专利名称：细胞有丝分裂发生和运动发生的肽拮抗剂和它们的治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的化合物及包含这些新化合物的药物组合物，它们在控制或者治疗增殖性疾病(如癌)，抗肿瘤生长和/或肿瘤转移及牛皮癣，控制或者治疗炎症、过敏、自身免疫、病毒和心血管疾病中是有用的药剂。这些新的化合物具有抑制识别所有细胞受体和胞质转导物内几种包含磷酸酪氨酸的基元的独特特性，这种抑制是通过存在于胞质转导物和不同信号转导过程中的其它效应物蛋白中的广谱SH2域和对衔接子转导物Grb2的SH2域的高度特异亲和性实现的，衔接子转导物Grb2是有丝分裂发生和运动发生途径的关键组分，这一最后的活性导致侵入和转移。本发明也涉及这些化合物的产生方法和使用这些化合物进行治疗的方法。
背景技术：
从受体到核的胞质信号转导途径以细胞外的生长因子与它们的包埋在细胞膜上的受体的相互作用开始，并且和细胞内复杂的生物化学反应链有关，这种生物化学过程还不完全了解，其能将信号传递到核以便刺激适当的生物反应。在引起有丝分裂发生的信号转导中，激活的受体以某种方式将信号转送到胞质或膜锚定的蛋白质，如在这种机制中表现出关键作用的蛋白质，即p21ras蛋白质。接下来，这些蛋白质将信号以多种途径进一步转导到细胞核。已经在几种人类肿瘤中检测到了激活的ras原癌基因。激活的频率十分高；例如，激活ras基因发生在30％的所有人类促红细胞生成的肿瘤和90％多的外分泌的胰腺的肿瘤上。在一般情况下，原癌基因导致正常蛋白质的产生(象酪氨酸激酶受体和转导物)，这些物质和细胞的信号转导紧密相关。几种癌基因是突变的或过量表达的形式或是染色体转移的嵌和基因，这些基因编码在信号转导机制中起作用的蛋白质，并引起组分激活的信号蛋白质的增加，这些蛋白质引起无限制的细胞生长，结果导致肿瘤形成。人们正在从细胞内信号转导的各组分的性质和它们的用途方面阐明细胞内信号转导，公开了一套越来越多的具有吸引力的靶，这些靶成为抗肿瘤疗法概念上新的探讨。
从激活的受体到细胞核的信号转导似乎和几种在可能的多种途径中相互作用，或多或少地相互连接的蛋白质有关。在相关的主要分子过程类型中，特别有关的是1)蛋白质酪氨酸磷酸化作用(激酶活性)；2)识别作用(特异性蛋白质域之间的物理联系)；3)蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化作用(激酶活性)；4)特异性酶(磷酸酯酶)的脱磷酸作用，这是因为酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸的磷酸化作用也都是通过反作用调节的。这些过程在信号转导途径的网中可以发生不只一次。在这些主要的相互作用中，在肿瘤探讨上具有吸引力的靶是磷酰化的酪氨酸域和″胞质转导物″的识别。
第一步，生长因子(例如EGF，FGF，PDGF，HGF，…)通过和其受体的相互作用而激活其受体(一种横越细胞膜的蛋白质)，导致了受体分子间的相互接近。确实，受体分子彼此接近，使得在细胞内以胞内域的水平上发生相互磷酸化，这种磷酸化过程是通过一个分子的激酶域在邻近分子的胞质部分的几个酪氨酸残基上进行操作而完成的，或通过相关的酪氨酸激酶进行磷酸化。一旦受体的胞质区在酪氨酸上有几个磷酸化的位点，分子的识别可以在这些磷酸化的位点和几种其它蛋白质的适当的区之间发生。
这些蛋白质是″胞质转导物″；确实，它们使信号转导途径继续，这种信号转导途径连接结合所说的受体的配基和控制基因转录的细胞核因子的调节作用，因而最终使生物反应(如细胞增值)发生(J.Schlessinger和A.Ullrich，神经元，1992，9，383；J.Schlessinger，生物化学发展趋势1993，18，273.)。它们都具有命名为SH2(Src同源性2)的结构域，在一级结构上具有高度的同源性，甚至在三级结构上是非常保守的。这些短的(大约100个氨基酸)SH2结构域在结合包含蛋白片断的磷酸酪氨酸的非催化区中起作用(T.Pawson和G.D.Gish，细胞，1992，71，359)。最近几年对SH2结构域的结构和作用的兴趣与研究迅速增加。对SH3结构域(Src同源3)已经产生了类似的兴趣，其特征不在功能上，而是其在胞质转导物中经常伴随SH2结构域的存在。
SH3结构域是具有高度同源性的非催化区，并且此区对富含甘氨酸-脯氨酸的区域具有亲和性。认为SH2和SH3区在信号转导的分子内识别过程中具有关键作用。含有蛋白质的SH2的一个组包含具有内源酶活性的蛋白质，因此赋予了除SH2结构域之外的催化域(激酶区或其它)，如蛋白质Src、Abl、Syc、PTPlC、PLCg、GAP、vav。
另一个组包括的SH2含有缺乏任何已知的催化域的蛋白质，这种SH2似乎具有吸收赋予催化性质的受体的其它蛋白质的衔接子功能。例如，p85在激活的(磷酸化的)受体和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)之间提供了连接。另一个有关的衔接子实施例是Grb2(生长因子受体结合蛋白2)，其连接磷酰化受体(EGF-R，PDGF-R，HGF-R，…)和在p21ras上具有鸟嘌呤核苷酸交换活性的蛋白质，激活与有丝分裂发生直接相关的系统(如ras)。其它的包含衔接子的SH2似乎是Shc、Crk、Nck.。一些所提到的转导物(特别是Grb2)和受体(如HGFR)上的这些相关的结合位点(特别是包含HGF受体的Tyr 1356的位点)似乎和细胞运动发生、侵入及最终的转移强烈相关。
特定的SH2结构域能够识别磷酰化的酪氨酸、所说的受体或其它一些中间蛋白质的侧翼序列。相当保守的结构的核心元件是反平行β-片层(是位于两个α-螺旋之间的夹层)和一个从此夹层突出出来的小的β-片层；X光和NMR研究澄清了这种结构(G.Waksman，D.Kominos，S.C.Robert son，N.Pant，D.Baltimore，R.B.Birge，D.Cowburn，H.Hanafusa，B.J.Mayer，M.Overduin，M.D.Resh，C.B.Rios，L.Silverman和J.Kuriyan，自然，1992，358，646；G.Waksman，S.E.Shoelson，N.Pant，D.Cowburn和J.Kuriyan，细胞，1993，72，779；M，Overduin，C.B.Rios，B.J.Mayer，D.Baltimore和D.Cowburn，细胞，1992，70，697)和与结合肽的复合物形式(类似在Src SH2结构域的情况下)。无论如何，几个转导物中环和转角不同，这可能涉及识别的特异性。分析磷酰化受体与胞质转导物的相互作用，我们发现1)几种受体中，每一种都和相同的蛋白质连接；和2)它们中的每一种都以一定程度的区域专一性地与蛋白质连接，即对于几种受体，含有转导物的不同的SH2结合受体胞质域的不同磷酸酪氨酸残基(J.A.Escobedo，D.R.Kaplan，W.M.Kavanaugh，C.W.Turck和L.T.Williams，Mel.细胞生物学，1991，11，1125；A.Kashishian，A.Kazlauskas和J.A.Cooper，EMBO J.，1992，11，1373；C.-H.Heldin，EMBO J.，1992，11，4251)。这种高的特异性源于围绕磷酸酪氨酸的序列，特别是在下游，对于每个转导物都产生不同的识别基元(W.J.Fantl，J.A.Escobedo，G.A.Martin，C.W.Turck，M.del Rosario，F.McCormick和L.T.Williams，细胞，1992，69，413)。已经完成了磷肽文库以便分析几种胞质转导物的序列特异性，并确定了相关的共有序列(Z.Songyang，S.E.Shoelson，M.Chaudhuri，G.Gish，T.Pawson，W.G.Haser，F.King，T.Roberts，S.Ratnof sky，R.J.Lechleider，B.G.Neel，R.B.Birge，J.E.Faj ardo，M.M.Chou，H.Hanafusa，B.Schaffhausen和L.C.Cantley，细胞，1993，72，767)。
的确，对于肝细胞生长因子(HGF)的受体，这是初始培养中肝细胞强大的促细胞分裂原和体内肝脏再生的主要介体(P.M.Comoglio，肝细胞生长因子-扩散因子(HGF-SF)和C-Met受体。I.D.Goldberg和E.M.Rosen编辑(Basel)，瑞士Birkauser Verlag，1993，131-165)，所有胞质转导物的相互作用似乎集中在和两个相近的磷酸酪氨酸残基有关的同一个“超位点”上(C.Ponzetto，A.Bardelli，Z.Zhen，P.dalla Zonca，F.Maina，S.Giordano，A.Graziani，G.Panayotou和P.M.Comoglio，细胞，1994，77，261)。
生长因子受体结合蛋白质2(Grb2)是一个比较小的衔接子，只由两侧有两个SH3结构域的SH2结构域构成，并且Grb2和另一个蛋白质体内形成复合物(SoS)，通过它的SH3结构域和位于SoS的C-末端结构域的一段富含脯氨酸的31个氨基酸的序列结合，这样其能够和ras系统相互作用。Grb2及与SoS以复合物形式存在的SH2，能够通过它的SH2结构域与不同受体或转导物的特异性酪氨酸磷酰化位点联系。另外，胞质蛋白质Shc的磷酰化形式能结合Grb2的SH2结构域(S.E.Egan，B.W.Giddings，M.W.Brooks，L.Buday，A.M.Sizel和和R.A.Weinberg，自然，1993，363，45)。在HGFR上证明了Grb2/SoS复合物与Ras系统的关连(A.Graz iani，D.Gramagl ia，P.dalla Zonca和P.M.Comoglio，J.Biol.Chem.，1993，268，9165)，并且其它受体(EGFR，IRS-1)的类似情况也有力地支持了这一点，并且在不同生物品种中也是如此(J.Schlessinger和A.Ullrich，神经元，1992，9，383 J.Schlessinger，Trends Biochem.Sci.，1993，18，273P.Polakis和F.McCormick，生物化学杂志，1993，268，9157)。另外，已知蛋白质SoS为″交换子″、鸟嘌呤核苷酸分离的刺激物(GDS)，并且在其和Grb2复合的活性形式中，能够促进GDP从失活Ras-GDP复合物中快速释放(C.F.Albright，B.W.Giddings，J.Liu，M.Vito和R.A.Weinberg，EMBO J.，1993，12，339)。因此p21Ras可以迅速地获得GTP以形成活性Ras-GTP，这样其可以充当将信号向下游传递给核的Ras系统的效应物(通过MAP激酶的级连)。锚定在膜上的复合物Ras-GTP是活性形式，其充当效应物，以便将有丝分裂发生信号传递到核。交换子(GDS或SoS)活性增加它的水平，而GAP(GTPase激活蛋白质)活性降低其水平。生长因子受体的刺激作用影响这两种调节酶，并且它们的活性依赖于其它调节因子。这两种调节酶(GDS和GAP)在不同细胞类型中对Ras系统具有不同的影响。确实，上述提到的Ras系统的调节作用需要适于锚定在膜上的p21Ras的成熟形式(C.J.Marshall，科学，1993，259，1865)。在这些情况中，细胞培养结果已经证实了Ras系统是一个预防有关癌转化的有价值的靶(J.B.Gibbs，A.Oliff，和N.E.Kohl，细胞，1994，77，175)。在继续信号转导途径上(Ras的下游)，Ras系统的活性形式(即是Ras GTP)和其自己的效应物的N-末端相互作用(这种效应物最近鉴定为丝氨酸/苏氨酸激酶Raf)，这样通过″促细胞分裂原激活的蛋白质激酶(MAPs)″开始了磷酸化作用的级联系统。事实上，Raf导致直接的磷酸化作用，因而使MAP激酶激酶激活，这种酶反过来激活MAPK，导致核中转录作用(转录因子AP1)的激活(M.S.Marshall，生物化学发展趋势，1993，18，250)。
发明概述已知在一种更长序列之内包含基元YpVNV的肽能抑制胞质转导物Shc或Grb2或p85和激活的(磷酰化)HGF受体之间的结合(国际专利申请PCT/EP94/01943)。我们的新发现如下1)此肽从磷酰化酪氨酸开始，缩短了从羧基末端(即从庚肽)到四肽的下游序列，对转导物Grb2的亲和性意外地增加，因此对Grb2-HGF受体复合物形成的抑制作用也增加。确实，这是一个意外的结果，因为从有关SH2识别作用的文献可知磷肽的亲和性随着长度的减少(例如从12到5个氨基酸)而降低(甚至60倍)(G.B.Cohen等，细胞，1995，80，237；S.E.Shoelson等，EMBO J.，1993，12，795；E.Piccione等，生物化学，1993，32，3197)，并且在一种情况下，认为亲和力需要至少5个氨基酸长度(W.J.Fantl等，细胞，1992，69，413)。
2)磷酰化酪氨酸的氨基基团的酰化很大程度上增加了所说的活性。这些酰基基团可以是甲酰基、乙酰、丙酰、或更为复合的一种(如氨酰基、或生物素-6-氨基己酰、或肉豆蔻酰、辛酰、环己乙酰基团)，这些复合酰基提供用于提高细胞穿入的亲脂性锚。从我们所查阅的文献可知，几乎所有的用于SH2识别作用的磷肽都在N-末端含有一个游离的氨基基团。
3)所说的肽能够以很高的亲和性结合并阻断Grb2和几种其它的转导物(如Shc，p85，Src，GAP，PLCg，Zap70，Syc，Stat)，阻止它们通过其SH2结构域和无论哪种酪氨酸磷酰化受体结合，这些受体如HGF-R、PDGF-R、EGF-R、它们的截短的或突变的的含有细胞质域(如erbB2)的形式、Tpr-MET、MET家族的其它成员(如SEA和RON)、IRS-1、酪氨酸磷酰化转导物或衔接子(如bcr-Abl，Shc，Src，Syc，Stat)。因为其它序列已表明是高度特异性的，所以这些肽的这种没有预料的特性是前所未有的。
4)另外发现了甚至比四肽基元更短的肽(包含磷酸酪氨酸)或模拟(mimetic)类似物(如对膦酰(phosphono)甲苯基丙氨酸、对膦酰二氟甲苯基丙氨酸)保持了它们抑制Grb2-SH2与磷酰化HGF受体相结合的活性，这是完全未预料到的。绝对没有预料到短至三肽的磷肽具有SH2识别的高度亲和性。已知在其它序列上，膦酰甲苯基丙氨酰衍生物是磷酸酯酶抗性的，但弱于相应的磷酸盐类似物很多(6-10倍)(S.M.Domchek等，生物化学，1992，31，9865)；我们意想不到地发现所说的特异性肽的膦酰甲苯基丙氨酰类似物与抑制Grb2-SH2识别的亲本磷酸盐大约等效。
5)也发现了磷酸酪氨酸形式的肽或它们的模拟类似物(其中磷酸酪氨酸由对膦酰甲苯基丙氨酸或对膦酰二氟甲苯基丙氨酸替代)是细胞运动性的强烈的抑制物，并且除了作为抗肿瘤剂之外，作为抗转移剂也是有用的。
尽管不希望受到理论束缚，但这种抑制作用很可能是竞争抑制的结果，其中磷肽或其模拟物与磷酰化受体或SH2结构域相同结合位点的磷酰化转导物竞争。这一结合的抑制可能有效地将TK受体或磷酰化转导物从此效应物蛋白质所利用的信号转导途径中分开。因为本领域已知这种策的主要弊端是这一阻断点可能被过多的信号转导途径忽略，不得不考虑本发明化合物空前的抑制几种类型的SH2识别的能力，作为有效降低失调的信号转导网络的关键因子。
因此，本发明的目的是提供小分子化合物，该小分子化合物能够干扰含有磷酸酪氨酸的受体或转导物与其它锚定在膜上的SH2结构域或对生长和运动/扩散信号关键的胞质转导物的缔合，因此能够减少如在肿瘤和牛皮癣中发现的失控的增值的水平，并且能够抑制与转移极其相关的细胞侵入。
本发明的新化合物已显示出特别抑制Grb2转导物与HGF受体、其它生长因子受体(例如EGFR，PDGFR，erbB2/neu，FGFR)及其它酪氨酸磷酰化的转导物(例如Src，bcr-abl，Stat，IRS-1)磷酸酪氨酸停靠位点的结合。另外，所说的化合物也以不同的效力抑制含有磷酸酪氨酸停靠位点的蛋白质与含有其它SH2的转导物(例如p85-PI3K、PLCg、Src、Shc、Stat、Zap70、Abl、Syc、PTPlC)相结合。发明详述在一个优选的方面中，本发明包括以盐或非盐形式存在的具有下式所示结构的肽和模拟肽(peptidomimetic)化合物
其中Y是H、R-C(＝O)NH-，这里R可以是H、CH3、低级烷基或长链烷基、线性支链的或环状的、或者N-取代的氨基酸或肽残基，优选的是R-C(＝O)-Gly、R-C(＝O)-Thr-、R-C(＝O)-Ala-Thr(其中R是如上所限定的)，较长的N-取代的肽残基含有上述的基元；X是-OPO3H2，，或其模拟物，该模拟物优选地选自(但不限于)下列基团-CH2PO3H2、-CF2PO3H2、-CHFPO3H2、-CH2SO3H、-CF2SO3H、-CHFSO3H、-SPO3H2、-OPSO2H2，、-SPSO2H2、-OPS2OH2、-OP(CH3)O2H、-SP(CH3)O2H、-OP(CH3)SOH、-OP(CF3)O2H、-OP(CHF2)O2H、-SP(CH3)O2H、-SP(CHF2)O2H或它们的低级烷基酯；A是低级烷，优选地是CH3-、CH3CH2-、(CH3)2CH-、(CH3)3C-、CH3CH2CH(CH3)-、(CH3)2CHCH2-；B是H-、CH3-或低级烷基；Z是H、-COOH、-CONHR2、-COR2，这里R2＝H、-NK2、-NHR3，这里R3是-CH3低级烷(优选地是CH2CH(CH3)2)、或以羧酸形式或酰胺化形式存在的氨基酸或二肽(优选地是-Val-NH2、-Val-OH、-Val-Lys-NH2、-Val-Lys-OH、-Val-Lys(eN-Ac)-NH2、-Val-Lys(eN-Ac)-OH、-Val-Ser-NH2、-Val-Ser-OH、-Val-G ln-OH、-Val-Gln-NH2)。
低级烷基一般指C1-C6烷基，例如C1-C4烷基，如甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、s-T基、戊基或己基。长链烷基可以是，例如C7-C30烷基、如C10-C30烷、 C12-C30烷基、C18-C30烷基或C20-C30烷基；或C7-C25烷基、C10-C25烷基、C10-C20烷基、C10-C18烷基或C12-C25烷基。不论哪一种情况、烷基基团可以是线性支链的或环状的。
基团-OPO3H2的功能性衍生物是此基团的结构类似物，当其作为基团X加入到化学式(I)中时，以与-OPO3H2本身相同的方式或类似的方式发挥作用。
在本发明中，所说的″功能性衍生物″是磷酰衍生物，其模拟基团-OPO3H2(当其作为X基团加入到通式(I)中时)的作用。在限定Y时限定的N-取代的氨基酸或肽残基，合适的是式R-C(＝O)-Z-的残基，其中Z是单氨基酸残基或两个或多个氨基酸残基链，例如二肽或三肽，或寡肽。Z的例子包括-Gly-、-Thr-和-Ala-Thr-。在限定Y时包含N-取代的氨基酸或肽部分的多肽残基是更长链的肽残基，这种肽残基在其链中包含N-取代的部分，例如上文限定的式R-C(＝O)-Z-。
也包括含有上文提到的基元的更长的肽。
按照本发明，典型的氨基酸侧链应该是L构型的，已经确定在每一个位置的D类似物具有大大降低的活性。确实，含有未磷酰化的酪氨酸的所提及的磷肽或它们的模拟物形式也包括在本专利中，因为它们在体内是磷酰化的，所以作为实际上活性形式的前体。
本发明的代表性化合物且特别要求的化合物如下(Ac代表乙酰基)FCE 28405Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2-Ex.4(SEQ ID No.1)FCE 28782Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys(Ac)-NH2-Ex. 5(SEQ ID No.2)FCE 28539Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH-Ex.6(SEQ ID No.3)FCE 28540Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.1(SEQ ID No.4)FCE 28404H2O3PO-Ph-CH2-CH2-CO-Val-Asn-Val-OH-Ex.7FCE 29021Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2-Ex.3FCE 29022Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2-Ex.8FCE 29018Ac-Tyr(PO3H2)-Val-NHCH2CH2CONH2-Ex.9FCE 28615Ac-Phe(CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2-Ex.10(SEQ ID No.5)FCE 28995Ac-Phe(CH2SO3H)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.12(SEQ ID No.6)FCE 29406Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2-Ex.11FCE 29408Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.2(SEQ ID No.7)FCE 28785Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Ser-NH2-Ex.13(SEQ ID No.8)FCE 28883Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Gln-NH2-Ex.14(SEQ ID No.9)FCE 291286-生物素酰氨基-己酰基-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.20(SEQ ID No.10)FCE 29091Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.18(SEQ ID No.11)FCE 29116Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.18(SEQ ID No.12)FCE 29145Ac-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.19(SEQ ID No.13)FCE 28702Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Gln-Ser-NH2(EGFR/Y1068)-Ex.15(SEQ ID No.14)FCE 28703Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Ile-Glu-NH2(IRS1/Y895)-Ex.16(SEQ ID No.15)FCE 28737Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ile-Lys-NH2-Ex.17(SEQ ID No.16)FCE 29267Ac-Tyr(PO3H2)-Gly-Asn-NH2-Ex.21FCE 29268Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Gly-Asn-NH2-Ex.22FCE 29409Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Gln-NH2-Ex.23FCE 29410Ac-Tyr(PO3H2)-Val-D-Asn-NH2-Ex.24FCE 29411Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Hse-NH2-Ex.25FCE 29413Ac-Tyr(PO3H2)-D-Val-Asn-NH2-Ex.26FCE 29414Ac-Tyr(PO3H2)-Abu-Asn-NH2-Ex.27FCE 29415Ac-Tyr(PO3H2)-terLeu-Asn-NH2-Ex.28FCE 29421Ac-Tyr(PO3H2)-Ala-Asn-NH2-Ex.29FCE 29475Ac-Tyr(PO3H2)-Aib-ASn-NH2-Ex.30
FCE 29402 CH3-(CH2)12-CO-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.31(SEQ ID No.17)FCE 29403 CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.32(SEQ ID No.18)FCE 29404 CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.33(SEQ ID No.19)FCE 29405 C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2-Ex.34(SEQ ID No.20)FCE 29407 CH3-CO-CH2-CH2-CO-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2-Ex.35本发明的化合物在中性pH的溶液中具有化学稳定性，并且根据所说的肽的性质，通过加入酸或碱可以形成药学上可接受的盐。本发明将包括所有这些形式。合适的盐包括碱盐，如碱金属盐(例如钠或钾盐)和铵盐；和酸加成盐，如盐酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐。
可以根据标准的方法，如Escobedo，J.A.，等，分子细胞生物学111125-1132(1991)或Turck，C.W.肽研究5156-160(1992)描述的那些方法(例如，利用受保护的预磷酰化酪氨酸残基)合成本发明的肽。另外可以通过未保护的酪氨酸并在固相或液相进行肽延长之后，将其磷酰化，而制备所说的磷肽。
具体地说，使用通过液相或固相方法(这些方法对本领域技术人员是已知的)制备所说的肽(Schroeder等，″肽″，Vol.I，学院出版社1965，或Bodanszky等，″肽合成″，国际科学出版社，1966，or McOmie(编辑)″有机化学中保护基团″，Plenum出版社，1973，或Barany等，″肽分析，合成，生物学″2，第1章，学院出版社，1980)。这样，本发明包括制备一种本发明的肽的方法，这种方法包括由单一氨基酸和/或两个或多个氨基酸残基预先形成的肽化学合成所说的肽。
当希望制备其中的酪氨酸残基是磷酰化的肽时，可以在固相合成期间引入预磷酰化的受保护的酪氨酸残基，或当此肽吸附在固体支持物上时，可以将受保护的预先形成的肽的酪氨酸残基磷酰化。
在固相合成时，可以使用任何手动或自动肽合成仪，并可以以分段的方式在树脂支持物上利用Boc或Fmoc策略装配此肽。
用作起始材料的所有试剂是市售的或可以按照本领域已知的方法产生和纯化。
采用在0.05％三氟乙酸中的线性梯度的乙腈经反向高效液相色谱在C18-Vdac柱上纯化去保护的肽，并通过低压冻干分离此肽。获得的所有磷肽为多水合的聚三氟乙酸。在所有产物中此肽含量是65至90％，通过在1＝215-220nm时的HPLC峰相对积分，色谱纯度超过95％。
进行有关酸水解产物的氨基酸分析(在11O℃下，6N HCl O.1％苯酚中22小时)。另外，可以先合成包含非磷酰化酪氨酸的肽，接下来经酶促或通过化学方法(在这种情况下，必须恰当地保护和磷酰化试剂能发生敏感反应的其它官能团)在酪氨酸残基上引入磷酸基团。
在此说明书中，所用的氨基酸和保护基团的缩写是基于IUPAC-IUB委员会有关生物化学命名法的建议(参见欧洲生物化学，vol 138，9-37，1984)。具体地说，在本文中使用下列缩写Boc，T-丁氧基碳酰；tBu，T-丁基；Bzl，苯甲基；C1Z，4-氯苄氧基碳酰；DIC，二异丙碳二亚胺；DCM，二氯甲烷；DIEA，二异丙乙胺；DMF二甲基甲酰胺；DMS，二甲基硫化物；Dnp，二硝基苯酚；ECC，氯碳酸乙酯；Fmoc，9-芴基甲氧碳酰；NMM，N-甲基吗啉；NMP，N-甲基2-吡咯烷酮；RP-HPLC，反相高效液相色谱；TBTU，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium四氟硼酸盐；Trt，三苯甲基。
可以通过结合抑制实验(如在实验部分所示的BIAcore分析)评估本发明的肽抑制胞质信号转导物与酪氨酸激酶受体或其它酪氨酸磷酰化转导物相结合的能力。
本发明的肽对受体酪氨酸激酶(如肝细胞生长因子受体(HGF-R))介导的生物反应的干扰，提供了其生物效应的另外证明。如实验部分所示的在本发明范围内的代表性化合物的消胀中，本发明的肽能够干扰细胞运动、细胞增殖、细胞侵入和HGF-R介导的管再生。
本领域的专家公知这些生物反应和致瘤性疾病的发生绝对相关。因此，可以在处理接收治疗的人体或动物体时(例如在治疗致瘤性疾病时)，使用本发明的肽。
本发明的肽是磷酰化的和非磷酰化的。此肽的活性形式通常是磷酰化的，但以非磷酰化的形式施用此肽并使此肽在患者体内变成磷酰化可能是有利的。这是因为当此肽为非磷酰化时，更容易吸收到细胞中。
同样可以通过任何肠胃外的途径向患者施用本发明的肽，或将本发明的肽进行适当地缀合，以便增加酶的稳定性和细胞渗透性。
可以采取皮下、静脉内或肌肉内施用的任何选择；所使用的剂量和施用的频率取决于各种因素。这些因素包括施用的目的、治疗的患者的年龄和体重、患者的状态。给出了治疗的有效量。然而，对于每种施用途径，以每次10至1000毫克，优选地是每次50至500毫克的量施用此肽。可以将此肽制备成药物组合物。所说的药物组合物也包含药学上的可接受载体或稀释剂。依据施用的途径，可以使用任何合适的载体或稀释剂。化合物的生物测定本发明的新化合物已显示出特别抑制Grb2转导物与HGF受体的磷酸酪氨酸停靠位点的结合；所说的化合物也抑制含有磷酸酪氨酸停靠位点的蛋白质与含有其它SH2的转导物(如p85-PI3K、PLCg、Src)的结合。表1和表2列出了这一抑制活性的例子。BIAcore分析用BIAcore仪器经生物特异性相互作用分析确定亲合力(Jonsson，U.等，生物技术，1991，11，520-527；Jonsson，U.等，在F.Turner(编辑的)，生物传感器的进展，vol.2 JAI出版社，London，1992，p.291-336；Karlsson，R.，等，免疫学方法杂志，1991，145，229-246)。通过测量所说的磷肽抑制SH2结构域与固定化的磷肽(FCE 28942 6-生物素酰氨基-己酰基-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-(PO3H)-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH(SEQ ID No.21)或FCE 289496-生物素酰氨基-己酰基-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH)(SEQ ID No.22))相互作用的能力确定了相对亲和力，这种固定化的磷肽包含人类肝细胞生长因子受体的Y1349和Y1356。表1和表2显示了这些测量的结果，以所说的转导物与长生物素化的磷肽(此磷肽固定在抗生物素蛋白装载的薄片上，代表所考虑的转导物的HGF受体结合位点)的结合抑制的百分数表示。表1报道了与Grb2-SH2相互作用的抑制有关的数据，表2报道了与其它转导物(p85、PLCg、Src)有关的抑制数据。也在另一个系统中使用BIAcore技术检测了更多的活性化合物，即它们抑制下列Grb2-SH2或p85-SH2与以全活性的磷酰化形式存在并固定在薄片上的HGF受体的整个胞质部分缔合的能力。已经发现这一最新的更具代表性的但费劲的方法完全相当于原先使用固定化的长磷肽的方法。
表1.代表性化合物对与Grb2-SH2结构域缔合的抑制力Grb2-SH2识别的抑制％20mM 1mMFCEH-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-OH 651928407 (参照)SEQ ID NO.23)PCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-LVs-NH2877728405 (SEQ ID No.1)PCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH 100 8228539 (SEQ ID No.3)FCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2100 7728540 (SEQ ID No.4)FCE Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2935629021FCEAc-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2804529022FCEAc-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2905029408 (SEQ ID No.7)表2.代表性化合物对与其它转导物SH2缔合的抑制力其它的SH2识别的抑制％化合物浓度PLCγ(C+N)SH2 p85 N-SH2 src SH240mM 20mM 40mM 20mM40mM 20mMPCE Ac-Tyr(PO3H2)- 8177 93 75 69 4928540 Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.4)PCE AcTyr(PO3H2)- 6060 63 50 35 1429022 Val-Asn-NH2结合抑制的评价A)BIAcore分析固定化的生物素化的磷肽Biacore系统提供了一种可靠的和具有再现性的方法以研究高分子之间的相互作用。在精确控制的条件下(如温度和流速)实时测量结合作用。Panayotou等(1993)已经描述了BIAcore生物传感器的构造和操作原理。所用的方案如下用于这些实验的SH2结构域通过Pharmacia柱(SephadexG-50预填充系统)脱盐，以便完成缓冲液和BIAcore连续缓冲液(这种缓冲液由20mM Hepes、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005％Tween 20和4mMDTT(pH7.4)组成)的交换。使用传感器薄片(SA5 Pharmacia)(其中链霉抗生物素蛋白固定在羧甲基葡萄聚糖层上)进行实验。将生物素化的磷肽FCE28949(SEQ ID NO.22)和28942(SEQ ID NO.21)(或单独含有HGF受体磷酸酪氨酸1356，或含有HGF受体磷酸酪氨酸1349和1356)以5ml/秒的流速固定在链霉抗生物素蛋白化的薄片上50秒。使用短的0.1％SDS脉冲(4秒)除去没有特异结合的磷肽。以检测的竞争磷肽的浓度范围(大多数情况下为20mM和1mM)混合GST-SH2结构域融合蛋白，并将其以5ml/分钟在连续温度25℃时注射到所说的表面上，120秒。用4秒0.1％SDS的脉冲除去和此表面结合的物质，从而使信号降低到背景水平。
B)BIAcore分析固定化的GST/HGF-R融合蛋白如上文描述的分析生物素化的磷肽的方法进行此分析。然而，在这些实验中纯化的GST/HGF-R直接固定在BIAcore薄片上。在用1∶1的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和N-乙基-N-(3二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)(Pharmacia)的混合物激活后，将GST/HGF-R(0.5毫克/毫升)固定在传感器薄片表面上。用乙醇胺(1.0M)封闭过量的反应基团。
以所说的化合物干扰HGF-R介导的生物反应的能力为基础，评价了此化合物的生物效应，这些生物反应包括(a)细胞运动(b)细胞增殖(c)细胞侵入(d)管再生。所说的化合物对细胞运动的作用在HGF刺激下，MDCK细胞迁移(Stoker，M.，E.Gherardi，M.Perryman，和J.Gray.自然1987 327239-242)。这种效应由转导运动信号的HGF-R介导。利用新的原位电穿孔技术(称为细胞活力法(cell zapping))在MDCK细胞中引入所说的肽来检测此化合物抑制HGF介导的细胞运动的能力(参见下文的实验方法部分)。使用生物素化的肽最初监测所说的肽到细胞中的有效运输。在胞内运输后，用荧光素化的抗生物素蛋白追踪生物素化的肽。这种方法表明此肽对细胞无毒性，并稳定至少24小时。为了评价此化合物对HGF-R介导的细胞运动的效应，使用含有电穿孔化合物的MDCK细胞进行扩散(scatter)分析。另外，将这些细胞接种在Transwell装置(Costar)中，并刺激它们使之通过HGF穿过渗透性的膜(参见下文的实验方法部分)。
图1A和图2描述了代表化合物对细胞运动的效应。这些实验表明化合物(例如FCE 29408(SEQ ID NO.7))有效地阻止细胞运动，而在磷酸酪氨酸类似物(FCE 29606 Ac-Phe-Val-Asn-Val-OH(SEQ ID NO.24)的位置上的带有苯基丙氨酸的相关的肽(阴性对照)则不能。此化合物对细胞增殖的作用HGF刺激上皮细胞增值，这种作用由HGF-R介导(Medico，E.，Mongiovi，A.，Huff，J.，Jelinek，M.，Follenzi A.，Gaudino，G.，Parsons J.T.GridComoglio P.M.，细胞分子生物学，1996，在出版中)。使用细胞增值测定法(Amersham)监测此化合物对HGF-R介导的细胞增殖的作用(参见下文的实验方法部分)。通过细胞活力法将肽运送到MDCK细胞中。然后测量含有所说的化合物细胞掺入胸腺嘧啶核甙类似物5-溴-2脱氧尿苷(BrdU)。图1C描述了代表化合物对细胞增值的作用。这些实验表明和阴性对照FCE29606(SEQ ID NO.24)相比，所说的化合物有效地阻止细胞增值，如FCE29408(SEQ ID NO.7)所示。所说的化合物对细胞侵入的作用HGF/SF受体在组成型活性Tpr-MET蛋白质中具有转化相应物(Ponzetto，C.，Bardelli，A.，Zhen，Z.，Maina，F.，Dalla Zonca，P.，M.(1994)细胞77，1-20.)。Tpr-MET转化的细胞在体内是高度致瘤的，并且在体外侵入胞外基质。使用化学侵入测定法评价所说的化合物对Tpr-MET介导的细胞侵入的作用(参见下文的实验方法部分)。经细胞活力法将肽运输到细胞Tpr-MET转化的细胞中，监测含有此化合物的细胞侵入组成的基本膜(Matrigel)的能力。图1B描述了代表化合物对细胞侵入的作用。这些实验表明和阴性对照FCE 29606(SEQ ID NO.24)比较，这些化合物有效地阻止了细胞侵入，如报道的FCE 29408(SEQ ID NO.7)。所说的化合物对管再生的作用管再生是一个复杂的形态过程，其中上皮细胞本身组成三级结构。在模拟胞外基质的环境中培养MDCK细胞，在HGF刺激的基础上其形成管(Medico，E.，Mongiovi，A.，Huff，J.，Jelinek，M.，Follenzi A.，Gaudino，G.，Parsons J.T.和Comoglio P.M.，Mel.Biol.of the细胞，1996，在出版中)。为了测验所说的化合物对这种现象的作用，通过细胞活力法用将要评价的化合物补充MDCK(参见下文的实验方法部分)。每日监测用胶原基质包被的并在HGF的存在下生长的单层细胞，以便观察管的发生。图3的显微照片表明了培养两天的电穿孔MDCK的外观。而对照肽(阴性对照FCE29606Ac-Phe-Val-Asn-Val-OH(SEQ ID NO.24))使细胞以正常管的结构组装，FCE 29408(SEQ ID NO.7)完全抑制了HGF诱导的管再生。
下文描述了具体说明本发明的实施例，而无意于把本发明限制在实施例中。
附图中图1描述了本发明的代表性化合物(FCE 29408)(SEQ ID NO.7)对细胞运动(图1A)、细胞侵入(图1B)、细胞增殖(图1C)的作用。每个图的纵座标表明了运动(1A)、侵入(1B)和增殖(1C)抑制的百分比。使用FCE 29606(SEQID NO.24)作为如实验部分所解释的阴性对照。
图2是描述如实验部分所讨论的FCE 29408(SEQ ID NO.7)对细胞运动的生物作用的显微照片。
图3是描述如实验部分所所说明的由HGF诱导的管再生的抑制的显微照片，并且此图显示了培养两天的电穿孔MDCK的外观。
实施例1Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 28540)(SEQ ID NO.4)的制备通过手工固相合成法经下列氨基酸(按加入的顺序)的顺序结合，在树脂上合成保护的肽Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr-OH。在最后一次结合后在固相中将酪氨酸残基磷酰化(使用亚磷酰胺化学和连续氧化)。接下来进行酸处理使侧链去保护并从树脂上解吸下来。更详细地讲，将0.56g(0.25mmol.)的Fmoc-2，4-二甲氧基-4-(羟甲氧基)二苯甲胺-氨甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)树脂(Knorr)(0.45mmol/g)进行下列包括1)至5)各步的循环1)NMP洗涤2)哌啶的(20％)NMP3)NMP，其后为DCM，再其后为NMP4)1预先形成的Fmoc-氨基酸的1-氢氧基苯并三唑酯的NMP溶液(0.5mmol)5)NMP，其后为DCM，再其后为NMP洗液和试剂的体积为10至20ml。
每个步骤有必要重复多次，以使树脂完全反应(步骤2，4)或从树脂上完全替代原先的试剂(步骤1，3，5)。在每一个DCM洗涤循环后取出树脂样品，并经茚三酮实验检查反应的完全性。
在使用之前经Fmoc-氨基酸(0.5mmol)、1-氢氧基苯并三唑(0.5mmol.)、DIEA(1mmol)和TBTU(0.5mmol)在NMP中反应生成Fmoc-氨基酸的1-氢氧基苯并三唑酯。
对每一个氨基酸残基重复1至5步反应循环，以给出标题化合物序列。按照顺序加入下列保护的氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr-OH。在最后循环之后，用DCM洗涤几次肽基树脂并干燥。相对于起始树脂获得了0.19g重量。
在25℃下用30eq.的1H-四唑和10eq.的二叔丁基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺的蒸馏THF溶液处理肽基树脂1.5小时，接下来在25℃下用30eq.的叔丁基氢过氧化物的甲苯溶液处理1.5小时，可在仍然吸附在此树脂的肽上直接获得酪氨酸残基的磷酸化。在用20％的哌啶-DMF除去N-末端的Fmoc-保护基团后，通过用5eq.的醋酸酐和5eq.的DEA的NMP溶液在25℃下处理肽基树脂30分钟获得N-末端的乙酰化。在室温下，将0.79克的肽基树脂和20毫升的三氟乙酸/水(95∶5)的混合物振荡1.5小时。用二乙基醚沉淀去保护的肽，并通过过滤收集。
经反向高效液相色谱在C18-Vdac(Hesperia，CA)柱(2，2×25cm)上以0.05％三氟乙酸通过利用线性梯度的5至32.5％的乙腈水溶液纯化粗制的肽45分钟。获得含有此产物纯化形式的组分，真空蒸发乙腈并将余下的溶液低压冻干。以99.9％的色谱(HPLC)纯度获得64毫克的标题化合物。
氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.2(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量88％。FAB质谱；m/z 615[MH]+。(MW614.6)实施例2Ac-Phe(P-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29408)(SEQ ID NO.7)的制备从4-(2，4-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰氨基-正亮氨酰基-4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯树脂(Rink MBHA)开始，在此树脂上以如实施例1描述的类似方式装备磷甲基肽，按照下列顺序加入保护的氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe(p-CH2PO3Et2)-OH。通过用5eq.的醋酸酐和5eq.的DIEA的NMP溶液在25℃下处理肽基树脂30分钟获得N-末端的乙酰化。如实施例1的描述进行树脂的切割并除去保护基团(除磷酸乙基基团外)。将270毫克粗制的肽悬浮在配有1毫升三甲基溴硅烷的回流DCM中2小时。在溶剂蒸发后，通过如实施例1描述的RP-HPLC(只是乙腈梯度为5-43.5％)纯化完全去保护的肽，得到98.0％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.3(1)。肽含量100％。FAB质谱；m/z 613[MH]+。(MW 612.6)实施例3Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2(FCE 29021)的制备对标题化合物的制备考虑了不同的合成策略。从相应的N-烷基酰胺的天冬氨酸衍生物开始，通过使侧链的羧基基团与产生酰胺的树脂连接，在α-羧基基团上已经引入了天冬酰胺N-烷基酰胺，以便在切割后产生b-酰胺基团。
通过使Fmoc-Asp(t.Bu)-OH(10mmol)和异丁醇胺(11mmol)经带有10eq.NMM和10eq.ECC的混合酸酐方法反应4小时，之后由TFA/水(95∶5)将t-异丁醇去保护。
从Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯树脂(DOD)开始，以如实施例1描述的类似方式在此磷酰化和乙酰化的树脂上装备磷肽，按照下列顺序加入氨基酸Fmoc-Asp-NH-CH2CH(CH3)2、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr-OH。利用此树脂在37℃下由TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)进行2小时的切割。在溶剂蒸发后，通过如实施例1描述的RP-HPLC纯化完全去保护的肽，得到99.8％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 0.9(1)；Val 1(1)；Tyr 1.1(1)。肽含量73％。FAB质谱；m/z 572[MH)+。(MW 571.6)实施例4Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys(AC)-NH2(FCE 28405)(SEQ ID NO.1)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得98.9％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Lys 1(1)；Val 1.73(2)；Asx 1.27(1)；Tyr 0.87(1)。肽含量83％。FAB质谱；m/z 785[MH]+。(MW 784.8)实施例6Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH(FCE 28539)(SEQ ID NO.3)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得标题化合物，只是使用了4-羟甲基苯甲氧基甲基-共聚多(苯乙烯-1％二乙烯基苯)树脂(Wang)。将这种情况下的第一个氨基酸FmocVal(Boc)OH通过将溶解在DMF中的对称酸酐(通过带有6当量DIC的12当量氨基酸衍生物的DCM溶液处理20分钟而产生)在催化量的DMAP存在的情况下与此树脂反应2小时，而装载到此树脂上。按照实施例1描述的类似方法继续进行制备。得到99.8％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Val 1.6(2)；Asx 1(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量83％。FAB质谱；m/z 616[MH]+。(MW 615.6)实施例7
H2O3PO-Ph-CH2-CH2-CO-Val-Asn-Val-OH(FCE 28404)的制备通过如实施例6描述的类似方式使用树脂和引入第一个氨基酸和将如实施例1描述的类似方式用于余下的合成来获得标题化合物，只是使用自动合成仪(应用生物系统肽合成仪430A)。得到99.0％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Val 1.9(2)；Asx 1(1)。肽含量41％。FAB质谱；m/z 559[MH]+。(MW 558.5)实施例8Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2(FCE 29022)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得标题化合物，但使用了Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯树脂(DOD)。使用此树脂，用TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)混合物在37℃下进行切割2小时。在溶剂蒸发后，通过如实施例1描述的RP-HPLC纯化完全去保护的肽，得到98.7％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Val 1(1)；Asx 1.3(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量81％。FAB质谱；m/z 516[MH]+。(MW 515.5)实施例9Ac-Tyr(PO3H2)-Val-NHCH2CH2CONH2(FCE 29018)的制备通过实施例8描述的类似方式获得标题化合物，但使用Fmoc-bAlaOH代替天冬酰胺衍生物。得到97.0％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Val 1(1)；Tyr 1.3(1)。肽含量56％。FAB质谱；m/z 473[MH]+。(MW 472.4)实施例10Ac-Phe(CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2(FCE 28615)(SEQ ID NO.5)的制备通过如实施例2描述的类似方式获得标题化合物，但使用了Fmoc-2，4-二甲氧基-4-(羟甲氧基)二苯甲胺-氨甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)树脂(Knorr)。得到99.1％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Lys1(1)；Val 1.7(2)；Asx 1.1(1)。肽含量95％。FAB质谱；m/z 741[MH]+。(MW 740.8)实施例11Ac-Phe(P-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2(FCE 29406)的制备通过如实施例2描述的类似方式以98.4％的色谱(HPLC)纯度获得标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.8(1)；。肽含量100％。FAB质谱；m/z 514[MH]+。(MW 513.5)实施例12Ac-Phe(CH2SO3H)-Val-Asn-Val-NH2FCE 28995)(SEQ ID NO.6)的制备通过如实施例2描述的类似方式获得标题化合物，但使用了Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯树脂(DOD)，并且使用FmocPhe(CH2SO3H)OH代替二乙基磷酰甲基衍生物。使用此树脂由TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)混合物在37℃下进行切割2小时。得到97.0％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)。肽含量69％。FAB质谱；m/z 613[MH]+。(MW 612.7)实施例13Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Ser-NH2(FCE 28785)(SEQ ID NO.8)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得99.1％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Ser 1(1)；Val 2.0(2)；Asx 1.2(1)。肽含量97％。FAB质谱；m/z 702[MH]+。(MW 701.7)实施例14Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Gln-NH2(FCE 28883)(SEQ ID NO.9)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得96.5％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Glx 1(1)；Val 1.7(2)；Asx 1.2(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量80％。FAB质谱；m/z 743[MH]+。(MW 742.4)实施例15Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Gln-S-NH2(FCE 28702)(SEQ ID NO.14)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得99.3％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Ser 0.9(1)；Glx 1(1)；Asx 1.1(1)；Ile 0.8(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量92％。FAB质谱；m/z 745[MH]+。(MW 744.7)实施例16Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Ile-Glu-NH2(FCE 28703)(SEQ ID NO.15)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得99.0％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Glx 0.9(1)；Ile 0.8(1)；Val 0.9(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量93％。FAB质谱；m/z 796[MNa]+，758[MH]+，515[Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2]+。(MW 744.7)实施例17Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ile-Lys-NH2(FCE 28737)(SEQ ID NO.16)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得93.0％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Lys 1(1)；Ile 1.77(2)；Asx 1.17(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量78％。FAB质谱；m/z 771[MH]+。(MW 770.8)实施例18Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29091)(SEQ ID NO.11)的制备和Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29116)(SEQ ID NO.12)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得标题化合物，但使用了Fmoc-4-甲氧基-4-(g-羧丙氧基)-二苯甲胺-丙氨酰氨甲基-聚苯乙烯树脂(DOD)，并且使用FmocTyr(PO3Me2)OH代替酪氨酸衍生物，因此省略了磷酸化步骤。使用此树脂由TFA/H2O/DMS(95∶5∶5)混合物在37℃下进行切割2小时。得到这两种化合物的化合物，并由RP-HPLC分离。
得到97.0％色谱(HPLC)纯度的Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE29091)。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量83％。FAB质谱；m/z 643[MH]+。(MW 642.63)得到98.0％色谱(HPLC)纯度的Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2(FCE29116)。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量84％。FAB质谱；m/z 651[MNa]+，667[MK]+。(MW 628.6)实施例19BocTyrOBzl的制备通过将BocTyrOH(2克，7mmol)和苄基乙醇(0.873毫升，8.4mmol)与DCC(1.8克，8.75mmol)和DMAP(85毫克，0.7mmol)在0℃下反应1小时，并于室温下在THF中放置1夜。在过滤DCU后，在真空中浓缩溶剂，残渣溶解在EtOAc中，并由5％的NaHCO3溶液和饱和的NaCl溶液洗涤几次。干燥(Na2SO4)并浓缩有机相。由硅胶层析法纯化粗制的物质(洗脱液石油醚/乙酸乙酯从9/1到8/2v/v)，最终得到1.5克标题化合物(57％产量)。H1NMR(200MHz，CDCl3)d(ppm)＝7.4-6.65(m，9H，芳族化合物)，5.1(d，2H，COOCH2F)，4.6(m，1H，N-CH-CO)，3.0(d，2H，CH-CH2-F)，1.4(s，9H，tBu)。
BocTyr(PO3Et2)OBzl的制备在氩气中和50℃下，通过将BocTyrOBzl(371毫克，1mmol)和二乙基磷酸盐(258毫克，1.5mmol)与过量的NaH(60％的矿物油溶液)在干燥的1，4-二氧六环中反应3.5小时制备标题化合物。在真空中浓缩溶剂，残渣溶解在EtOAc中，并由5％的NaHCO3溶液、10％柠檬酸溶液及饱和的NaCl溶液洗涤几次。干燥(Na2SO4)并浓缩有机相，得到254毫克的油(50％产量)，这些油在没有纯化的情况下用于下面的步骤。质谱m/z 508[MH]+，530[MNa]+。H1NMR(200Mhz，CDCl3)d(ppm)＝7.4-6.85(m，9H，芳族化合物)，5.1(d，2H，COOCH2-F)，4.6(m，1H，N-CH-CO)，4.3-4(m，4H，P-O-CH2-CH3)，3(t，2H，CH-CH2-F)，1.4(m，15H，CH3-CH2+tBu)。
BocTyr(PO3Et2)OH的制备通过粗制的BocTyr(PO3Et2)OBzl(1mmo)和甲酸铵(4mmol)与炭上的10％Pd在50℃下于甲醇/醋酸混合物中反应20分钟制备标题化合物。在过滤催化剂后，在真空中浓缩溶剂，残渣溶解在EtOAc中，并由饱和的NaCl溶液洗涤几次。干燥(Na2SO4)并浓缩有机相，得到270毫克的油(70％产量)，这些油在没有纯化的情况下，用于下面的步骤。质谱m/z 409[MNa]+。H1NMR(200Mhz，DMSO-d6)d(ppm)＝7.3-7(dd，4H，芳族化合物)，4.1(m，4H，P-O-CH2-CH3)，3-2.7(m，2H，CH-CH2-F)，1.4-1.2(m，15H，CH3-CH2+tBu)。
Ac-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29145)(SEQ ID NO.13)的制备通过如实施例18类似的方式获得标题化合物，但使用了BocTyr(PO3Et2)。通过由1.5当量DIEA和5当量醋酸酐在DMF中25℃下处理粗制的H-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH22小时而进行N-乙酰化。得到90.0％色谱(HPLC)纯度的最终化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.17(1)；Tyr 0.87(1)。肽含量83％。FAB质谱；m/z 671[M-H]+。(MW 670.1)实施例206-生物素酰氨基-己酰基-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29128)(SEQ ID NO.10)的制备通过如实施例8描述的类似方式获得标题化合物，但以生物素化代替乙酰化。在由20％的哌啶-DMF除去N末端的Fmoc保护基团后，通过由3.3eq 6-磺基丁二酰亚胺酰基(生物素酰氨基)己酸盐和几滴N-甲基吗啉在DMF中25℃下处理肽基树脂70小时(直到由茚三酮实验检测已反应完全)而获得N末端生物素化。得到98.8％色谱(HPLC)纯度的最终化合物。氨基酸的比率Val2(2)；Asx 1.2(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量97％。FAB质谱；m/z 912[M]。(MW 912.02)实施例21Ac-Tyr(PO3H2)-Gly-Asn-NH2(FCE 29267)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得标题化合物，但使用了4-(2，4-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰氨基-正亮氨酰基-4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯树脂(Rink MBHA)。得到98.6％色谱(HPLC)纯度的此化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Gly 0.9(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量77％。FAB质谱；m/z 474[MH]+。(MW 473.4)实施例22Ac-Phe(P-CH2PO3H2)-Gly-Asn-NH2(FCE 29268)的制备通过如实施例2描述的类似方式获得100％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx l(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量88％。FAB质谱；m/z 472[MH]+。(MW 471.4)实施例23Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Gln-NH2(FCE 29409)的制备通过如实施例1描述的类似方式获得标题化合物，但使用了4-(2，4-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰氨基-正亮氨酰基-4-甲基二苯甲胺-聚苯乙烯树脂(Rink MBHA)。得到99.3％色谱(HPLC)纯度的此化合物。氨基酸的比率Glx 1(1)；Val 0.8(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量81％。FAB质谱；m/z 530[MH]+。(MW529.5)实施例24Ac-Tyr(PO3H2)-Val-D-Asn-NH2(FCE 29410)的制备通过如实施例23描述的类似方式获得99.0％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.8(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量87％。FAB质谱；m/z 516[MH]+。(MW 515.5)
实施例25Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Hse-NH2(FCE 29411)的制备通过如实施例23描述的类似方式获得86.5％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Val 0.8(1)；Tyr 1(1)。肽含量88％。FAB质谱；m/z 503[MH]+。(MW 502.5)实施例26Ac-Tyr(PO3H2)-D-Val-Asn-NH2(FCE 29413)的制备通过如实施例23描述的类似方式获得99.1％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.7(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量82％。FAB质谱；m/z 516[MH]+。(MW 515.5)实施例27Ac-Tyr(PO3H2)-Abu-Asn-NH2(FCE 29414)的制备通过如实施例23描述的类似方式获得99.7％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量87％。FAB质谱；m/z 502[MH]+。(MW 501.4)实施例28Ac-Tyr(PO3H2)-terLeu-Asn-NH2(FCE 29415)的制备通过如实施例23描述的类似方式获得98.7％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1.2(1)；terLeu 1(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量77％。FAB质谱；m/z 530[MH]+。(MW 529.5)实施例29Ac-Tyr(PO3H2)-Ala-Asn-NH2(FCE 29421)的制备通过如实施例23描述的类似方式获得98.9％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Ala 0.73(1)；Tyr 0.7(1)。肽含量83％。FAB质谱；m/z 488[MH]+。(MW 487)实施例30Ac-Tyr(PO3H2)-Aib-Asn-NH2(FCE 29475)的制备通过如实施例23描述的类似方式获得97.2％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量77％。FAB质谱；m/z 502[M-H]+。(MW 501.44)
实施例31CH3-(CH2)12-CO-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29402)(SEQ ID NO.17)的制备通过如实施例8描述的类似方式获得95％毛细管电泳纯度(EF)的标题化合物。氨基酸的比率Val 2(2)；Asx 1.1(1)；Tyr 1.0(1)；Gly 1.9(2)。肽含量94％。FAB质谱；m/z 897[M]。(MW 897.0)实施例32CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29403)(SEQ ID NO.18)的制备通过如实施例8描述的类似方式获得95％毛细管电泳纯度(EF)的标题化合物。氨基酸的比率Val 1.7(2)；Asx 1(1)；Tyr 0.8(1)。肽含量87％。FAB质谱；m/z 783[MH]+。(MW 782.9)实施例33CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29404)(SEQ ID NO.19)的制备通过如实施例8描述的类似方式获得72％毛细管电泳纯度(EF)的标题化合物。氨基酸的比率Val 1.8(2)；Asx 1(1)；Tyr 0.9(1)。肽含量87％。FAB质谱；m/z 699[MH]+。(MW 698.7)实施例34的制备C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(FCE 29405)(SEQ ID NO.20)的制备通过如实施例8描述的类似方式获得75％毛细管电泳纯度(EF)的标题化合物。氨基酸的比率Val 1.8(2)；Asx 1(1)；Tyr 1.0(1)。肽含量96％。FAB质谱；m/z 697[MH]+。(MW 696.7)实施例35CH3-CO-CH2-CH2-CO-Phe(P-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2(FCE 29407)的制备通过如实施例2描述的类似方式获得88.3％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸的比率Asx 1(1)；Val 0.8(1)。肽含量99％。FAB质谱；m/z 570[MH]+。(MW 569.7)
实施例366-生物素酰氨基-己酰基-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-(PO3H)-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH(FCE 28942)(SEQ ID NO.21)的制备在MilliGen 9050肽合成仪上由带有第一个氨基酸(Fmoc-L-Lys(Boc)OH，此氨基酸已经通过酯键吸附在此树脂上)的4-羟甲苯氧乙酰氨甲基-聚乙烯乙二醇-聚苯乙烯树脂开始进行链装配(1.1克；0.18mmol/克)。将此树脂进行下列包括1至6步处理内双偶合的循环1)通过使用20％哌啶-DMF除去Fmoc-保护基团，7分钟；2)以DMF洗涤，12分钟；3)用4当量的Fmoc-氨基酸衍生物的DMF溶液进行第一次偶合，30分钟；4)以DMF洗涤，8分钟；5)用4当量的Fmoc-氨基酸衍生物的DMF溶液进行第二次偶合，30分钟；6)以DMF洗涤，8分钟；以从羧基末端到氨基末端的顺序对每一氨基酸残基重复1到6步反应循环，以给出标题化合物的序列，其中使用下列保护侧链的氨基酸衍生物Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-His(Boc)-OPfp、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OPfp、Fmoc-L-Thr(tBu)-OR(其中的R是氢或Pfp)。
在每个循环中，除了Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH(在肽链的2和4位置上)外，使用Fmoc-氨基酸五氟苯酯(此化合物偶合成1-1-羟基苯并三唑酯，恰好在使用前通过Fmoc-氨基酸、TBTU、1-羟基苯并三唑(每个4当量)和N-甲基吗啉(8当量)的反应形成)进行第一次偶合反应(第3步)。在每个循环中，除了Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Boc)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH外，使用1-羟基苯并三唑酯(其恰好在使用前通过如上述的描述而形成，通过使用它们自身的五氟苯酯而偶合成)进行第二次偶合反应(第5步)。
在最后的循环后，洗涤几次肽基树脂并将此树脂干燥。和开始的树脂比较，获得了1.2克的重量。在25℃下用30eq.的1H-四唑和10eq.的二叔丁基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺的蒸馏THF溶液处理肽基树脂1.5小时，接下来在25℃下用30eq.的叔丁基氢过氧化物的甲苯溶液处理1.5小时，可在仍然吸附在此树脂的肽上直接获得酪氨酸残基的磷酸化。在用20％的哌啶-DMF除去N-末端的Fmoc-保护基团后，通过由3.3eq 6-磺基丁二酰亚胺基(生物素酰氨基)己酸盐和几滴N-甲基吗啉在DMF中25℃下处理肽基树脂70小时(直到由茚三酮实验检测已反应完全)而获得N末端生物素化。和开始的树脂比较获得1.5克的重量。在室温下，将0.70克的肽基树脂和8毫升的三氟乙酸/水/EMS(95∶2.5∶2.5)的混合物振荡1.5小时。用二乙基醚沉淀去保护的肽，并通过过滤收集。
经反向高效液相色谱在C18-Vdac(Hesperia，CA)柱(2，2×25cm)上以18ml/分钟的流速，通过13.25％(25分钟)、16％(35分钟)、18.75％(30分钟)、21.5％(10分钟)的乙腈(溶解在0.05 NAcONH4水溶液)连续的逐步等度条件洗脱，在220nm的波长下使用UV检测器。和并含有纯化形式的组分，在真空中蒸发乙腈，余下的溶液低压冻干两次。获得91.5％色谱(HPLC)纯度的标题化合物(12毫克)。氨基酸比率Lys 1(1)；Asx 2.37(2)；Gly 6.00(6)；Ile 0.9(1)；Thr 1.00(1)；Ala 1.00(1)；His 1.73(2)；Glx 1.10(1)；Val 3.63(4)；Tyr 1.83(2)。肽含量82％。FAB质谱；m/z 2627.2[M+H]+；m/z 2625.5[M-H]-；(MW 2627.74)实施例376-生物素酰氨基-己酰Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-Val-His-Val-Asn-ALA-Thr-Tyr-(PO3H)-Val-Asn-Val-Lys-OH(FCE 28949)(SEQ ID No.22)的制备通过如实施例36类似的方式获得91.8％色谱(HPLC)纯度的标题化合物。氨基酸比率Lys 1(1)；Val 3.67(4)；Asx 2.4(2)；Tyr 1.83(2)；Thr 1.0(1)；Ala 1.07(1)；His 1.6(2)；Glx 1.1(1)；Ile 0.93(1)；Gly 6.3(6)。肽含量68％。FAB质谱；m/z 2547.1[M+H]+；2545[M-H]-。(MW2547.8)实施例38H-Tyr(PO3H2)-Val-Ash-Val-Lys-OH(FCE 28407)(作为参照)(SEQ ID NO.23)的制备通过如实施例6描述的类似方式获得标题化合物，但使用了自动合成仪(应用生物系统肽合成仪430A)及实施例1描述的磷酸化步骤。获得99.0％色谱(HPLC)纯度的此化合物。氨基酸比率Lys 0.8(1)；Val 1.6(2)；Asx1(1)。肽含量80％。FAB质谱；m/z 702[MH]+。(MW 701.7)实施例39Ac-Phe-Val-Asn-Val-OH(FCE 29606)(作为参照)(SEQ ID NO.6)的制备通过如实施例6描述的类似方式使用树脂和引入第一个氨基酸和将实施例1描述的类似方式用于其它合成步骤来获得标题化合物。获得97.6％色谱(HPLC)纯度的此化合物。氨基酸比率Val 2(2)；Asx 1.4(1)；Phe 0.9(1)。肽含量98％。FAB质谱；m/z 520[MH]+。(MW 519.6)实施例40使用细菌表达系统制备重组SH2结构域为了迅速地产生大量纯化的功能性蛋白质。使用了实质上如D.B.Smith和K.S.Johnson(基因，1988，67，31)描述的方法。通过聚合酶链式反应获得作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白的SH2结构域，并将其克隆到pGEX细菌表达载体(Pharmacia)中。在细菌表达之后，使用谷胱甘肽-琼脂糖-色谱迅速纯化融合蛋白。所用方案如下将pGEX载体转化的大肠杆菌细胞(xL-1 Blue)在37℃下10ml LB中振荡培养过夜，然后用其接种含有氨苄青霉素(100克/毫升)的1升LB培养基。37℃充分通气下生长3-4小时，直到OD600达到0.5至0.6。通过加入最终浓度为0.2-0.4mM的IPTG诱导重组蛋白质的表达，在37℃下再生长4-8小时。然后通过以2000g离心15分钟沉淀细菌细胞，在PBS中洗涤两次，并于冰上溶解在含有蛋白酶抑制物的40毫升LB缓冲液(100mM Tris pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA，10％甘油，1％Triton X-100)中。将这些细胞进行温和的超声处理，然后置于冰上30分钟。通过在4℃下以14.000rpm离心裂解物20分钟除去细胞碎片。在4℃将上清液与在EB缓冲液中预洗2小时的5毫升谷胱甘肽琼脂糖(Pharmacia)旋转温育，使重组蛋白质进行亲和结合。然后用EB洗涤这些小珠4次，50mM Tris-HCl次[pH8.0]洗涤两次。通过和50毫升20mM谷胱甘肽的Tris-HCl[pH8.0]溶液竞争，将所说的蛋白质从小珠上洗脱下来，并以1毫升收集组分，使用蛋白质测定试剂(Pierce)分析这些组分中的蛋白质含量。然后将纯化的GST融合蛋白用于BIAcore和生物化学分析。
实施例41用杆状病毒表达系统制备重组HGF-R将作为GST融合蛋白的人类HGF-R cDNA的胞内结构域插入到杆状病毒转移载体PVL 1393(Invitrogen，San Diego，CA)中。通过脂质转染法将重组载体和BsuI消化的BacPak6病毒DNA(Clontech实验室，Palo Alto，CA)共转染到草地夜蛾昆虫细胞(Sf9)(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)中。通过斑点印迹杂交和噬斑测定法鉴定和纯化阳性克隆。使用重组病毒感染10-1，10-2，10-3，10-6稀释倍率的Sf 9细胞。一周后，将感染的细胞提取物在尼龙滤器上印迹并由放射标记的全长人类HGF-R cDNA探测。接下来通过噬斑测定纯化含有HGF-R cDNA基因的病毒。分离单一的病毒克隆并用于大规膜的Sf9细胞感染。通过Western印迹法监测病毒克隆的表达，接下来将高水平表达克隆用于大规模的蛋白质生产。实质上按照有关SH2结构域的描述进行GST/HGF-R融合蛋白的纯化。
实施例42吸附细胞原位电穿孔细胞活力法为了有效地将蛋白质引入到吸附细胞中，使用了新的原位电穿孔方法(L.Raptis和K.L.Firth，DNA和细胞生物学，1990，9，615-621)。对于传统的电穿孔方法，这种技术是优选的，这是因为(1)通过胰蛋白酶处理，细胞膜没有改变(2)细胞膜不易受到脱离底物的增加的应力的影响(3)细胞生存能力高于正常的电穿孔方法(4)在电穿孔后，可以通过显微镜检查直接检测细胞的变化。电穿孔装置(Epizap EZ-11.咨询科学研究所，Kingston，Ontario，CA)由给电容器充电和放电的回路及一个将脉冲传送给所说的细胞的装置组成。后一个装置由涂上一层导电的，可以透明也可以不透明的铟-锡氧化物的玻片、铝阴性电极和铝阳性电极组成。实验前一天，将玻片放置在10厘米的陪替氏培养皿中，并由乙醇消毒。将MDCK细胞接种在导电表面上。应用脉冲之前，除去生长培养基(DMEM 10％FCS)，并用电穿孔缓冲液(10mM磷酸钠pH7.0，140mM NaCl，1mM KCl)洗涤两次。接下来将同样的加入了接收检验的将引入的化合物(为溶解在电穿孔缓冲液中1mM溶液)的缓冲液加入到所说的细胞中。按照下列参数进行单一脉冲的电穿孔50-100V和1-20mF。脉冲后，用生长培养基洗涤细胞两次，并在37℃下恢复2小时。电穿孔后2小时，通过加入台盼蓝评价细胞的生存能力。
实施例43转孔迁移和侵入测定使用Costars培养室转孔(transwell))(6.5mM，Costar公司，剑桥，马萨诸塞)测定了细胞侵入的刺激作用。在transwells的上室底部使用了聚碳酸酯膜(孔的大小为8mm)。在通过如实施例47描述的方法用接收评价的化合物电穿孔后，将200毫升含有105细胞的培养基放置在上室的聚碳酸酯膜上。将1毫升的DMEM 5％FCS(单独或含有刺激因子(400个单位高度纯化的HGF))加入到下室中。将此平板在37℃下H2O饱和的5％CO2中培养24小时。培养结束后，机械除去聚碳酸酯膜滤器上面的细胞。在检测细胞侵入性时，用1.2毫克/毫升基质胶(matrigel)(类似上皮基础膜结构并含有IV型胶原、野芝麻硷和其它基础膜结构组分)涂敷聚碳酸酯膜滤器(协作研究公司，Waltham，MA)。评价细胞侵入时，将培养延长到48小时。在室温下，将已经迁入到滤器底面的细胞用11％的glutheraldeyde固定15分钟，蒸馏水洗涤三次，用0.1％结晶紫-20％甲醇在室温下染色20秒。在自来水洗涤三次和室温下干燥后，通过将滤器浸入到300毫升10％的醋酸中溶解结晶紫(室温下5秒钟)。以590nm的吸收率评价溶解的结晶紫的浓度。
实施例44细胞增殖的测定通过胸腺嘧啶核甙类似物(5-溴2-脱氧尿苷(BrdU))的加入由细胞增值测定方法(Amersham)测定细胞增值的刺激作用。在通过如实施例47描述的方法用被评价的化合物电穿孔后，将MDCK细胞接种在微型滴定板中，以便达到次级铺满(subconfluence)，在DMEM 0.2％FCS中饥饿24-48小时，然后用纯化的重组HGF刺激。6小时后，加入BrdU，并使之进一步结合2小时。通过特异性的单克隆抗体和过氧化物酶-缀合次级抗体检测结合的BrdU。和色原过氧化物酶底物一道培养产生可溶性的绿色染料，测定410nm的吸收率。
实施例45
管再生测定改良传统的管再生测定法(Medico等，1996)，以便在原位完成电穿孔细胞的测定。在传导玻片的DMEM 10％FCS中使MDCK细胞生长至铺满。在通过如实施例47用被评价的化合物电穿孔后，由含有2％胶原(主要是I型(Seromed))混合物的人工胞外基质包被MDCK细胞。在纯化的重组HGF存在下，将包被的单层细胞培养4-5天。每隔一日将补充有HGF的培养基更新一次。每天通过倒置光学显微镜(Leica)以400X的放大率观察来监测管再生。在HGF刺激两天后，管结构变得明显。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Pharmacia和Up john S.p.A.
(B)街通Via Robert Koch 1.2(C)城市米兰(E)国家意大利(F)邮区代码(ZIP)20152(ii)发明名称细胞有丝分裂发生和运动发生的肽拮抗剂和它们的治疗用途(iii)序列数24个(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点
(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Lys-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Lys(Ac)-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa Val-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO3Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点
(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Phe(CH2PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Lys-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO5Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Phe(CH2SO3H)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO6Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Phe(P-CH2PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点
(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO7Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是S-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO8Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Gln-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO9Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征；(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是6-生物素酰氨基-己酰基-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点
(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO10Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3Me2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO11Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3HMe)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO12Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3Et2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点
(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO13Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是S-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO14Xaa Ile Asn Gln Xaa15(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Glu-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO15Xaa Val Asn Ile Xaa15(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点
(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Lys-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO16Xaa Ile Asn Ile Xaa15(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是CH3-(CH2)12-CO-Gly″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置3(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置6(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO17Xaa Gly Xaa Val Asn Xaa15(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO18Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征
(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO19Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Val-NH2″(xi)序列描述SEQ ID NO20
Xaa Val Asn Xaa1(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是6-生物素酰氨基-己酰基-Gly″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置10(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Tyr(PO3H)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置17(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Tyr(PO3H)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置21(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Lys-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO21Xaa Gly Gly Gly Gly I1e Gly Glu His Xaa Val His Val Asn Ala Thr15 10 15Xaa Val Asn Val Xaa20(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是6-生物素酰氨基-己酰基-Gly″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置17(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Tyr(PO3H)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置21(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Lys-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO22Xaa Gly Gly Gly Gly Ile Gly Glu HisTyr Val HisVal Asn Ala Thr15 10 15Xaa Val Asn Val Xaa
20(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是H-Tyr(PO3H2)″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置5(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Lys-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO23Xaa Val Asn Val Xaa15(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点
(B)位置1(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Xaa是Ac-Phe″(ix)特征(A)名称/关键词修饰的位点(B)位置4(D)其它信息/产物＝″其它″/注释＝″Val-OH″(xi)序列描述SEQ ID NO24Xaa Val Asn Xaa权利要求
1)一种下式(I)的肽或其药学上可接受的盐
其中Y是氢、R-C(＝O)NH-，其中R是氢、低级烷基或者长链烷基，这两种烷基是线性的或支链的或环状的、N-取代的氨基酸或肽残基或多肽残基或包括N-取代的氨基酸或肽部分的多肽残基；X是-OPO3H2或其功能性衍生物；A是低级烷基；B是H-或低级烷基；Z是H、-COOH、CONHR2、-COR2(其中R2＝H、-NH2、-NHR3(其中R3是低级烷基，以羧酸形式或酰胺化形式存在的氨基酸或二肽))。
2)按照权利要求1的化合物，其中所说的N-取代的氨基酸或肽残基是R-C(＝O)-Gly-、R-C(＝O)-Thr-或R-C(＝O)-Ala-Thr-(其中R如权利要求1中所限定的)。
3)按照权利要求1或2的化合物，其中所说的-OPO3H2的功能性衍生物选自-CH2PO3H2、-CF2PO3H2、-CHFPO3H2、-CH2SO3H、-CF2SO3H、-CHFSO3H、-SPO3H2、-OPSO2H2、-SPSO2H2、-OPS2OH2、-OP(CH3)O2H、-SP(CH3)O2H、-OP(CH3)SOH、OP(CF3)O2H、-OP(CHF2)O2H、-SP(CF3)O2H、-SP(CHF2)O2H和其低级烷基酯。
4)按照以上任一权利要求的化合物，其中A是CH3-、CH3CH2-、(CH3)2CH-、(CH3)3C-、CH3CH2CH(CH3)-或(CH3)2CHCH2-。
5)按照以上任一权利要求的化合物，其中所说的R3是-CH2CH(CH3)2-或选自-Val-NH2、-Val-OH、-Val-Lys-NH2、-Val-Lys-OH、-Val-Lys(eN-Ac)-NH2、-Val-Lys(eN-Ac)-OH、-Val-Ser-NH2、-Val-Ser-OH、-Val-Gln-OH和-Val-Gln-NH2。
6)按照以上任一权利要求的化合物，这种化合物能够和胞质信号转导物结合。
7)按照权利要求6的化合物，这种化合物能够抑制胞质信号转导物与受体酪氨酸激酶或者与另一种酪氨酸磷酰化转导物结合。
8)按照权利要求7的化合物，其中所说的胞质信号转导物选自由下列物质组成的组Grb-2、Shc、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的p85亚单元、Src、ras GTP酶活化蛋白(GAP)、磷脂酶Cγ(PLCγ)、ZAP70、Syc和Stat，并且其中所说的受体酪氨酸激酶选自由肝细胞生长因子受体(HGF-R)、血小板衍生的生长因子受体(PDGF-R)、表皮生长因子受体(EGF-R)和它们截短的或突变的保留有细胞质域的形式组成的组。
9)按照权利要求7的化合物，其中所说的转导物选自由下列物质组成的组Grb-2、Shc、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的p85亚单元、Src、rasGTP酶活化蛋白(GAP)、ZAP70、Syc和Stat。
10)按照权利要求8的化合物，其中所说的胞质信号转导物是Grb-2，受体酪氨酸激酶是HGF-R或它的相关形式(如Tpr-MET)和此家族的其它成员(如SEA和RON)。
11)按照权利要求1的化合物，这种化合物选自FCE 28405 Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2(SEQ ID No.1)FCE 28782 Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys(Ac)-NH2(SEQ ID No.2)FCE 28539 Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-OH(SEQ ID No.3)FCE 28540Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.4)FCE 28404H2O3PO-Ph-CH2-CH2-CO-Val-Asn-Val-OHFCE 29021Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NHCH2CH(CH3)2FCE 29022Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-NH2FCE 29018Ac-Tyr(PO3H2)-Val-NHCH2CH2CONH2FCE 28615Ac-Phe(CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-Lys-NH2(SEQ ID No.5)FCE 28995Ac-Phe(CH2SO3H)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.6)FCE 29406Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2FCE 29408Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.7)FCE 28785Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Ser-NH2(SEQ ID No.8)FCE 28883Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-Gln-NH2(SEQ ID No.9)FCE 291286-生物素酰氨基-己酰基-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.10)FCE 29091Ac-Tyr(PO3Me2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.11)FCE 29116Ac-Tyr(PO3HMe)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.12)FCE 29145Ac-Tyr(PO3Et2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.13)FCE 28702Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Gln-Ser-NH2(EGFR/Y1068) (SEQID No.14)FCE 28703Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Ile-Glu-NH2(IRS1/Y895) (SEQ ID No.15)FCE 28737Ac-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ile-Lys-NH2(SEQ ID No.16)FCE 29267Ac-Tyr(PO3H2)-Gly-Asn-NH2FCE 29268Ac-Phe(p-CH2PO3H2)-Gly-Asn-NH2FCE 29409Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Gln-NH2FCE 29410Ac-Tyr(PO3H2)-Val-D-Asn-NH2FCE 29411Ac-Tyr(PO3H2)-Val-Hse-NH2FCE 29413Ac-Tyr(PO3H2)-D-Val-Asn-NH2FCE 29414Ac-Tyr(PO3H2)-Abu-Asn-NH2FCE 29415Ac-Tyr(PO3H2)-terLeu-Asn-NH2FCE 29421Ac-Tyr(PO3H2)-Ala-Asn-NH2FCE 29475Ac-Tyr(PO3H2)-Aib-Asn-NH2FCE 29402CH3-(CH2)12-CO-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.17)FCE 29403CH3-(CH2)12-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.18)FCE 29404CH3-(CH2)6-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.19)FCE 29405C6H11-CH2-CO-Tyr(PO3H2)-Val-Asn-Val-NH2(SEQ ID No.20)FCE 29407CH3-CO-CH2-CH2-CO-Phe(p-CH2PO3H2)-Val-Asn-NH2
12)一种制备如以上任一权利要求所要求的化合物的方法，该方法包括由单个的氨基酸和/或两个或多个氨基酸残基预先形成的肽化学合成式(I)的肽。
13)按照权利要求12的方法，其中在固相合成期间将预磷酰化保护的酪氨酸残基引入到此肽中。
14)按照权利要求12的方法，其中当受保护的预先形成的肽吸附在固体支持物上时，此肽的酪氨酸残基是磷酰化的。
15)按照权利要求12至14任一之方法，该方法包括将所说的肽转化成其药学上可接受的盐。
16)一种药物组合物，该组合物包含生理学上可接受的载体或稀释剂和作为活性成分的权利要求1至11之任一所要求的化合物。
17)一种通过治疗法用于治疗人或动物体的按照权利要求1至11之任一的化合物。
18)一种用于治疗致瘤性疾病的权利要求17所要求的化合物。
19)权利要求1至11之任一所要求的化合物在制造用于治疗致瘤性疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及肽和式(Ⅰ)的模拟肽化合物及包含它们的药物组合物,它们在控制或者治疗增殖性疾病(如癌);抗肿瘤生长和/或肿瘤转移及牛皮癣;控制或者治疗炎症、过敏、自身免疫、病毒和心血管疾病中是有用的药剂。这些新的化合物具有抑制识别所有细胞受体和胞质转导物内几种包含磷酸酪氨酸的基元的独特特性,这种抑制是通过存在于胞质转导物和不同信号转导过程中的其它效应物蛋白中的广谱SH2域和对衔接子转导物Grb2的SH2域的高度特异亲和性实现的,衔接子转导物Grb2是有丝分裂发生和运动发生途径的关键组分,这一最后的活性导致侵入和转移。本发明也涉及这些化合物的产生方法和使用这些化合物进行治疗的方法。
文档编号C07K5/02GK1185785SQ97190189
公开日1998年6月24日 申请日期1997年2月10日 优先权日1996年2月15日
发明者C·巴蒂斯蒂尼, P·吉奥达诺, S·德·洛萨, F·科拉迪, P·科莫格里奥, A·巴德里 申请人:法玛西雅厄普约翰公司