticalApproach，M.Butler，ed.，IRLPress，1991中找到。在该公开内容中所指的宿主细胞包括体外培养中的细胞以及在宿主动物中的细胞。F.基因扩增/表达的检测根据本文所提供的序列，采用适当标记的探针，可在样品中直接检测基因扩增和/或表达，例如通过常规的Southern印迹法、Northern印迹法来定量分析mRNA的转录(Thomas，美国科学院院报，775201-5205)、斑点印迹法(DNA分析)、或原位杂交。可采用各种不同的标记，最常用的是放射性同位素，尤其是32P。但是，也可采用其他技术，例如使用被生物素修饰的核苷酸，以便将其引入多聚核苷酸。然后，生物素便作为结合亲和素或抗体(它们可被各种不同的标记物如放射性核素、荧光物质、酶等所标记)的位点。或者，可使用能识别特定双链的抗体，其中包括DNA双链、RNA双链、和DNA-RNA杂合双链或DNA-蛋白质双链体。抗体也可被标记，并在双链体固定于某表面的情况下进行分析，这样一旦在表面上形成双链体，这能够检测到存在结合于双链体的抗体。或者，基因表达可用免疫方法来直接定量分析基因产物的表达，如组织切片的免疫组织化学染色法和细胞培养物或体液分析。用免疫组织化学染色技术时，先制备细胞(一般通过脱水和固定)，然后与对偶联的基因产物特异的、标记的抗体进行反应，其中该标记通常是可通过视觉检测的，如酶标、荧光标记、发光标记等。一种特别灵敏的、适用于本发明的染色技术由Hsu等人，Am.J.Clin.Path.，75734-738(1980)。用于免疫组织化学染色和/或样品液体分析的抗体，可以是单克隆或多克隆抗体，而且可以是在任何哺乳动物中制备的。常规地，可根据在下面章节4中所述的那样，制备针对多肽变异体的抗体。G.纯化多肽如果变异体是在细胞内产生的，那么作为第一个步骤，将颗粒碎屑(宿主细胞或裂解的碎片)去除，例如通过离心或超过滤；任选地，蛋白质可用市售的蛋白质浓缩过滤器加以浓缩，然后用一个或多个选自下组的步骤将多肽变异体与其他杂质分开免疫亲和色谱，离子交换柱分级(如在二乙氨乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基的基质上)，在Blue-琼脂糖凝胶(Sepharose)、CMBlue-琼脂糖凝胶、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-琼脂糖凝胶、麦胚凝集素-琼脂糖凝胶、伴刀豆球蛋白A-琼脂糖凝胶、乙醚Toyopearl、丁基Toyopearl、苯基Toyopearl、或蛋白质A琼脂糖凝胶上进行的色谱，SDS-PAGE色谱，氧化硅色谱，层析聚焦，反相HPLC(如具有侧链脂族基团的氧化硅凝胶)，使用例如Sephadex分子筛的凝胶过滤或分子排阻色谱，在选择性地结合多肽的柱上进行的色谱，以及乙醇或硫酸铵沉淀。在细菌培养物中产生的重组多肽变异体，其分离通常是先从细胞沉淀物中抽提出，然后进行一次或多次的浓缩、盐析、水性离子交换或分子排阻色谱步骤。此外，重组多肽变异体可用亲和色谱加以纯化。最后，在最后的纯化步骤中可采用HPLC。用于表达编码多肽变异体的核酸的微生物细胞，可用任何常规的方法进行破碎，其中包括冻融循环、超声波处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。在上述的任一步骤中，可加入蛋白酶抑制剂如甲基磺酰氯(PMSF)以抑制蛋白水解，还可加入抗生素以防止不定污染物的生长。在另一个例子中，来自系统(该系统将重组多肽变异体分泌入培养基中)的上清液先用市售的蛋白质浓缩过滤器，如Amicon或MilliporePellicon的超过滤装置进行浓缩。在浓缩步骤之后，将浓缩物加至合适的纯化基质中。例如，合适的亲和基质可包括固定于适当载体上的用于蛋白质的配体、凝集素或抗体分子。或者，可采用离子交换树脂，例如具有侧链DEAE基团的基质或基底。合适的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其他在蛋白质纯化中常用的类型。或者，还可采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种不溶的、含有磺丙基或羧甲基的基质。磺丙基特别优选。最后，可采用一个或多个RP-HPLC步骤来进一步纯化多肽变异体组合物，其中采用疏水的RP-HPLC介质，如具有侧链甲基或其他脂族基团的氧化硅凝胶。以各种形式组合的、上述纯化步骤中部分或全部，也可被用于提供均质的重组多肽变异体。对以分泌多肽形式产生多肽变异体的酵母进行发酵，可大大简化纯化过程。由大规模发酵所产生的分泌的重组多肽变异体，可用Urdal等人，J.Chromatog.，296171(1984)中所描述的类似方法进行纯化。该文献描述了2个依次的PR-HPLC步骤，以便在制备性的HPLC柱上纯化重组的人IL-2。或者，可用诸如亲和色谱等技术来纯化多肽变异体。在重组培养物中合成的哺乳动物多肽变异体，其特征是存在非人的细胞组分(包括蛋白质)，其数量和性质取决于从培养物中回收多肽变异体所采用的纯化步骤。这些组分一般来自酵母、原核生物、或非人的高等真核生物，而且较佳地以无害污染程度的数量存在，其数量级小于约1％(重量)。H.多肽变异体的共价修饰多肽变异体的共价修饰形式被包括在本发明范围之内。它们可用化学合成或者酶切或化学切割多肽变异体(如果适用的话)而形成。多肽变异体的其他类型的共价修饰形式，可通过将多肽变异体的靶氨基酸残基与有机衍生剂(derivatizingagent)反应而被引入分子，其中该衍生剂能与选定的侧链或者N端或C端残基反应。半胱氨酰基，最常见地是与α-卤代乙酸化合物(和相应的胺)如氯代乙酸或氯代乙酰胺，反应从而形成羧甲基或羧基酰基甲基衍生物。半胱氨酰基还可通过与下列物质的反应而进行衍生溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑基)丙酸(α-bromo-β-(5-imidozoyl)propionicacid)、氯代乙酰磷酸盐、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯(高)汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、或氯代-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole)。组氨酰基可通过与二乙基焦碳酸(diethylpyrocarbonate)在pH5.5-7.0的反应而进行衍生，因为该试剂对组氨酰基侧链是较特异的。还可使用对溴苯甲酰甲基溴；该反应优选在0.1M二甲胂酸钠，pH6.0中进行。赖氨酰基和氨基端残基可与琥珀酸或其他羧酸的酸酐反应。与这些试剂的衍生反应可影响赖氨酰基的电荷。其他合适的、用于衍生含α-氨基残基的试剂包括亚氨酸酯如甲基吡啶酰亚胺酸(picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、chloroborohydride、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮、和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。精氨酰基可通过与一种或多种常规试剂的反应而被修饰，其中包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生需要反应在碱性条件下进行，因为胍功能团的pKa高。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团和精氨酸ε-氨基反应。酪氨酰基的特异性修饰，可通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷的反应而完成，尤其是为了将光谱标记引入酪氨酰基。最常见的是，用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来分别形成O-乙酰基酪氨酰基种类和3-硝基衍生物。酪氨酰基用125I或131I进行碘化，以便用于放射性免疫测定，其中上述的氯胺T法是合适的。羧基侧链(天冬氨酰基或谷氨酰基)的选择性修饰，可通过与碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R′，其中R和R′是不同的烷基)如与1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺的反应。此外，天冬氨酰基或谷氨酰基还可通过与铵离子的反应，被转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基通常被脱去氨基，分别形成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基。这些残基在中性或碱性条件下被脱去氨基。这些残基的脱氨基修饰在本发明范围之内。其他的修饰形式包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&amp;Co.，SanFrancisco，pp.79-86)，N端胺基的乙酰化和任何C端羧基的胺化。包含在本发明范围之内的、多肽变异体的另一种共价修饰形式，是改变多肽变异体的原始糖基化方式。改变”指删去一个或多个在多肽变异体中发现的碳水化合物部分，和/或增加一个或多个在多肽变异体中不存在的糖基化位点。多肽变异体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。“N-连接”指碳水化合物部分连在天冬酰胺残基的侧链上。天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸这样的三肽序列是将碳水化合物酶促连于天冬酰胺侧链的识别序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，在多肽中存在任何一种这样的三肽便可形成一个潜在的糖基化位点。“O-连接的”糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖等糖中的一种被连于羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基丝氨酸。在多肽变异体中添加糖基化位点，通常可通过改变氨基酸序列从而使其含有一个或多个上述的三肽序列(对于N-连接的糖基化位点而言)而实现。还可以通过在原始的多肽变异体中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基而实现改变(对于N-连接的糖基化位点而言)。为了方便起见，优选通过在DNA水平进行改变，而改变多肽变异体的氨基酸序列，尤其是通过使编码多肽变异体的DNA在预定的碱基处发生突变，从而产生会被翻译成所需氨基酸的密码子。DNA突变可用上述的方法进行。另一种增加多肽变异体上碳水化合物分子数目的方法，是将糖苷用化学或酶法偶联于多肽变异体。这些程序有优点，因为它们不需要在具有N-或O-连接糖基化能力的宿主细胞中产生多肽变异体。取决于所用的偶联方式，糖可连于(a)精氨酸和组氨酸；(b)自由的羧基；(c)自由的巯基，如半胱氨酸的巯基；(d)自由的羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基；(e)芳香残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO87/05330(1987年9月11日出版)和Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。将多肽变异体上存在的碳水化合物部分去除可以用化学法或酶法。化学法去糖基化，需要将多肽变异体暴露于三氟甲烷磺酸化合物或等价的化合物中。这种处理导致切除大部分或全部的糖，除了连接性的糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)，并且保留完整的多肽变异体。化学法去糖基化描述于Hakimuddin，等人，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)和Edge等人，Anal.Biochem，118131(1981)。将多肽变异体上的碳水化合物部分用酶法切除，可用Thotakura等人，Meth.Enzymol.，138350(1987)中所述的各种内切和外切糖苷酶而实现。如Duskin等人，J.Biol.Chem.，2573105(1982)所述，通过使用化合物衣霉素，可防止在潜在的糖基化位点发生糖基化。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。另一种多肽变异体的共价修饰包括，将多肽变异体连于各种非蛋白质的聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其方法描述于美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中。3.治疗组合物变异体的施用抗-CD18变异体的用途包括抗-Macl/抗嗜中性细胞以及抗-LFA-1应用。如果多肽变异体作为抗体，那么它可任选地融合于第二个多肽，并且可用抗体或融合蛋白来分离和纯化某种蛋白，该蛋白能被其从原料中结合出来，如CD11或CD18抗原。在另一例子中，本发明提供了一种体外或体内检测CD11a或CD18的方法，它包括将此处的抗-CD11a或CD18的抗体片段变异体，与怀疑含有CD11a或CD18的样品尤其是血清样品接触，然后检测是否发生了结合。此处的多肽变异体还适用于定量诊断分析，作为标准物或对照物用于制备的含有未知数量的多肽变异体的样品。将具有所需纯度的多肽变异体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington′sPharmaceuticalSciences，16版，Osol，A.，Ed.，)，以冻干的饼状物或水溶液形式进行混合，可以制得多肽变异体的用于特定病症的治疗制剂，以便储藏。可接受的载体、赋形剂或稳定剂，对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂如维生素C；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。典型地，用于本发明方法的多肽，是通过在室温、合适的pH和所需纯度下将其与生理上可接受的载体(即对接受者而言在所用的剂量和浓度下无毒的载体)而制备的。制剂的pH主要取决于具体的用途和变异体的浓度，但是一般在约3-8范围内。在pH约5-8的缓冲液中的制剂是一个合适的例子。用于此处的多肽变异体优选是无菌的。无菌可通过无菌的(0.2微米)膜过滤而方便地实现。多肽变异体一般以水溶液形式储存，但是冻干制剂(以便重组成(reconstitution))也是可以的。变异体组合物可按照良好的医疗实践进行配制、分剂和给药。在上下文中应考虑的因素包括待治疗的具体疾病、待处理的具体哺乳动物、各病人的临床症状、疾病原因、药剂给药部位、给药方法、给药日程安排、以及医疗人员已知的其他因素。“治疗有效量的”待施用多肽变异体由这些考虑因素所决定，而对于LFA-1拮抗剂变异体而言，是防止、改善或治疗LFA-1介导的疾病所需的最低数量，包括治疗类风湿性关节炎、减弱炎症应答、诱导对免疫刺激物的忍受度、防止产成移植物被宿主(或相反)排斥的免疫应答、或延长植入的移植物的生存时间。变异体的数量，最好低于会对宿主造成毒性或赋予宿主更明显的对感染易感性的数量。作为一般性的建议，每个肠胃外给药剂量中LFA-1拮抗剂变异体的初始药物有效量是约0.1-20毫克/千克病人体重/每天，而使用的典型LFA-1拮抗剂变异体初始范围是约0.3-15毫克/千克/天。但是，如上所述，LFA-1拮抗剂变异体的这些建议数量将用于大量治疗的具体情况。在选择合适的剂量和日程安排时的关键因素是如上所述的、所获得的结果。例如，对于最初治疗正发作和急性的移植排斥，或者在后期阶段治疗急性排斥(其特征是移植物功能突然下降)，可能需要较高的剂量。当随后的剂量小于100％初始剂量时，在每日剂量的基础上进行计算。因此，例如，如果剂量方案是每天注射2mg/kg/天，共2周；随后是每2周剂量为0.5mg/kg/天，共99天，那么以每天为基础计算，随后剂量约为1.8％初始剂量(即，2/天/100％＝0.5/14天/x％，x＝～1.8％)。较佳地随后的剂量小于约50％，更佳地小于约25％，更好地小于约10％，再好地小于约5％，最佳地小于约2％初始剂量的LFA-1拮抗剂变异体。根据具体疾病，为了获得LFA-1拮抗剂变异体的最有效结果，初始给药应尽可能地根据第一病征、诊断、脸色或疾病发生等情况，或在自身免疫疾病缓和过程中进行。较佳地，初始给药应在暴露于抗原前开始，如在移植的移植物的情况中。此外，当初始给药是在暴露于抗原之前或几乎同时时，最好随后给药所持续的时间长于初始给药的时间(尤其对于移植而言)，而且它可以是连续的、间歇维持剂量(对于病人的一生而言不必是连续的)。LFA-1拮抗剂变异体的优选日程表是，初始给药(即在不良的免疫应答发生之时或之前施用一定剂量，其给药频率不高于每天一次，并也包括通过输液连续地给药)以及随后的给药，是以间隔不超过约1周的频率进行的。更佳地，取决于具体的疾病以及尤其对于移植，最初每天给药在暴露于抗原(如移植物)或开始急性免疫应答(如自身免疫性疾病中)之后应持续至少约1周，较佳地至少约2周；而且在初始给药结束之后，随后剂量的施用应不少于每2周一次(较佳地为每2周一次)，并持续至少约5周、更佳地持续约10周。在另一优选例子中，尤其是当拮抗剂变异体是抗-CD11a或抗-CD18抗体的Fab或(Fab′)2时，初始给药在进行移植后约1天-4周，较佳地约1-3周，更佳地约2-3周时结束；而初始给药可在进行移植之前约1周至与移植几乎同时之间的时间内开始。多肽变异体可用任何合适的方式给药，如肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，而且如果需要用于局部免疫抑制治疗，可通过损伤内给药(包括灌注或在移植前将移植物与拮抗剂进行接触)。肠胃外输液包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。此外，LFA-1拮抗剂变异体施用用脉冲输液法进行给药，尤其是LFA-1拮抗剂变异体的剂量逐渐下降时。较佳地，这些变异体的给药是通过注射，最佳地是通过静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是短暂的还是长期的。此处的多肽变异体不必(但是可任选地)与一种或多种目前用于预防或治疗有关疾病的药物一起配制。例如，在类风湿性关节炎中，LFA-1拮抗剂变异体可与糖皮质类固醇一起给药。此外，T细胞受体肽治疗是防止出现自身免疫脑脊髓炎的临床病症的合适辅助疗法。Offner等人，科学，251430-432(1991)。对于移植，LFA-1拮抗剂变异体可与上述的免疫抑制剂(如环孢菌素A)一起给药或独立地给药，以便调控免疫抑制剂的作用。这些其他药剂的有效量取决于制剂中LFA-1拮抗剂变异体的数量、疾病或治疗的类型、和其他上述的因素。它们通常以相同的剂量进行使用，并通过上述的途径给药，并且占目前使用剂量的约1-99％。各种上述的自身免疫疾病，用LFA-1拮抗剂变异体，以在因疾病而处于攻击下，能诱导对自身抗原的免疫耐受性的方式进行治疗。在这方面，自身免疫疾病类似于宿主对移植物的排斥，它可用LFA-1拮抗剂变异体以类似的方式进行治疗。然而，与在移植前移植例子不同，在这些疾病中，病人早已开始对靶抗原的免疫应答，因此，需要用常规方法在这样的病人中先诱导并维持暂时的免疫抑制状态，如一般通过使用环孢菌素A或其他常规的免疫抑制剂(单独地使用或与LFA-1拮抗剂变异体一起使用)，或者监视病人直至发生一段时间的病情缓和(自身免疫应答的病理或功能指征的消失或大大减少)。较佳地，暂时的免疫抑制用常规疗法通过T细胞贫乏而加以诱导。然后使用LFA-1拮抗剂变异体，以防止撤去免疫抑制诱导剂时或当症状缓解会停止时发生反弹。或者，症状缓解的病人状况被置于严密监控突发(flare)病征之下，一旦表现出功能的或生物化学的突发情况，将立刻开始最初的给药方案并维持到突发消退。在该阶段中LFA-1拮抗剂变异体的施用就是本文其他地方所述的初始给药。在自身免疫疾病的情况下，初始给药维持约1-16周。之后，更低剂量的LFA-1拮抗剂变异体维持治疗方案，用与此处所述的基本相同的方式进行给药，以便改善移植物或宿主的排斥，尽管在某些情况下可能需要将随后的或维持性剂量维持时间延长得比移植更长。在本发明的一个例子中，如果已知抗原或含有抗原的组合物可导致自身免疫应答，那么就在初始LFA-1拮抗剂变异体给药及随后进行的拮抗剂变异体给药之后，将该抗原施用于病人(可任选地与IL-1和/或γ干扰素一起施用)，以便抑制产生针对该抗原的自身免疫应答，同时又最小限度地免疫抑制病人对其他抗原的应答。在初次用LFA-1拮抗剂变异体进行治疗时，病人最好被隔离，较佳地是在无菌环境中，如目前用于移植操作的环境。病人应没有任何感染。没有必要在维持给药阶段保持这样的条件，而且事实上这正是本发明的一个优点。就是说，在用维持剂量进行治疗时，病人能够对周围的抗原(移植物或自身抗原除外)产生基本正常的免疫应答。本发明特别适用于延长移植的移植物的生存情况并提高其耐受性。在手术后的关键阶段(最初的3个月)，可任选地用任何合适的方法系统地监测移植物的功能。一种这样的方法是使用99Tcm-高锝酸盐进行的放射性核素静脉内血管造影术，如Thomsen等人，ActaRadiol.，29138-140(1988)中所述。此外，本发明方法还适用于同时进行的多器官灌注和移植。Toledo-Pereyra和MacKenzie，Am.Surg.，46161-164(1980)。在某些情况下，会需要修饰移植物的表面使其具有带正电荷或负电荷的基团，如用合适的氨基酸或聚合物或将生理上可接受的带电荷的官能团连接上去。例如，对于血管，为了减少血液凝结，带负电荷的表面是合适的。在某些情况下，还会需要赋予表面疏水性或亲水性，如通过将例如苯丙氨酸、丝氨酸或赖氨酸等偶联于表面。一种对于表面修饰特别有效的免疫抑制剂是戊二醛。如上所述，在移植之前，可任选地施用有效量的LFA-1拮抗剂变异体，以便诱导对移植物的耐受性。可采用与移植后初始给药相同的剂量和日程表。此外，在移植之前，移植物可任选地如美国专利No.5,135,915所述的那样，与TGF-β组合物接触。该专利的公开内容在此引用作为参考。简而言之，这种接触可包括用组合物灌注移植物或与移植物一起温育，或将组合物施涂在移植物的一个或多个表面上。处理过程一般至少进行1分钟，较佳地为1分钟-72小时，更佳地为2分钟-24小时，这取决于制剂中TGF-β的浓度、待处理的移植物和制剂的具体类型等因素。还应注意，移植物可同时地或独立地用LFA-1拮抗剂变异体进行灌注。灌注可用任何合适的方法完成。例如，器官可通过某一提供恒定灌注压力的设备进行灌注，它具有位于泵和器官之间的压力调节器和溢流装置，比如1984年9月5日出版的DD213,134中所述的设备。或者，器官可通过密封门而被置于超压箱中，而灌注液通过泵被输送至超压箱中，其中该泵从储液器(reservior)抽取液体，并将用过的灌注液通过阀而送回储液器，如1984年11月21日出版的EP125,847中所述。在移植物被处理之后，可以长时间储存或立刻用于移植程序。如上所述，储存期可以延长，如通过在制剂中使用血液替代品(如全氟代化学乳剂)；或者通过用含有冷等渗剂和抗凝结剂的TGF-β制剂灌注移植物，然后用甘油灌注，从而可以冷冻取出的器官而不会破坏细胞(如1985年4月9日出版的JP60061501中所述)。此外，器官可用已知的灌注液(含有所述的TGF-β和/或LFA-1拮抗剂)进行保藏，同时器官可被冷却至冰冻温度，以便半永久地保藏器官而不造成细胞坏死(necrocytosis)，如美国专利No.4,462,215和4,494,385中所述。至于具体的心脏移植，Parent等人，Cryobiology，18571-576(1981)报道了，在移植前在5℃进行冷冠状灌注，可提高在植入最初阶段对同种移植物的保护。任何这样的程序，或其他的程序，在本发明范围之内，如果被认为是保存移植物所必需的。在移植之前，最好用不含TGF-β组合物的溶液洗涤移植物，如浸泡在生理盐水中或通过其他适合该目的的手段。不需要在移植之前去除LFA-1拮抗剂变异体。同样，在移植之前，宿主可任选地进行一次或多次供体特异性输血操作，以利于移植物的存活。另一种方法是在移植操作之前或之后，让宿主进行淋巴辐射。任何其他移植前的、对特定的移植接受者有益的程序，都可作为本发明方法的一部分而进行。4.制备抗体(其中变异体衍生自抗体)(i)原料和方法免疫球蛋白(Ig)及其某些变化形式是已知的，而且许多已经在重组细胞培养中被制备。例如参见美国专利No.4,745,055；EP256,654；EP120,694；EP125,023；EP255,694；EP266,663；WO88/035559；Faulkner等人，自然298286(1982)；Morrison，免疫学杂志123793(1979)；Kohler等人，美国科学院院报772197(1980)；Raso等人，癌症研究412073(1981)；Morrison等人，Ann.Rev，Immununol.2239(1984)；Morrison，科学，2291202(1985)；Morrison等人，美国科学院院报816851(1984)。重配的免疫球蛋白链也是已知的。参见例如美国专利No.4,444,878；WO88/03565；和EP68,763以及本文中提及的文献。本发明的多肽变异体中免疫球蛋白部分，可以从IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM中获得，但较佳地是从IgG-1或IgG-3中获得。(ii)多克隆抗体通常通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射有关的抗原和佐剂，在动物中产生多克隆抗体。可用双官能试剂即衍生剂(derivatizingagent)，如马来酰亚胺苯甲酰基硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-巯基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)，将有关的抗原偶联于在待免疫的动物中有免疫原性的蛋白质如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白抑制剂上。通过将1毫克或1微克肽或偶联物(分别对兔或小鼠)与3份体积的Freud完全佐剂混合，然后将溶液在多个部位进行皮内注射，使动物对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，用1/5至1/10最初数量的、Freud完全佐剂中的偶联物，在多个部位进行皮下注射，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物放血，分析血清的抗体效价。继续对动物进行加强免疫直至效价呈平台。较佳地，用偶联于不同的蛋白质和/或通过不同的交联剂偶联的、相同抗原的偶联物来加强免疫动物。偶联物还可在重组细胞培养物中以融合蛋白形式制造。而且，聚集剂如明矾适宜用来增强免疫应答。(iii)单克隆抗体可以从一群基本均质的抗体中获得单克隆抗体，即构成该群体的各抗体是相同的，除了可能存在少量天然存在的突变。因此，修饰语“单克隆”是指这样的特性即抗体不是不同抗体的混合物。例如可用Kohler&amp;Milstein，自然，256495(1975)首先描述的杂交瘤方法，或者用重组DNA方法(Cabilly等人，美国专利No.4,816,567)来制备单克隆抗体。在杂交瘤法中，按上述那样免疫小鼠或其他合适的宿主动物如仓鼠，以获得产生或能够产生抗体的淋巴细胞，该抗体可特异性地结合于免疫中所用的蛋白质。或者，在体外免疫淋巴细胞。然后用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体原则和实践(MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracice)，pp.59-103[AcademicPress，1986])。将这样制备的杂交瘤细胞进行接种，并在合适的培养基中生长，其中培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基一般含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质可防止HGPRT-缺陷型细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞是那些可有效地融合、支持选定的产生抗体的细胞稳定而高水平地表达抗体、并且对培养基如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞是鼠骨髓瘤细胞系如衍生自MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤的细胞系(可从SalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，California，USA获得)和SP-2细胞(可从美国典型培养物保藏中心，Rockiville，MarylandUSA获得)。已有描述将人骨髓瘤和鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，1333001；和Brodeur等人，单克隆抗体生产技术和应用，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。对在其中生长杂交瘤细胞的培养基，分析其是否产生了针对有关抗原的单克隆抗体。较佳地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，用免疫沉淀法或体外结合测试(如放射性免疫测定(RLA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))加以测定。单克隆抗体的结合亲和力可以用例如Munson&amp;Pollard，Anal.Biochem.107220(1980)中的Scatchard分析法加以确定。在鉴别出可产生具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可用有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并用标准方法进行生长(Goding，同上)。用于该目的的合适培养基包括例如，Dulbecco极限必需培养基(D-MEM)或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞还可在动物体内作为腹水瘤而生长。由亚克隆分泌的单克隆抗体可适当地从培养基、腹水液或血清中，用常规的免疫球蛋白纯化方法而分离出，如蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。用常规方法，可方便地分离出编码单克隆抗体的DNA，并加以测序(如使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可作为这种DNA的优选来源。一旦被分离，可将DNA置于表达载体中，然后再将表达载体植入宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或本来不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。在细菌中表达编码抗体的DNA方面的总结性文章，包括Skerra等人，Curr.OpinioninImmunol.，5256-262(1993)和Pluckthum，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。在另一例子中，用合适的抗原如CD11a、CD18、IgE或HER-2来选择合适的抗体或抗体片段，可从抗体噬菌体文库中分离出抗体或抗体片段，而这种噬菌体文库是用McCafferty等人，自然，348552-554(1990)中所述的技术而产生的。Clackson等人，自然，352624-628(1991)和Mark等人，分子生物学杂志，222581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人的抗体的过程。随后的出版物描述了，用链改组法(chainshuffling)(Mark等人，Bio/Technol.10779-783)、以及组合感染和体内重组等作为构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等人，核酸研究，212265-2266)的策略，产生高亲和性(nM范围)的人抗体。因此，对于分离“单克隆”抗体，这些技术是传统的单克隆抗体杂交瘤技术的有力替代技术。DNA还可被修饰，如用人重链和轻链恒定区的编码序列替换同源的鼠序列(Cabilly等人，同上；Morrison等人，美国科学院院报，816851(1984))，或者将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接于免疫球蛋白的编码序列。典型地，这样的非免疫球蛋白多肽可替换抗体的恒定区，或者替换抗体的一个抗原结合位点的可变区，从而产生嵌合的两价抗体，该抗体具有一个对一种抗原特异的抗原结合位点以及另一个对不同抗原有特异性的抗原结合位点。嵌合的或杂合的抗体，还可用蛋白质化学合成中的已知方法在体外进行制备，其中包括那些使用交联剂的方法。例如，可用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键而构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂包括亚胺硫羟酸盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚胺盐(butyrimidate)。对于诊断用途，本文中衍生自抗体的变异体一般被可检测的部分标记。可检测的部分可以是任何能够直接或间接地产生可检测信号的物质。例如可检测的部分可以是放射性同位素如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光化合物，如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、或萤光素；放射性同位素标记，如125I、32P、14C、或3H；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。任何本领域中已知的、单独地将多肽变异体偶联于可检测部分的方法都可使用，其中包括Hunter等人，自然144945(1962)；David等人，生物化学131014(1974)；Pain等人，J.Immunol.Meth.40219(1981)；和Nygren，组织化学和细胞化学杂志30407(1982)中所述的方法。(iv)人源化抗体和人抗体使非人的抗体人源化的方法是本领域中公知的。一般，人源化的抗体具有一个或多个来自非人来源并被引人其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基一般被称为“引入的”残基，它们通常来自“引入的”可变区。人源化过程可基本上按Winter及同行的方法(Jones等人，自然，321-522-525；Riechmann等人，自然332323-327；Verhoeyen等人，科学，2391534-1536)，通过用啮齿动物CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列而进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly，同上)，其中大体小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所替换。实践中，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中某些CDR残基或可能某些FR残基，被啮齿动物抗体中类似部位的残基所替换。选择用于制备人源化抗体的人可变区(包括重可变区和轻可变区)，对于减少抗原性非常重要。根据所谓的“最匹配”法，啮齿动物抗体可变区的序列，可针对已知的人可变区序列的完整文库进行筛选。与啮齿动物序列最接近的人序列，被作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，1512296；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901)。另一种方法使用特定的框架，该框架来自某一具体轻链或重链亚组的、所有人抗体的共有序列。这种相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，美国科学院院报，894285；Presta等人，J.Immunol.，1512623)。此外，重要的是被人源化的抗体应保留对抗原的高亲和性和其他有利的生物特性。为了实现该目的，在一种优选方法中，通过用亲代序列和人源化序列的三维模型，分析亲代序列和各种概念的人源化产物，从而制备人源化抗体。这些免疫球蛋白的空间模型是通常已有的并且是本领域技术人员所熟悉的。已有计算机程序可阐述和显示所选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些显示，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能起的作用，即分析会影响候选免疫球蛋白结合抗原的能力的残基。用这种方法，可从共有区和引入序列中选择出FR残基，并合并FR残基，从而实现所需的抗体特性，如更高的对靶抗原的亲和性。一般，CDR残基直接地而且最显著地涉及对抗原结合产生影响。或者，现在可以产生转基因动物(如小鼠)，一旦免疫，它们能够在没有内源免疫球蛋白产生的情况下产生所有种类的人抗体。例如，已有报道，在嵌合的种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失，会导致完全抑制内源抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因群(genearray)转入这种种系突变的小鼠中，会导致在抗原攻击时产生人的抗体。参见例如Jakobovits等人，美国科学院院报，902551-255(1993)和Jakobovits等人，自然362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year.InImmuno.，733(1993)。还可从噬菌体展示文库中产生人抗体(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227381；Marks等人，J.Mol.Biol.，222581)。(v)双特异性抗体双特异性抗体(Bispecificantibodies，BsAbs)是具有对至少2种不同抗原的结合特异性的抗体。双特异性抗体可衍生自全长的抗体或抗体片段(如F(ab′)2双特异性抗体)。用于制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。传统的全长双特异性抗体的产生方法，是以两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达为基础的，其中两种链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，自然，305537-539)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机组配(assortment)，所以这些杂交瘤(四瘤(quadromas))产生潜在的、由10种不同抗体分子构成的混合物，而其中只有一种分子有正确的双特异性结构。对正确分子进行纯化，通常是通过亲和性色谱步骤完成，类似的方法公开于WO93/08829(1993年5月13日出版)和Traunecker等人，EMBOJ.，103655-3659(1991)。根据一种不同的而更佳的方法，具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区被融合于免疫球蛋白的恒定区序列。这种融合优选是与免疫球蛋白重链的恒定区(包括至少部分铰链区、CH2和CH3区)融合。优选的是，在至少一种融合体中存在含有轻链结合所必需位点的第一重链恒定区(CH1)。编码免疫球蛋白重链融合体(以及如果需要，免疫球蛋白轻链)的DNA，被插入不同的表达载体，然后共转染入适当的宿主生物体。当用于构建的3种多肽链的比例不相等才有最佳产率时，这样可极灵活地调节实际情况中3种多肽片段的相互比例。但是，当至少2个多肽链为等比例时会导致高产率时，或当比例并不特别重要时，也可以将编码2种或全部3种多肽链的编码序列插入一个表达载体。在这种方法的一个优选例子中，双特异性抗体由在一个臂上有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)所构成。已发现这种不对称结构有助于从不需要的免疫球蛋白链混合物中分离出所需的双特异性化合物，因为仅在双特异性分子的一半上存在免疫球蛋白轻链，这提供了一种便利的分离方法。这种方法公开于1994年3月3日出版的WO94/04690。对于产生双特异性抗体的进一步细节，可参见例如Suresh等人，MethodsinEnzymology，212210(1986)。双特异性抗体包括交联的即“异共轭(heteroconjugate)”抗体。例如，异共轭体中的一个抗体可被偶联于亲和素，而另一抗体被偶联于生物素。这样的抗体已经被提出，例如用于将免疫系统细胞导向有害细胞(美国专利No.4,676,980)以及用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。异共轭抗体可用常规的交联方法制备。在本领域中合适交联剂是已知的，并与多种交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980中。用抗体片段产生双特异性抗体的技术，在文献中也有描述。例如，双特异性抗体可用化学连接方法制备。Brennan等人，科学，22981(1985)描述了一种方法，其中完整的抗体被蛋白酶解切断，产生F(ab′)2片段。这些片段在二硫酚复合剂亚砷酸钠存在下被还原，从而稳定邻位的二硫酚并防止形成分子间的二硫键。产生的Fab′接着被转变成硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。Fab′-TNB衍生物中的一种然后通过用巯基乙胺还原而被再转变成Fab′-巯基，再与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物相混合，从而形成BsAb。产生的BsAb可用作选择性地固定酶的试剂。最近的进展已便于从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，这些片段然后可被化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.，175217-225(1992)描述了产生一种完全人源化的BsAbF(ab′s)2分子。每个Fab′片段都是独立地由大肠杆菌所分泌，然后在体外进行直接的化学偶联以形成BsAb。这样形成的BsAb能够结合过度表达HER2受体的细胞和正常的人T细胞，并引发人细胞毒淋巴细胞对人乳房肿瘤靶目标的裂解活性。还可参见Rodrigues等人，Int.J.Cancers(Suppl.)745-50(1992)。用于从重组细胞培养物中直接制造和分离BsAb片段的各种不同技术，已有描述。例如，已经用亮氨酸拉链(zipper)产生了双特异性F(ab′)2异二聚体。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。通过基因融合，将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连于两种不同的抗体的Fab’部分。抗体同二聚体在铰链区被还原以形成单体，然后再次被氧化以形成抗体异二聚体。Hollinger等人，美国科学院院报(USA)，906444-6448(1993)描述的“二体(diabody)”技术提供了另一种制造BsAb片段的方法。这些片段含有一重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们通过一接头相连，该接头过短以致不能使相同链上的两个区之间发生配对。所以，一个片段上的VH和VL区被迫与另一片段上互补的VL和VH区配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了另一种使用单链Fv(sFv)二聚体而制造BsAb片段的方法。参见Gruber等人，J.Immunol.1525368(1994)。这些研究者设计的抗体含有第一个抗体的VH和VL区，它们通过一个25氨基酸残基的接头与第二个抗体的VH和VL区相连。重新折叠的分子可结合荧光素和T细胞受体，而且可重新介导那些表面上共价地连有荧光素的人肿瘤细胞发生裂解。5.抗体变异体的用途变异型抗体可用于感兴趣抗原的诊断分析，如是否在特异性的细胞、组织或血清中产生。变异型抗体可按上述的相同方式进行标记和/或固定在不溶性的基质上。在抗原结合分析的一个例子中，一种可与抗原结合的抗体组合物被固定于不溶性基质上，让测试样品与固定的变异型抗体组合物接触以吸附抗原，然后被固定的抗原用对该抗原特异的变异型抗体进行接触，用单一标记物如各种荧光团等进行测定。通过确定每种单一标记物的存在与否和/或数量，可以确定抗原的数量和相对比例。本发明的变异型抗体还可用于被动性免疫病人。变异型抗体还可用于从重组细胞培养物或天然来源中亲和纯化感兴趣的抗原。合适的用于抗原及其变异型抗体的诊断方法，其本身都是人们众所周知的。除了在下面实施例(其中候选变异体被测试以确定是否有合适的生物活性和更长的半衰期)中所描述的生物分析方法之外，竞争法、夹心法和立体抑制免疫测定技术都是可使用的。竞争性法和夹心法采用相分离步骤作为整体方法的一部分，而立体抑制分析是在单一反应混合物中进行的。一般而言，用相同的方法来分析抗原及与抗原结合的物质，尽管根据待分析物质的分子量可能某些方法是优选的。因此，待测试(分析)物质在此处被称为“分析物”，而不论其原来的状态是抗原或是变异型抗体；而结合于分析物的蛋白质被命名为“结合配偶体”，而不论它们是抗体、细胞表面受体、还是抗原。对于抗原或其变异型抗体的分析方法都采用一种或多种下列试剂标记的分析物类似物、固定的分析物类似物、标记的结合配偶体、固定的结合配偶体和立体共轭体。标记的试剂还被称为“示踪物”。对于某些分析方法，需要将试剂加以固定。固定化需要将结合配偶体从在溶液中保持游离的分析物中分离出。其完成常规地是通过在分析程序之前固定结合配偶体或分析类似物，如吸附于水不溶性基质或表面(Bennich等人美国专利No.3,720,760)，或者通过共价偶联(如用戊二醛进行交联)，或者在此之后通过固定配偶体或类似物(如免疫沉淀)。其他分析方法，已知的竞争性法或夹心法，都是十分成熟的并被广泛地用于商业性的诊断产业。竞争性法依赖于，示踪类似物与测试样品分析物对共同的结合配偶体上有限数目结合位点的竞争能力。结合配偶体通常在竞争之前或之后呈未溶解形态，然后从未结合的示踪物和分析物中分离出结合于结合配偶体的示踪物和分析物。这种分离是通过倾析(当结合配偶体是预先未溶解时)，或通过离心(当结合配偶体在竞争性反应之后被沉淀时)。测试样品分析物的数量，与用标记物质数量测得的、结合示踪物的数量成反比。制作对于已知数量分析物的剂量-反应曲线，然后与测试结果比较以定量地确定测试样品中的分析物数目。当酶被用作可检测标记物时，这类分析法被称为ELISA法。另一种竞争性分析被称为“均相”分析，它不需要进行相分离。在这种方法中，制备和使用酶与分析物构成的共轭物，这样当抗-分析物结合于分析物时，便因抗-分析物的存在而改变了酶活力。在该例子中，抗原或其免疫活性片段通过双官能的有机桥连物而偶联于酶(如过氧化物酶)。对共轭物进行选择，以便与抗-多肽一起使用，这样抗-多肽的结合便可抑制或增加标记的酶活力。这种方法本身被广泛使用，名称是EMIT。在立体位阻法的均相分析中，使用立体共轭物。这些共轭物是通过将低分子量的半抗原共价连于小的分析物上而合成的，这样针对半抗原的抗体基本上就不能与抗-多肽同时结合共轭物。在这种分析方法中，存在于样品中的分析物可结合抗-多肽，从而允许抗-半抗原结合于共轭物，这样造成共轭半抗原性质的改变，如当半抗原是荧光团时造成荧光变化。夹心法特别适用于确定多肽变异体或多肽变异体的抗体。在依序夹心分析中，用固定化的结合配偶体来吸附测试样品分析物，然后通过洗涤除去测试样品，结合的分析物被用于吸附标记过的结合配偶体，再将结合的物质与其余的示踪物分开。结合的示踪物的数量与测试样品分析物的数量直接成正比。在“同步”夹心分析中，在加入标记的结合配偶体之前，不分离测试样品。使用单克隆抗体作为一种抗体并使用多克隆抗体作为另一种抗体的依序夹心分析，可用于测定样品中的抗原活性。上述内容仅仅是代表性的、分析多肽变异体和变异型抗体的诊断方法。目前及以后开发的、用于确定这些分析物的其他方法也被包括在本范围之内，其中包括上述的生物分析。下面的实施例用于阐述目的而不起限制作用。在说明书中提及的文献的公开内容都明确地以引用方式参考。实施例1方法质粒构建在本实施例中用于构建Fabs(以下称为Fab)的模板质粒pH52，如Cunningham等人，科学，2431330-1336(1989)所述，衍生自质粒pB0475。将位于F1起点两侧的2个BamHI位点从PB0475中去除，然后用编码抗-CD18FabH52的DNA(形式OZ)(Eigenbrot等人，蛋白质(Proteins)，1849-62)，通过EcoRV和SphI位点替换编码人生长激素的DNA。这样，pH52含有编码抗-CD18FabH52的DNA(形式OZ)、轻链和重链的STII信号肽、碱性磷酸酶启动子区域和M13辅助噬菌体区域，以及氨苄青霉素抗性。用下列寡核苷酸，通过pH52的Kunkel诱变(Kunkel，美国科学院院报，82488-492(1985))构建Fab变异体寡聚V1A5′GTGACCGTGCCTCACCAGAGCTTGGGCAC3′(SEQIDNO12)将Ser195-Ser196改为His195-Gln196寡聚V1B5′TGGCACCCTCCCCTAAGAACTCGAGCATGATCAGCAACACACCGGCCCTGGGC3′(SEQIDNO13)将Ser127-Ser-Lys-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Thr-Ala-Ala139(SEQIDNO14)改为Ser127-Pro-Lys-Asn-Ser-Ser-Met-Ile-Ser-Asn-Thr-Pro-Ala139(SEQIDNO15)寡聚V1C5′TGGCACCCTCCAAATCGAGCATCACAGCGGCCCT3′(SEQIDNO16)将Ser127-Ser-Lys-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Thr137(SEQIDNO17)改为Ser127-Lys-Ser-Ser-Ile-Thr137(SEQIDNO18)寡聚V25′TGGTGACCGTGATCTCGAGCCACTTGGGCCAGCAGACCTACATC3′(SEQIDNO19)将Val193-Pro-Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Thr-Gln203(SEQIDNO20)改为Val193-Ile-Ser-Ser-His-Leu-Gly-Gln-Gln203(SEQIDNO21)氨基酸残基编号依照Kabat等人，同上，NIHPubl.No.91-3242，Vol.I，pp.647-669(1991)中所述的编号体系。Fabv1掺入了寡聚物V1A和V1C；Fabv1b掺入了寡聚物V1A和V1B；Fabv2掺入了寡聚物V2。选择编码Fabv1、Fabv1b和Fabv2的质粒，并用双脱氧核苷酸测序法(SequenaseTM方案，UnitedStatesBiochemical)检查DNA序列。F(ab′)2构建物的制备是通过，将编码IgG1铰链区的DNA(其后为′亮氨酸拉链′)插入H52重链恒定区的C末端。插入的氨基酸序列如下CPPCPAPELLGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER(SEQIDNO22)另一套Fab形式是以Fabv1b为基础的，即具有更长半衰期的变异体，使用的是下列寡核苷酸寡聚V1D5′TCGAGCATGATCTCTAGAACACCGGCCC3′(SEQIDNO23)将Asn136改为Arg136寡聚V1E5′GCCTCACCAGAACCTAGGCACCAAGACCTACATCTG3′(SEQIDNO24)将Ser197改为Asn197以及将Gln203改为Lys203寡聚V1F5′GCCTCACCAGAACTTAAGCGACGGAAAGACCTACATCTGC3′(SEQIDNO25)将Gln196-Ser-Leu-Gly-Thr-Gln-Thr204(SEQIDNO26)改为Gln196-Asn-Leu-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr204(SEQIDNO27)寡聚V1F5′GCCTCACCAGAATATTACAGATGGCAAGACCTACATCTGC3′(SEQIDNO28)将Gln196-Ser-Leu-Gly-Thr-Gln-Thr204(SEQIDNO29)改为Gln196-Asn-Ile-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr204(SEQIDNO30)Fabv3掺入了寡聚物V1D；Fabv14掺入了寡聚物V1E；Fabv5掺入了寡聚物V1F；以及Fabv6掺入了构建物V1G。表达编码变异体的DNA对于每种变异体，将质粒DNA转化入大肠杆菌。然后将转化子置于含5微克/毫升羧苄青霉素的LuriaBroth(LB)平板上，在37℃温育过夜。将单菌落接种于5毫升[LB+5微克/毫升羧苄青霉素]中，在37℃生长6-7小时。然后将5毫升培养物加至位于2升带挡板的烧瓶中500毫升AP5极限培养基中，并在37℃生长16小时。AP5极限培养基的制备如下每1升加入1.5克葡萄糖(SigmaTMG-7021)、2.2克工业制造的酪蛋白氨基酸(DifcoTM0231-01-0)、0.3克鉴定的酵母提取物(DifcoTM0127-01-7)、0.19克无水硫酸镁或0.394克MgSO4·7H2O(SigmaTMM2773)、1.07克氯化铵(SigmaTMA9434)、0.075克氯化钾(SigmaTMP5405)、4.09克氯化钠(SigmaTMS3014)、120.0毫升1M三乙醇胺pH7.4，适量至1.0升Super-QTM水，以及1M三乙醇胺pH7.4(由133.21毫升三乙醇胺、Liquid(SiamaTMT1377)和950毫升Super-QTM水构成，用HCl(MallinkrodtTM2612)调至pH7.4，适量至1.0升Super-QTM水)。通过0.1微米的SealkleenTM过滤器进行过滤，然后储存于2-8℃。保质期为6个月。细胞在1L离心瓶中于3000rpm下离心30分钟，弃去上清液，将沉淀细胞冰冻1小时。将沉淀物重新悬浮于10毫升冷TE缓冲液(10mMTRIS、1mMEDTA，pH7.6)中，并加入100微升苯甲脒(Sigma)。重新悬浮的沉淀物在冰上搅拌1小时，在18,000rpm上离心15分钟，倾倒出上清液并保持在冰上。然后，让上清液通过蛋白质G-SepharoseTMFastFlow(Pharmacia)柱(该柱预先让10毫升TE通过柱而加以平衡)。再用10毫升TE缓冲液洗涤柱，然后用2.5毫升100mM乙酸将Fab洗脱在含0.5毫升TRIS(pH8.0)的管子中。在Centricon-30TM(Amicon)离心器上将洗脱物浓缩至0.5毫升，将2毫升磷酸盐缓冲液加至浓缩的洗脱物中，再将形成的混合物浓缩至0.5毫升。进行SDS-PAGE以确定已产生了蛋白质。在抗-CD11/CD18Fab变异体和F(ab′)2抗体片段的纯化程序中所用的分析方法用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和两种不同的高效液相色谱(HPLC)，来分析纯化方法中每个步骤中获得的产物。使用的HPLC包括反相色谱和阳离子交换色谱(在WATERSTMHPLC系统中进行)。反相色谱是在维持于50℃的反相PLRP-STM4.6×50mm柱、8毫米颗粒大小(PolymerLaboratories，Shropshire，UK)上进行。用逐渐增加的线性梯度(从31％B至41％B)来洗脱蛋白质。缓冲液A含有0.1％在去离子水中三氟乙酸，而缓冲液B含有0.1％在HPLC级乙腈中的三氟乙酸。流速维持在2毫升/分钟，在214纳米处监测蛋白质曲线。阳离子交换色谱分析是在维持于50℃的、Bakerbond羧基-嗍(sulfon)(CSX)TM50×4.6mm柱(J.T.BakerPhillipsburg，NJ)上进行。用用逐渐增加的线性梯度(从pH6.0至pH8.0)，在2毫升/分钟下洗脱蛋白质，检测波长为280纳米。缓冲液A含有16mMHEPES/PIPES/MES中的每一种，pH6.0；而缓冲液B含有16mMHEPES/PIPES/MES中的每一种，pH8.0。对于分离不同的Fab变异体，采用从25％B至56％B的线性梯度，时间22分钟。对于分离拉链-F(ab′)2和F(ab′)抗体片段，线性梯度为40％B至100％B，时间22分钟。SDS-PAGE分析在预制的NovexTM凝胶(Novex，SanDiego，CA.)上进行。蛋白质用Morrissey银染法进行染色。Morrissey，Anal.Biochem.，117307-310(1981)。纯化抗-CD11/CD18抗体片段和Fab变异体抗-CD11/CD18抗体片段以及不同的Fab变异体，用相同的抽提和纯化法进行分离。抽提冰冻的细胞沉淀物(100克)，在室温下重悬浮于120mMMES缓冲液(pH6.0，含5mMEDTA)(5毫升缓冲液/克细胞沉淀物)，通过微流化器(Microfluidizer)(MicrofluidicsCorporation，Newton，MA)3次而被完全破碎。匀浆被调节至含0.25％(v/v)聚乙烯亚胺(PEI)，然后通过离心(7280×g，30分钟，4℃)除去固体碎片。ABX色谱含有抗体片段的上清液用纯水稀释至导电率为2.5毫西门子(millisiemen)，在0.22微米过滤器上过滤(Suporcap-50TM，GelmanSciences，AnnArbor，Michigan)，然后上样于在50mMMES/5mMEDTA二钠pH6.0(缓冲液A)中平衡过的1.6×9.5厘米BakerbondABX柱(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。流出液在280纳米处进行UV监测。在上样后，用缓冲液A洗涤柱，直到UV轨迹返回至基线。用20倍柱体积的梯度(在缓冲液中的从0-100mM硫酸铵)洗脱抗体片段。洗脱组分按上面分析方法章节中所述，在阳离子交换柱上进行分析，并相应合并。SPSepharose高效(SPHP)色谱为了注射，ABX的合并物用水稀释至导电率小于4mS，然后上样于用50mMMOPS缓冲液pH6.9平衡过的1.6×9.2厘米SPHP柱(PharmaciaBiotechInc.，Piscataway，NJ)。通过用20倍柱体积的线性梯度(在25mMMOPS缓冲液中的从0-200mM乙酸钠)实现分离。洗脱组分按上面分析方法章节中所述，通过CSXHPLC和SDS-PAGE进行分析，并相应合并。配制含有抗体片段的SPHP的合并物，用Amicon搅拌器和YM10滤膜(Amicon，Inc.Beverly，MA)浓缩至5毫克/毫升。纯化的浓缩抗体样品，通过在SephadexTMG25(PharmaciaBiotechInc.，Piscataway，NJ)柱的凝胶渗透色谱，将缓冲液更换成磷酸盐缓冲液(PBS)。内毒素测定用Limulus变形细胞裂解测试法(AssociatesofCapeCodInc.，WoodsHole，MA)进行内毒素测定。将含有小于2内毒素单位(Eu)/毫克蛋白质的样品用于药物动力学研究。纯化抗-CD11/CD18F(ab′)2抗体片段作为亮氨酸拉链F(ab′)2变异体[拉链-F(ab′)2]，F(ab′)2片段最初通过ABX色谱进行纯化。该构建物的构建，是通过在H52重链的铰链区后增加亮氨酸拉链区。在纯化之后，通过胃蛋白酶切除亮氨酸拉链，然后用下述的SPHP和PhenylToyopearlTM色谱纯化F(ab′)2。拉链-F(ab′)2抗体片段的抽提和ABX色谱拉链-F(ab′)2抗体片段的抽提和ABX色谱，与上述Fab抗体片段变异体一样进行。拉链-F(ab′)2抗体片段的胃蛋白酶消化用胃蛋白酶处理ABX纯化的拉链-F(ab′)2以去除分子的亮氨酸拉链部分，产生F(ab′)抗体片段。在Amicon搅拌器上浓缩由ABX纯化的样品至5mg/ml，然后用pH3.5的100mM柠檬酸钠以1∶3.5稀释。在该溶液中加入溶解在pH3.5100mM柠檬酸钠中的胃蛋白酶，胃蛋白酶与蛋白质之比为1∶1.2。室温4小时后，用10％NaoH将混合物的pH调高至pH6.4。对用胃蛋白酶处理过的拉链-F(ab′)2抗体片段进行SPHP色谱从亮氨酸拉链区和不需要的抗体片段中纯化出F(ab′)2抗体片段，是通过上述用于Fab抗体片段变异体的SPHP色谱完成的。对SPHP-纯化过的F(ab′)2抗体片段进行PhenylToyopearlTM色谱通过添加固体硫酸铵，调节SPHP-纯化过的F(ab′)2合并物使硫酸铵浓度为1.5M。调节后的合并物再上样于用缓冲液A(1.5M硫酸铵，50mM乙酸钠，pH5.4)平衡过的PhenylToyopearlTM650(Tosohaas，Montgomeryville，PA)1.6×10厘米柱上。采用的是20倍柱体积的梯度，即在50mM乙酸钠pH5.4(缓冲液B)中的从70％缓冲液A至100％0.15M硫酸铵。洗脱组分按上面分析方法章节中所述，通过反相色谱和CSXHPLC和SDS-PAGE进行分析。配制F(ab′)2抗体片段和内毒素测定纯化的F(ab′)2抗体片段的配制，如上述的Fab抗体片段变异体一样进行。在内毒素测定后，含有小于2Eu/毫克蛋白质的样品用于下述的药物动力学研究。在静脉内给药后，抗-CD11/18构建物在小鼠中的药物动力学研究这个5种人源化huH52抗-CD18抗体片段(构建物)在小鼠中的单剂量药物动力学研究的目的，是为了确定通过恒定区氨基酸的改变，是否会影响抗体片段的非特异性清除。在24小时内从雄性CD1小鼠中收集血清样品，用ELISA法测定人抗-CD18的血清浓度。被研究的抗-CD18抗体片段，来自上述的由大肠杆菌产生的重组人源化单克隆Fab抗体片段。研究了Fab片段和2个Fab′亚基被2个二硫键连接在一起的构建物。最后，通过改变恒定区的氨基酸，构建原始Fab的3种新的形式。对于这些构建物的进一步描述，参见下面的研究设计表。构建物的抗原结合位点针对白细胞表面上CD11/CD18糖蛋白复合体的CD18亚基。这些抗体片段是黑猩猩和人特异性的；因此，在小鼠中的血清药物动力学信息，提供了这些片段的非特异性清除情况。因为预计在该研究中是线性药物动力学，所以选择的2毫克/千克的单剂量水平，而不是多剂量水平。研究设计表aa每个组别由20只雄性小鼠构成；每只小鼠接受2毫克/千克剂量。在雄性CrlCD-1(ICR)BRVAF/Plus小鼠(约20-30克)中，研究5种抗体构建物的药物动力学。5个组别，每个组别由20只小鼠构成，通过尾静脉而接受2毫克/千克的静脉内丸药(bolus)剂量。在给药后5和30分钟，1、2、4、8、12、16、20和24小时，采集血液样品。收获血清，如下用MAC-1捕获ELISA法测定抗体片段的浓度96孔的微量滴定板用鼠抗-CD18单克隆抗体包被过夜。在4℃温育过夜之后，用ELISA洗涤缓冲液洗涤滴定板3次，用ELISA稀释液封闭1小时。ELISA洗涤缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)/0.05％聚山梨醇酯TM20。该缓冲液的制备是，对于每1升，将50毫升20×PBS/1.0％聚山梨醇酯TM20(通过将160克氯化钠、4.0克氯化钾、22.6克磷酸氢二钠和4.0克磷酸二氢钾溶解在玻璃蒸馏的水或去离子水中，再加入10.0毫升聚山梨醇酯TM20[SigmaTMP-1379或等价物]，适量至1000毫升，用0.22微米或更小的过滤器进行灭菌过滤而获得的混合物)，和适量至1.0升的蒸馏水或去离子水混合。然后储存在室温下。保质期是从制备之日起2周。ELISA稀释液是PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨醇酯TM20/0.01％ThimerosalTM/1mM氯化钙/1mM氯化镁。该稀释液的制备是，对于每1升，将5.0克牛血清白蛋白(ArmourTMN0068或等价物)、50毫升20×PBS/1.0％聚山梨醇酯TM20/0.2％ThimerosalTM(通过将160克氯化钠、4.0克氯化钾、22.6克磷酸氢二钠和4.0克磷酸二氢钾溶解在玻璃蒸馏的水或去离子水中，再加入10.0毫升聚山梨醇酯TM20[SigmaTMP-1379或等价物]和2.0克ThimerosalTM[SigmaT-5125或等价物]，适量至1000毫升而获得的混合物)、0.1％(v/v)氯化钙(GenentechTMA3165)、0.01％(v/v)氯化镁(GenentechTMA3167)，和适量至1.0升的蒸馏水或去离子水混合。然后储存在2-8℃。保质期是从制备之日起1个月。在封闭之后，再用ELISA洗涤缓冲液洗涤滴定板3次。接着可溶性MAC1(如Berman等人，J.Cell.Biochem.，52183-195所述)，被从浓介质中捕获出来，用表达截短的CD11b/CD18异二聚体的CHO细胞加以调理(conditioned)。在2小时温育期之后，用ELISA洗涤缓冲液洗涤滴定板6次，然后加入100微升待测试的鼠血清样品或含有同源的重组人抗-CD18Fab的标准物。鼠血清样品先在ELISA稀释液中进行1/10稀释，然后再1/4稀释成为样品稀释液；从这种最初的1/40稀释液中取出100微升。样品稀释液是在ELISA稀释液中的10％瑞士Webster鼠血清。在第二个2小时温育期之后，再用ELISA洗涤缓冲液洗涤滴定板6次，然后加入100微升针对人Fab的辣根过氧化物酶-偶联的F(ab′)2。在室温下温育1小时后，如上用ELISA洗涤缓冲液洗涤滴定板，然后向每个孔加入100微升含2.2mmol/L邻苯二胺(OPD)和0.012％(v/v)过氧化氢(H2O2)的磷酸盐缓冲液，pH7.2。当颜色完全显现时，用每孔100微升4.5mol/L硫酸来终止反应。孔内含物的吸光度用SLTLabinstruments的自动滴定板读数仪在492纳米处测量，并减去405纳米处的背景吸光度。根据非线性参数的最小二乘算法，通过4参数曲线拟合程序来归纳数据。血清浓度vs时间数据，用非线性曲线拟合程序加以分析，随后评估药物动力学参数。D′Argenio和Schumitzky，ADAPTIIUser′sGuide，BiomedicalSimulationsResource，UniversityofSouthernCalifornia，LosAngeles，Release2，1990。用双区室模型(two-compartmentmodel)来表征5个组别的血清浓度对时间的数据。对于一级模型参数和计算出的药物动力学参数，参见表2。双区室模型拟合曲线叠加在数据上，并显示于图1A和1B。数据清单列于表3。对于所有组别，中心区室的体积接近血浆体积。表2在将2毫克/千克构建物给小鼠服用后确定出的、一级和二级药物动力学模型参数估计值</tables>a用公式V＝剂量/∑Ai计算出的中心区室体积。bKe是与材料从中心区室被消除有关的速率常数。cKcp是与材料从中心区室转移至外周区室有关的速率常数。dKpc是与材料从外周区室转移至中心区室有关的速率常数。e重量归一化后的血清清除率。ft1/2α和t1/2β是与每个指数阶段有关的初期和后期半衰期。g最大观察浓度的时间。h最大观察浓度。l根据配置函数∑Ai估算出的0时间的浓度。j在血清浓度对时间曲线下的剂量归一化面积。k持续时间。表3数据清单对于2毫克/千克人抗CD18构建物的浓度对时间数据a浓度(微克/毫升)a浓度数据为一个样品/小鼠bLTS＝低于测试灵敏度(组别1和3-5为0.13微克/毫升；组别2为0.06微克/毫升)结果结果示于图1A和1B，其中图1A显示了全部5种构建物在0-5小时内的药物动力学情况，而图1B显示了全部5种构建物在0-25小时内的药物动力学情况。最初的(或α-相)半衰期与最终的(β-相)半衰期一样发生改变。Fabv1B变异体的清除率为80毫升/小时/千克，这比双二硫化合物(Fab′)2高约3倍。Fabv1、Fab和Fabv2的清除率比Fabv1B高约3倍，比双二硫化合物(Fab′)2高约6倍，分别为173、189和190毫升/小时/千克。原始Fab的有效分子量为49kD，其清除率为189毫升/小时/千克。Fab形式1、1B和2都具有与原始Fab相类似的分子量，但形式1B从血清中被清除的速度慢2倍。因此，改变Fab恒定区的氨基酸序列可影响清除。在β-相半衰期中所见的效果表明，即使是2个最不成功的变异体1和2，也有可检测的效应，尽管该效应不足以在所有持续时间内都显著增加。序列表(1)一般信息(i)申请人Genentech，Inc.(ii)发明名称具有更长半衰期的变异多肽(iii)序列数目31(iv)通信地址(A)收信人Genentech，Inc.(B)街道460PointSanBrunoBlvd(C)城市SouthSanFrancisco(D)州California(E)国家USA(F)邮编94080(v)计算机可读形式(A)记录介质类型3.5inch，1.44Mb软盘(B)计算机IBMPC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件WinPatin(Genentech)(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Lee，WendyM.(B)登记号00,000(C)参考/案卷号P0932PCT(ix)通讯信息(A)电话415/225-1994(B)传真415/952-9881(C)电传910/371-7168(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO1HisGlnAsnLeuSerAspGlyLys158(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO2HisGlnAsnIleSerAspGlyLys158(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO3ProLysAsnSerSerMetIleSerAsnThrPro151011(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度98氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO4AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSer151015LysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer657075LeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysArgVal9598(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)长度98氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO5AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSer151015ArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerAsn657075PheGlyThrGlnThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysThrVal9598(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)长度98氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO6AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSer151015ArgSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer657075LeuGlyThrGlnThrTyrThrCysAsnValAsnHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysArgVal9598(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)长度98氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO7AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSer151015ArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys202530AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAla354045LeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer505560GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSer657075LeuGlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSer808590AsnThrLysValAspLysArgVal9598(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)长度107氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO8ArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAsp151015GluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsn202530AsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsn354045AlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAsp505560SerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSer657075LysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThr808590HisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGly95100105GluCys107(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)长度105氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO9GlnProLysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSer151015GluGluLeuGlnAlaAsnLysAlaThrLeuValCysLeuIleSer202530AspPheTyrProGlyAlaValThrValAlaTrpLysAlaAspSer354045SerProValLysAlaGlyValGluThrThrThrProSerLysGln505560SerAsnAsnLysTyrAlaAlaSerSerTyrLeuSerLeuThrPro657075GluGlnTrpLysSerHisArgSerTyrSerCysGlnValThrHis808590GluGlySerThrValGluLysThrValAlaProThrGluCysSer95100105(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)长度100氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO10AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerPro151015LysAsnSerSerMetIleSerAsnThrProAlaLeuGlyCysLeu202530ValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSer354045GlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGln505560SerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProHis657075GlnSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAshValAsnHisLys808590ProSerAsnThrLysValAspLysArgVal95100(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO11HisGlnSerLeuGlyThrGln157(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO12GTGACCGTGCCTCACCAGAGCTTGGGCAC29(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)长度53碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO13TGGCACCCTCCCCTAAGAACTCGAGCATGATCAGCAACACACCGGCCCTG50GGC53(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO14SerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAla151011(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO15SerProLysAsnSerSerMetIleSerAsnThrProAla151013(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO16TGGCACCCTCCAAATCGAGCATCACAGCGGCCCT34(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO17SerSerLysSerThrSerGlyGlyThr159(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)长度6氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO18SerLysSerSerIleThr156(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)长度44碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO19TGGTGACCGTGATCTCGAGCCACTTGGGCCAGCAGACCTACATC44(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO20ValProSerSerSerLeuGlyThrGln159(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO21ValIleSerSerHisLeuGlyGlnGln159(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)长度45.氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO22CysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyArgMetLys151015GlnLeuGluAspLysValGluGluLeuLeuSerLysAsnTyrHis202530LeuGluAsnGluValAlaArgLeuLysLysLeuValGlyGluArg354045(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO23TCGAGCATGATCTCTAGAACACCGGCCC28(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO24GCCTCACCAGAACCTAGGCACCAAGACCTACATCTG36(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)长度40碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO25GCCTCACCAGAACTTAAGCGACGGAAAGACCTACATCTGC40(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO26GlnSerLeuGlyThrGlnThr157(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO27GlnAsnLeuSerAspGlyLysThr158(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)长度40碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO28GCCTCACCAGAATATTACAGATGGCAAGACCTACATCTGC40(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO29GlnSerLeuGlyThrGlnThr157(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO30GlnAsnIleSerAspGlyLysThr158(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO31ValIleSerSerHisLeuGlyGln158权利要求1.一种感兴趣多肽的变异体，该感兴趣多肽是在肾脏中被清除的而且不含IgG的Fc区，其特征在于，该变异体含有IgGFc区的补救受体结合表位，而且该变异体具有比感兴趣多肽更长的体内半衰期。2.如权利要求1所述的变异体，其特征在于，感兴趣多肽含有Ig结构域或Ig样的结合域，该结构域不是CH2结构域。3.如权利要求2所述的变异体，其特征在于，该表位被包含在Ig结构域或Ig样的结合域中。4.如权利要求3所述的变异体，其特征在于，Ig结构域或Ig样的结合域是CH1区。5.如权利要求3所述的变异体，其特征在于，该表位取自Fc区的一个或二个环，并被转至Ig结构域或Ig样的结合域。6.如权利要求5所述的变异体，其特征在于，该表位取自Fc区的CH2结构域，并被转至Ig结构域或Ig样结合域的CH1、CH3或VH区域，或一个以上这样的区域。7.如权利要求5所述的变异体，其特征在于，该表位取自Fc区的CH2结构域，并被转至Ig结构域或Ig样结合域的CL区域或VL区域，或同时这2个区域。8.如权利要求3所述的变异体，其特征在于，感兴趣多肽是Fab、(Fab′)2、二体、Fv片段、单链Fv片段、或受体。9.如权利要求8所述的变异体，其特征在于，感兴趣多肽是LFA-1拮抗剂。10.如权利要求9所述的变异体，其特征在于，感兴趣多肽是抗LFA-1抗体的Fab或(Fab′)2。11.如权利要求10所述的变异体，其特征在于，感兴趣多肽是抗-CD18Fab或抗-CD18(Fab′)2。12.如权利要求11所述的变异体，其特征在于，它是人的或人源化的。13.如权利要求12所述的变异体，其特征在于，该表位含有序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。14.如权利要求13所述的变异体，其特征在于，还含有HQSLGTQ(SEQIDNO11)。15.如权利要求13所述的变异体，其特征在于，还含有HQNLSDGK(SEQIDNO1)。16.如权利要求13所述的变异体，其特征在于，还含有HQNISDGK(SEQIDNO2)。17.如权利要求13所述的变异体，其特征在于，还含有VISSHLGQ(SEQIDNO31)。18.如权利要求1所述的变异体，其特征在于，该表位含有序列HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、HQSLGTQ(SEQIDNO11)或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，以及PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。19.如权利要求18所述的变异体，其特征在于，该表位被融合于感兴趣多肽。20.如权利要求19所述的变异体，其特征在于，感兴趣多肽是生长激素或神经生长因子。21.编码权利要求1所述变异体的核酸。22.含有权利要求21所述核酸的可复制载体。23.含有权利要求21所述核酸的宿主细胞。24.一种产生多肽变异体的方法，其特征在于，它包括在培养基中培养权利要求23所述的宿主细胞，以及从宿主细胞培养物中回收变异体。25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，变异体是从培养基中回收的。26.一种多肽变异体，它不是Fc，其特征在于，它含有序列HQNLSDGK(SEQIDNO1)、HQNISDGK(SEQIDNO2)、或VISSHLGQ(SEQIDNO31)，以及PKNSSMISNTP(SEQIDNO3)。27.一种制备多肽变异体的方法，其特征在于，它包括改变在肾脏中被清除的而且不含IgGFc区的感兴趣多肽，从而使其含有IgGFc区的补救受体结合表位，并且具有更长的体内半衰期。28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，改变步骤是通过定点诱变、盒式诱变或PCR诱变进行的。29.一种制备具有更长体内半衰期的多肽变异体的方法，其特征在于，它包括(1)鉴别出IgG分子Fc区上的补救受体结合表位的序列和构象；(2)改变从肾脏被清除的而且不含IgGFc区的感兴趣多肽，使其含有所鉴别的结合表位的序列和构象；(3)测试步骤(2)中改变的多肽是否有比感兴趣多肽更长的体内半衰期；和(4)如果该多肽没有更长的体内半衰期，进一步改变感兴趣多肽的序列以包含所鉴别的结合表位的序列和构象，并测试是否有更长的体内半衰期，直到获得更长的体内半衰期。30.一种治疗LFA-1介导的疾病的方法，其特征在于，给需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求9所述的变异体。31.一种治疗LFA-1介导的疾病的方法，其特征在于，给需要这种治疗的病人有效量的权利要求12所述的变异体。全文摘要改变在肾脏中被清除而且在原始形式下不含IgGFc区的多肽,使其含有IgGFc区的补救受体结合表位,从而使其具有更长的循环半衰期。文档编号C07K14/48GK1186517SQ9619434公开日1998年7月1日申请日期1996年3月28日优先权日1995年4月14日发明者L·G·普雷斯塔,B·R·斯内德克申请人:基因技术股份有限公司