专利名称：用于在转基因雌禽卵中组织特异性合成蛋白质的载体与方法
技术领域：
本发明一般地涉及用以将遗传物质导入一鸡胚和其他鸟类胚胎中的载体与方法，更具体而言，涉及用以将一个目的基因转移到鸡胚细胞中以产生这样一种转基因雌禽的载体与方法，目的基因可在该雌禽输卵管中表达且此基因产物可在鸡卵和/或其后代中分泌。
背景技术：
自25年前重组DNA技术发展以来，大规模地生产蛋白质而不是从其天然表达的组织中提取的希望已成为现实。尤其是在近20年中，对表达载体的研究进展使得在实验室规模产生了上千种重组蛋白质。商业化数量的重组蛋白质的生产常常需要困难且昂贵的放大步骤，但也已获得成功。另外，已设计构建了包括鼠、兔、猪、绵羊、山羊及母牛在内的转基因动物，使其组织或分泌物中产生用于人类的药品。Houdebine,L.M.，生物技术杂志(J.Biotechnology)34:269-287(1994)。
尽管卵清被认为是产生重组蛋白质的出色宿主，转基因鸟类的制备存在技术上的困难，主要因鸡胚操作过程中出现的诸多问题。当产卵时，胚胎已处于相当于哺乳动物囊胚晚期或原肠胚早期的阶段。在较早期发育阶段过程中胚胎的遗传操作需要重新导入雌性体内或体外培养，这两步都是困难的。Houdebine,L.M.，生物技术杂志(J.Biotechnology)34:269-287(1994)。尽管存在上述困难，已产生了抗鸟造白细胞组织增生病毒感染的转基因鸡(Crittenden和Salter，药用及农用转基因牲畜模型(“Transgenic Livestock Models In Medicine And Agriculture”)73-87(Wiley-Liss(1990)))，或有高水平循环生长激素的转基因鸡。Bosselman,R.A.，等科学(Science)243:533-535(1989)。
已报道有四种产生转基因鸟类的常规方法。一种方法涉及自输卵管中切出正在发育的卵，将DNA显微注射入近囊胚层处以及在溶液与替代壳内对所处理的胚胎进行体外培养。Love,J.，等生物技术(Biotechnology)12:60-63(1994)。第二种方法则需培养和转染原生殖细胞，然后移植入照射过的与供体处于同一发育阶段的受体内。Carsience等发育(Development)117:669-675(1993)；Etches等，鸟类科学(PoultryScience)72:882-889(1993)。尽管技术要求很高，上述两种方法仍充满吸引力，因为可以转移大片段DNA。
第三种方法涉及用针将可复制的逆转录病毒盲注入(blind injection)新排下的卵的近囊胚层处。Petropoulos,CJ.，等病毒学杂志(J.Virol)65:3728-3737(1991)。虽然此法最简单，但也有局限，因为待转移的DNA大小必须约2kb或更小，而且本方法可产生有病毒血症的雌禽，后者可排出有感染性的重组逆转录病毒。Petropoulos,C.J.，等病毒学杂志(J.Virol)66(6):3391-3397(1992)。
第四种涉及一种复制缺陷型逆转录病毒载体系统(见如美国专利No.5,162,215和4,650,764,在此引入作为参考)。这些系统之一衍生于网状内皮组织增生病毒A型(REV-A)(Watanabe和Temin，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)3(12):2241-2249(1983))。Sevoian等，鸟类疾病(Avian Dis)8:336-347(1964)。来自REV-A的复制缺陷型逆转录病毒载体建立在辅助细胞系C3上(Watanabe和Temin，分子细胞生物学，3(12):2241-2249,(1983))，该细胞系包含有包装缺陷的辅助原病毒组分。在美国专利No.4,650,764及Watanabe和Temin，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)3(12):2241-2249(1983)中，详细描述了C3辅助细胞系的来源和几种复制缺陷型逆转录病毒载体。与可复制的方法相比，本方法技术要求更高，因为囊胚层必需暴露出来，而且必须使用显微注射设备。Bosselman,R.A.，等科学(Science)243:533-535(1989)。然而，这样可产生没有可复制的逆转录病毒的转基因雌禽，并能转移长达8kb大小的DNA。
运用可复制逆转录病毒技术，已在一种转基因鸡中实现一种外源基因的组织特异性表达。Petropoulos,C.J.，等，病毒学杂志(J.Virol)66(6):3391-3397(1992)。一种可复制逆转录病毒被用来将受一肌肉特异性启动子αaction引导的报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)转移至骨骼肌中。在转基因鸟类的卵中组织特异性地表达重组蛋白质目前尚未获成功。
因此，期望提供一种载体和方法用于将基因转入鸡胚(或其他鸟类)细胞中，以产生一种该基因可组织特异性表达的转基因雌禽。同样，期望提供一种载体和方法用于将基因转入鸡胚细胞中，使该基因在雌禽输卵管中表达且此基因产物可分泌入卵中。同样，期望提供一种载体和方法用于将基因转入鸡胚细胞中，使该基因在该雌禽输卵管中表达且此基因产物分泌入雌禽卵中，而无损该雌禽和其它与之有关的鸟类的健康。
发明概述提供了用以将遗传物质导入小鸡或其它鸟类细胞中的载体和方法。更具体而言，提供了用以将一种被转基因转移入一种鸡胚细胞中，从而产生一种被转基因可在其输卵管内表达并且被转基因产物可分泌入其卵及/或其后代中的转基因雌禽的载体和方法。在一种优选实施方案中，该被转基因产物在卵清中分泌。
在一个实施方案中，载体含有一种逆转录病毒基因组的一部分，其能转染细胞但无法进行复制，亦即，一种复制缺陷型逆转录病毒载体。此载体还含有一个被可操纵地连接到适当控制元件上的被转基因，这样该被转基因可以组织特异性地表达。在一个实施方案中，控制元件包括一种引导被转基因在输卵管中表达的增强启动子，一段有恰当长度及序列以增强翻译效率的位于结构基因(编码区)5’端的非翻译区，和一段引导被转基因产物分泌入卵清中的信号序列。在此实施方案中，启动子可以选自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵类粘蛋白启动子及其组合且不局限于此。在另一个实施方案中，控制序列包括一种引导被转基因在肝脏表达的启动子和一段引导被转基因产物吸收和分泌入卵黄中的信号序列。在此实施方案中，启动子可以选自卵黄原蛋白和载脂蛋白A启动子及其组合且不局限于此。
通过本领域技术人员熟知的方法如上述四种方法，本发明中的载体可被用来产生转基因鸟类，尤其是鸡(见发明背景)。例如，如引入此处供参考的美国专利No.5,162,215所描述的那样，可用载体将一段核苷酸序列如一个基因导入一种鸡胚的胚细胞及干细胞中。在一个实施方案中，将载体显微注射入一个新排下的鸡卵的接近囊胚层处(如正下方)。然后密封该卵，并孵育至小鸡孵出。然后在该转基因鸡中检测被转基因的表达，如果结果呈阳性且该鸡为雌性(母鸡)的话，则收集这只小鸡的卵并用本领域人员熟知的方法分离蛋白质。如果该鸡为雄性(公鸡)，则饲养之以产生雌性转基因鸡并收集其卵。这样提供了转基因鸟类和卵以及产生转基因鸟类和卵的方法。
从下列描述、所附权利要求再加上附图，可以明显看出本发明的其它特征及优点。
附图简介通过阅读以下详述和所附权利要求并参看附图后，本领域专业人员可以看出本发明的诸多优点，在附图中
图1为说明本发明中载体的产生及用载体产生转基因鸡的方法的示意图；图2为说明本发明中的一种优选载体的示意图；图3为说明本发明中逆转录病毒及表达载体的构建的示意图；图4为说明中间物#1pOVSV的构建的示意图；图5为说明中间物#2pSigl的构建的示意图；图6为说明中间物#3pSigPCR的构建的示意图；图7为说明中间物#4pUTR的构建的示意图；图8为说明中间物#5pUTRAN的构建的示意图；图9为说明中间物#6pERE1的构建的示意图；图10为说明中间物#7pERE的构建(注意图10中箭头是指位于寡聚核苷酸内部的ERE序列方向，而不是寡聚核苷酸本身的方向)；
图11为说明修饰过的原病毒载体的示意图；图12为说明潮霉素B磷酸转移酶基因3’端的修饰的示意图；及图13为说明潮霉素B磷酸转移酶基因N末端的修饰的示意图。
优选实施方案的详述提供了用以将遗传物质导入鸡细胞或其它鸟类细胞中的载体和方法。更具体而言，提供了用以将一种被转基因转移入鸡胚细胞以产生一种转基因雌禽的载体和方法，其中被转基因可在其输卵管中表达并且被转基因产物可分泌入鸡卵及/或其后代中。图1是本发明方法的示意图，包括载体构建及在转基因小鸡中的应用。
在一个实施方案中，载体含有一种逆转录病毒基因组的一部分，可以转染入一种细胞但不能复制，即是复制缺陷型逆转录病毒载体。优选来自REV-A病毒的复制缺陷型逆转录病毒载体。载体还含有一个目的基因，在此也称之为被转基因，该基因被可操纵地连接至恰当的控制元件上，以使被转基因产物可以组织特异性方式合成。
图2给出了本发明中优选的表达载体的示意图。应当理解的是示于图2中的3kb的β-半乳糖苷酶基因仅仅是一报告基因，它可被任何被转基因或其片段替代。例如可采用编码血液凝集蛋白如fⅧ的基因。被转基因产物或蛋白质分泌入卵清中然后被分离。一旦被纯化，该蛋白质可作药用如治疗血友病等。其它优选基因可包括但不局限于编码血液蛋白质如人血浆蛋白和α1-抗胰蛋白酶、造血生长因子包括促红细胞生成素及淋巴细胞生长因子如粒细胞集落刺激因子的基因。也可使用编码工业蛋白质如α-淀粉酶和葡萄糖异构酶的基因。另外，本发明中的载体也可包括编码抗体和其免疫反应部分的基因(见如Lilley等，免疫学方法(J.Immunol.Meth.)171:211-226(1994)和Davis等，生物技术(Biotechnol.).9:165-169(1991)，此处引入作为参考。
采用本领域技术人员周知的诸多方法中的任何一种，可以产生并纯化待转基因或其基因片段。因而，可以通过人工合成得到一个基因，或用逆转录酶处理此基因转录所得的mRNA以产生一段该基因的cDNA，或直接从一基因组文库或其它来源分离此基因。
位于被转基因旁侧的控制元件包括启动子和增强子、非翻译区和信号序列，其可使该被转基因组织特异性地表达。在一种实施方案中，启动子引导被转基因在转基因鸟类输卵管中表达。本发明的一种优选启动子选自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵类粘蛋白启动子及其组合。载体中的信号序列引导转基因产物分泌入卵清中。在另一个实施方案中，启动子引导被转基因在肝脏中表达，载体中的信号序列引导转基因产物分泌和吸收入卵黄中。在此实施方案中，启动子选自卵黄原蛋白和载脂蛋白A启动子及其组合。优选的增强子是病毒的增强子，包括但不限于SV40增强子或其一部分。除了被认为可结合转录因子的合成DNA，如类固醇激素应答元件(像此处描述的串联ERE)以外，也可采用溶菌酶的增强子。
在本发明的一实施方案中，如图2所示，目的基因旁侧的控制元件包括SV40增强子、三个串联雌激素应答元件(ERE)、1.3kb的卵白蛋白启动子(5’端旁侧)、77bp的5’端非翻译区(UTR)、来自鸡溶菌酶基因的N末端信号肽序列以及来自SV40小T抗原的多腺苷酸化信号和终止信号。序列表1给出了优选的构建体的核苷酸序列。在本发明的一个优选实施方案中，5kb长的XbaⅠ片段中有此构建体，该片段被插入到一种用于基因转移的复制缺陷型逆转录病毒载体中。优选的原病毒载体是质粒pSW272的衍生物。Emerman,M.，等细胞(Cell)39:459-467(1984)；美国专利No.4,650,764。正如援引于此处作参考的美国专利No.4,650,764所描述，已构建了可补充这些载体并产生对包装复制缺陷型逆转录病毒载体所必需的病毒蛋白质的细胞系。包装的载体只能感染一次细胞而不能持续感染。
用本领域技术人员已知的方法产生转基因鸟类，尤其是鸡时，本发明中的载体尤其有用。例如援引于此处作参考的美国专利No.5,162,215中所述，可用载体将一段核酸序列如一种基因导入一种鸡胚细胞。在一实施方案中，将载体在接近囊胚层处例如其正下方显微注射入被阻抑在X阶段(通常不超过十天，未被孵育过)的新排下的鸡卵中。更具体而言，通常用一个适于在卵壳上钻洞而无损于其下的壳膜的带旋转钻头的钻具在卵的一侧开一直径约5mm的口。然后用解剖刀或18号针头和拇指镊将膜切下，这样便切掉了部分卵壳和卵膜，暴露出胚胎。可用肉眼或放大6～50倍的光学解剖显微镜下进行观察。用显微操作器和一个极小直径的针头，优选为玻璃的，针尖外径40～60μm，针身外径为1mm，将含有本发明中的载体(通常为组织培养基)的溶液显微注射入囊胚层下方及周围处。用于显微注射的溶液体积优选为5～20μl。显微注射完毕，用壳膜和优选为胶或石蜡的密封物质将卵封好。然后将密封的卵在约38℃(99.5＂H)下孵育不同时段，达到并超过卵孵出所需的时间以保证胚胎的正常生长与发育。在胚胎和新孵出的小鸡的DNA中检测有无来自被显微注射的载体的序列。用本领域已知且适合用于检测特异性或目的基因的方法检测插入序列的存在，或检测基因产物的存在，只要该基因或基因产物(即蛋白质)存在，收集此转基因鸡的卵并分离蛋白质。
在另一个实施方案中，将载体或可产生包含被转基因的病毒的转染细胞通过体内方式注射入正发育的卵母细胞，例如引入此处作参考的Shuman和Shoffner，禽类科学(Poultry Science)65:1437-1444(1986)所述，然后是同样的孵育、孵出等步骤。
此处提到的术语“基因”或“被转基因”是指天然存在的或合成的可编码一蛋白产物的一段核酸。术语“核酸”是指自然及/或合成的线性、环状和顺序排列的核苷酸和核苷，如cDNA、基因组DNA(gDNA)、mRNA和RNA、寡聚核苷酸、寡聚核苷及其衍生物。术语“可操纵地连接”是指以一种容许被转基因转录的方式连接。术语“编码”是指在合适的表达体系中，该核酸可被转录并翻译成期望的多肽或蛋白质。例如在一合适的载体中(如表达载体)当需表达的核酸被连至恰当的控制元件，如启动子和增强子元件上时，以及将载体导入合适的体系或细胞时。此处“多肽”指一段氨基酸序列，包括全部长度的蛋白质及其片段。
术语“复制缺陷型逆转录病毒载体”是指含有部分逆转录病毒基因组、可以转染细胞但不能进行自由复制即多次感染的载体，这通常是因为病毒基因组的突变或缺失所致。术语“REV衍生的复制缺陷型载体”是指一种不能自由复制的网状内皮组织增生病毒载体。
术语“鸟类”可包括但不局限于鸡、鹌鹑、火鸡、鸭及其它家禽。术语“雌禽”包括所有雌性鸟类。“转基因鸟类”通常指有异源DNA序列或一个或多个附加的对于鸟类通常为内源性的DNA序列(在此统称为“被转基因”)整合入其胚细胞中染色体的鸟类。这样转移和整合的结果是，被转序列可自胚细胞传至转基因鸟类的后代。在转基因鸟类(包括其后代)中，被转基因也可以会偶然整合入体细胞的染色体中。
为了更全面地证明本发明的优点，列举下面的实施例。应当理解，下面所述仅意在举例，本发明的范围并不局限于此。
具体实施例1-载体构建讨论启动子卵白蛋白是卵清中含量最丰富的蛋白质。卵白蛋白在大输卵管的腺管细胞内合成，并被直接分泌入与正在形成的卵相连的管腔。卵白蛋白的启动子是已被很好地表征的复合启动子。见Houdebine,L.M.，生物技术杂志(J.Biotech)34:269-287(1994)。卵白蛋白启动子受所有已知的类固醇激素调节(Gaub,M.P.，等细胞(Cell)63:1267-1276(1990))，至少有8种不同的调节蛋白或蛋白组被认为结合在位于帽区(cap位点)5’端的长1.1kb的区域。这些蛋白质包括TATA结合蛋白复合物(TFIID)、雌激素受体、包括fos和jun基因产物及相关肽的活化蛋白1(AP-1)(Curran,T.，等细胞(Cell)55:395-397(1988))、鸡卵白蛋白上游启动子转录因子(COUP-TF)(Wang,L.，等自然(Nature)340:163-166(1989))和相关蛋白S300-Ⅱ(Sagami,I.，等分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)6(12):4259-4267(1986))，一个NF-κB样的核蛋白(Schweers,L.，等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)266(16):10490-10497(1991))及一个核因子Ⅰ(NF-Ⅰ)的同系物。Bradshaw,M.S.，等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263(17):8485-8490(1988)。负责这些相互作用的顺式作用序列包含在作为本发明优选启动子的1.3kb片段中。虽然本发明中的载体与方法尽力模拟了卵白蛋白的天然表达体系，卵白蛋白长约8kb的5，端调控区(Gaub,M.P等，细胞(Ceu)63:1267-1276(1990))加上其它下游元件(LeMeur,M.A.，等(EMBO Journal)3(12):2779-2786(1994))对一个逆转录病毒载体而言过于庞大。Emerman，M等，细胞，39:459-467(1984)。因此使用1.3kb长的片段。然而本领域技术人员应当理解，卵白蛋白的启动子可以含有能引导一个被转基因在输卵管内表达的卵白蛋白转录单位的任何部分。另外应当理解，虽然此处具体讨论的是卵白蛋白启动子，也可使用其它能在产生卵清的细胞中引导表达的启动子，包括但不限于溶菌酶、伴白蛋白和卵类粘蛋白的启动子及其组合。
在另一实施方案中，使用可使被转基因在肝脏中表达的启动子，例如卵黄原蛋白或载脂蛋白A的启动子及其组合。尽管卵黄原蛋白和载脂蛋白A在卵黄中含量丰富，它们是在肝脏中合成然后经血液运至卵黄的。通过可识别卵黄原蛋白前体的N端近侧片段的特异性受体的介导得以沉积在卵黄。因此本发明的载体当含有卵黄原蛋白或载脂蛋白A的启动子(或其组合)时，还含有一段在卵黄内可引导蛋白质的分泌和吸收的信号序列或独立序列。虽然需要一个血液来源的中间步骤，此种载体类型尤其适合用于生产抗体或在其它种类血液中发现的化合物。增强子SV40增强子以前曾被用来增强卵白蛋白启动子引导的表达。Dierich,A.，等EMBO Journal 6(8):2305-2312(1987)。已表明AP-1作用在卵白蛋白启动子近侧，SV40增强子可提高AP-1复合物或其某一部分的局部浓度。Curran,T.,等细胞(Cell)55:395-397(1988)。在卵白蛋白5’端尚有其它的控制元件未被纳入1.3kb长的卵白蛋白启动子中。Kaye等EMBO Journal 5(2):277-285(1986)，发现在卵白蛋白染色质5’侧翼有4个激素依赖的DNAaseⅠ高敏位点与卵白蛋白基因的表达相关。有两个位点被纳入此处采用的优选启动子内，另两个位点位点位于距帽区5’端的3.3kb和6kb处(相应地为位点Ⅲ和Ⅳ)。在-3.3kb处的位点Ⅲ位于675bp的Pst1-XbaⅠ片段内，此片段大约距帽区5’端3.7kb至3.1kb范围。该片段内有四个半回文结构的雌激素应答元件(ERE)，它们以一种协同方式增强卵白蛋白启动子引导的表达。Kato,S.，等，细胞(Cell)68:731-742(1992)。这些半EREs彼此间隔超过100bp。不过，融合和缺失实验已证明了这些元件在赋予截短的卵白蛋白启动子雌激素反应性方面的功能和必要性。Kato,S.，等，细胞(Cell)68:731-742(1992)。现在认为，几个不稳定结合的雌激素受体在此位点发生协同作用，产生更稳定的受体-DNA复合物，然后此复合物降低螺旋的稳定性或提高启动子附近的转录因子的局部浓度。
区域Ⅲ片段未被纳入本发明的优选载体内，取而代之的是一段含有位于一个单一ERE的5’端并与之相邻的全回文结构ERE的合成的寡聚核苷酸。与单一半位点相比，雌激素受体与回文ERE元件以二聚体结合，亲和力更强。将回文结构ERE和单一ERE间隔7个碱基对串联排列还可提高稳定性。Klein-Hitapaβ,L.，等分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)201:537-544(1988)。现在认为这个寡聚核苷酸在体内取代了一个-3.3kb处的高敏位点的功能。
串联排列的ERE可能对基因表达有正效应。已表明ERE可提高含不完善ERE的启动子的雌激素应答细胞内的基因表达。Tsai,S.Y.，等，细胞(Cell)57:443-448(1989)；Ponglikitmongkol,M.，等EMBO Journal9(7):2221-2231(1990)。卵白蛋白启动子中有不完善的ERE，可能合成的完善的共有ERE与天然的ERE之间有协同作用。
位于-6kb处的激素依赖的DNAseⅠ高敏位点包含在1.2kb内。对该DNA片段的融合研究未发现卵白蛋白启动子有雌激素反应性的增强作用。Kato,S,等，细胞(Cell)68:731-742(1992)。鉴于此，图2所示载体中未包括该部分或其类似序列。
曾有研究者证明，卵白蛋白基因对雌激素的应答必需一种由促生长因子、胰岛素或cAMP介导的细胞内磷酸化级联反应。Evans,M.L.，等，细胞(Cell)25:187-193(1981)。Evans,M.L.，等，内分泌学(Endocrinology)115(1):368-377(1984)。尽管这些研究已有十多年历史，而且目前对细胞内第二信使级联机制了解得更加详细，关于卵白蛋白启动子内特异性顺式作用序列的确切机制尚未得到明确证明。然而有理由设想，该机制涉及AP-1的结合，其顺式作用元件被纳入优选卵白蛋白启动子和SV40增强子中。Curran,T.，等，细胞(Cell)55:395-397(1988)。5’非翻译区5’非翻译区(UTR)是卵白蛋白RNA的一部分。卵白蛋白基因含有一剪接到第一编码外显子的5’先导外显子，以产生长为65碱基的非翻译区。O’Hare,K.等，核酸研究(Nucleic Acids Research)7(2):321-334(1979)。载体UTR序列几乎完全拷自cDNA以产生5’UTR，其与卵白蛋白RNA的5’UTR非常类似。仅有的差别是近5’端有一个对构建很重要的碱基的突变，有一附加的3’端接头，从而产生一长为77bp的UTR。77碱基的先导子更加符合Kozak的研究结果，该结果认为为达到最高翻译效率，至少需77个碱基(Kozak,M.，等，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)115(4):887-903(1991))。不过，可使用起始密码子周围的带有功能序列的任何UTR。信号序列信号肽负责将蛋白质运出细胞，信号肽序列理论已被充分发展。VonHeijne,G.，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)133:17-21(1983)；VonHeijne,G.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)184:99-105(1985)。在多数分泌蛋白质中，该序列位于新生蛋白质N端，在蛋白质合成和转运至内质网中时被切除。然而对于卵白蛋白，该序列居蛋白质内部且不被切除(Robinson,A,等FEBS 203(2):243-246(1986))，因此不适于用在表达载体内。本发明中的载体使用的是卵清溶菌酶的信号序列作为转运信号，这是由于此信号是一可被切除的N端序列，它可在体内鸡输卵管中发挥作用并可释放出具有酵母(Saccharomyces)的天然N端的蛋白质。Jigami,Y.，等基因(Gene)43:273-279(1986)。然而，本领域人员应当理解的是可以使用任何信号序列。基因图2所示的载体中使用β-半乳糖苷酶基因的原因有二。首先，长3kb，是可得到的最长的报告基因；许多编码有商业价值的蛋白质的基因均比之短得多。因此，如果该体系能表达β-半乳糖苷酶到卵中，那么同样也会表达其它基因。第二，可以容易地检测β-半乳糖苷酶的表达，这样有利于筛选本发明中的转基因雌禽所产的卵。应当理解的是，可以使用任何被转基因或其片段。3’控制区由于本发明中的转基因载体是一种逆转录病毒，其基因组为RNA，并且在基因组合成方向的转录终止信号可提前终止合成并产生低滴度的逆转录病毒。其它研究者使用过终止和多聚腺苷酸化信号，但发现效果甚微。Bradyopadhy,P.K.等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)4(4):749-754(1984)。如果置于相反方向，一个转录终止信号不会影响基因组的合成，但可能无法受益于逆转录病毒载体中更近侧LTR的增强效应。因此，就逆转录病毒载体而言，构建了双向表达载体。标准的终止密码子和已证实的来自SV40小T抗原的多聚腺苷酸化信号被纳入结构基因3’端。
材料与方法简介购自Promega公司的表达载体pSVβ-半乳糖苷酶中的3.5kb ClaⅠ-XbaⅠ片段上含有β-半乳糖苷酶基因及来自SV40小T抗原的转录终止信号和多聚腺苷酸化信号。质粒pOV1.7的1.7kb的PstⅠEcoRⅠ片段上含有卵白蛋白启动子(序列见Helig,R.，等分子生物学杂志(J.Mol.Biol)156:1-19(1982).Genback保藏号#J00895 M24999)。购自Promega公司的质粒pCAT-增强子的247bp的NcoⅠ-EcoRⅠ片段上含有SV40增强子。此构建体中所有其它的DNA均系从头合成。图3为逆转录病毒载体和表达载体的构建示意图。中间体1#的构建；pOVSV质粒pOV1.7在卵白蛋白基因的第一个内含子中有一HindⅢ位点，在帽区5’端1.37kb处有一PstⅠ位点(见图4)。将此pOV1.7上的PstⅠ HindⅢ片段连至pSVβ-半乳糖苷酶的HindⅢ和NsiⅠ位点(NsiⅠ有可与PstⅠ相容的末端)；产生名为pOVSV的质粒，见图4。pOVSV是用以构建最复杂的载体样式的8个中间体的第一个。中间体2#的构建；pSig1将一含有编码来自鸡溶菌酶的信号肽的核苷酸序列的合成接头插入pOVSV的SspBⅠ和ClaⅠ位点，见图5。产生的质粒为pSigⅠ。图5包括该核苷酸序列以及信号肽的氨基酸序列和起始密码子。中间体3#的构建；pSigPCR质粒pSigⅠ包含不期望的卵白蛋白启动子的3’端及β-半乳糖苷酶基因5’端的缺失。通过PCR可恢复β-半乳糖苷酶。采用与该基因内单一SacⅠ位点3’端的35bp杂交的3’端引物。其序列及PCR设计见图6。与β-半乳糖苷酶基因5’端杂交的5’端引物，含有包括单一Csp45Ⅰ位点和8个5’核苷酸的17个碱基的5’端伸出区。用Csp45Ⅰ酶切可产生与ClaⅠ酶切相容的末端。进行30个循环的PCR，以及用SacⅠ和Csp45酶切PCR产物后，在低熔点胶上纯化。将这段1.9kb片段连至pSigⅠ的单一ClaⅠ和SacⅠ位点上，从而恢复β-半乳糖苷酶基因并将其直接置于信号序列密码子的3’端且与其构成框架(见图6)。此质粒称为pSigPCR，并通过PvuⅠ酶切及随后的序列分析得以确证。中间体4#的构建；pUTR将编码卵白蛋白5’UTR的合成寡聚核苷酸连入pSigPCR的BgⅠⅡSspBⅠ位点。该寡聚核苷酸的近5’末端也含有一个Acc65Ⅰ位点(帽区周围)以保证启动子在后面步骤中得到恢复，(见图7)。正确的构建体用KpnⅠ酶切得以确证。这个质粒称之为pUTR，它含有在帽区3’端的所有必需元件。中间体5#的构建；pUTRAN将含有来自pOVSV的完整启动子的1.4kb的SspBⅠ部分-NcoⅠ限制性片段连至pUTR的NcoⅠ和Acc65Ⅰ位点上，以恢复启动子，见图8。正确的重组体用BglⅡSspB1双酶切得以验证。此质粒pUTRAN含有一个可引导构建体中所有必需下游元件表达的卵白蛋白启动子。中间体6#的构建；pERE1串联雌激素应答元件(ERE)含于一个合成的寡聚核苷酸中。由于ERE元件内部的反向重复区可形成茎环结构而阻碍退火后双链结构的形成，将该寡聚核苷酸分两步插入。第一个寡聚核苷酸含有两个同向ERE，二者被单一HindⅢ和SpeⅠ位点隔离开来。将这个寡聚核苷酸连到pUTRAN的单一NsiⅠ和NcoⅠ位点上形成质粒pERE1。pERE1还含有用于SV40增强子插入的AccⅢ和NcoⅠ位点，以及一个末端XbaⅠ位点，该位点可使随后的构建体插入到逆转录病毒载体的单一XbaⅠ位点。用XbaⅠ酶切和序列分析验证正确的重组体。中间体7#的构建；pERE将含有3’半位点的合成寡聚核苷酸连至pERE的单一HindⅢ和SpeⅠ位点上可产生一个完全回文结构的ERE。产生的质粒pERE含有一个完全回文结构的ERE和一个ERE半位点，二者相距7个碱基对(见图9和图10)。由于第二个寡聚核苷酸的连入使单一HindⅢ位点消失，用HindⅢBglⅡ双酶切验证正确的重组体。中间体8#的构建；pUCEREpERE质粒含有除SV40增强子之外的表达载体的所有元件。SV40增强子位于购自Promega的质粒pCAT-增强子的247bp的EcoRⅠNcoⅠ片段上。pERE含3个EcoRⅠ位点，2个NcoⅠ位点，这样可将它亚克隆入缺乏上述位点的载体中。
质粒pUC18仅含1个EcoRⅠ位点，缺乏NcoⅠ位点。用EcoRⅠ和BamH1(均在多克隆位点)酶切pUC18后，用Klenow聚合酶切成平端，然后自连接。用EcoRⅠ-ScaⅠ双酶切验证正确的缺失。修饰过的载体称为pUCΔBE，它含有用于将构建体亚克隆的单一XbaⅠ位点。随后，将含有该构建体的pERE的5kbXbaⅠ片段连入修饰过的载体的上述位点。该质粒称之为pUCERE。PWMO的构建在pUCERE的ERE5’端和XbaⅠ位点的3’端有NcoⅠ和EcoRⅠ位点，此位点是将质粒亚克隆入逆转录病毒载体中所必需的。该质粒还含有一个位于β-半乳糖苷酶基因内的额外EcoRⅠ位点，这就需要运用部分酶切策略。pUCERE用EcoRⅠ部分酶切，并分离出线性带。该DNA用NcoⅠ酶切，从低熔点胶中回收8kb片段，用标准方法分离pCAT-增强子的247bp的EcoRⅠ-NcoⅠ片段，将其连至pUCERE上。用Xbal-BglⅡ双酶切验证正确的重组体。此质粒称pWMO，在其5kb的XbaⅠ片段上含有被转基因的全部元件。pBCWM的构建pWMO和pSW272均可将氨苄青霉素抗性赋予宿主。为了在亚克隆入氨苄青霉素抗性的REV载体时降低背景质粒的水平，将pWMO的5kb插入区克隆到购自Stratagene(La Jolla,CA)的pBCSK+的单一XbaⅠ位点上，后者可将氯霉素抗性赋予宿主。pWMO用XbaⅠ酶切，并从低熔点胶上分离5kb片段。pBCSK+用XbaⅠ酶切，然后去磷酸化，再用琼脂糖纯化。将载体与插入片段连接，通过用XbaⅠ酶切在含氯霉素(34μg/ml)的LB培养板上生长的克隆的培养物来验证正确的重组体。在氯霉素抗性背景上该质粒含有完整的表达载体，其可插入到复制缺陷型逆转录病毒载体上。
具体实施例2-逆转录病毒载体设计与构建逆转录病毒载体设计pSW272质粒(Emerman和Temin，细胞(Cell)39:459-467)含有一个脾坏死病毒(SNV)，亦即现在的网状内皮组织增生病毒(REV)的缺失突变体。质粒包含的原病毒含有LTR、包装序列及可作为检测病毒滴度的选择性标志的胸苷激酶基因及其启动子。胸苷激酶启动子5′端有Xba Ⅰ单一位点。在以前研究中，将新霉素磷酸转移酶插入到此附近(在一个HindⅢ位点中)产生了另一个构建体pME111(Emermam和Temin，细胞(Cell)39:459-467(1984))，并成功地用此构件产生了一种转基因鸡(Bosselman，等，科学(Science)243:533-535(1989))。在同一研究中，将编码鸡生长激素的基因克隆入pSW272中，结果转基因鸡内的循环性生长激素水平显著高于非转基因对照组。为使其更好地用作表达载体，将pSW272进行修饰。
修饰逆转录病毒结构的目的包括用赋予潮霉素B抗性的基因代替胸苷激酶基因(这样就不再需要共转染，可是仍需对潮霉素基因末端重新设计)；去除引导潮霉素基因的5′启动子和其多聚腺苷酸化信号(这样可产生更稳定的结构)；提供一个在潮霉素基因3端的XbaⅠ信号以用于表达载体的插入。
分三阶段重新构建pSW272。第一阶段是删除疱疹病毒胸苷激酶的启动子和结构基因，用一合成的接头代替之。该连接子含有以后操作所需的位点，包括可允许pBCWM内5kb的表达构建体插入的位于3′端的单一XbaⅠ位点。第二阶段是将接头导入潮霉素抗性基因的5′和3′端，以使在该基因末端更具体地构建控制序列。第三阶段对四种不同排列的控制序列检测稳定转染C3细胞系的能力。选择可稳定转染C3细胞系的含最少控制序列的排列作为优选的原病毒载体。
逆转录病毒载体pSW272含有网状内皮组织增生病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)，以及由其自身启动子引导的选择性标志胸苷激酶(TK)。LTR位于原病毒末端，有启动子的功能。
就其自身而言，pSW272是一个稳定的结构，此处稳定是指可从基因组产生无内在缺失的全长逆转录病毒。选择性标志可用于检测TK-细胞内的逆转录病毒滴度，但无助于转染用来产生逆转录病毒所必需的辅助细胞。
另外，将表达载体插入pSW272然后将整个构建体转染入C3细胞系时会出现一些问题。此时构建体的结构含有两个内在的启动子。在此情况下，5′端或左侧启动子(此例中为卵白蛋白启动子)并不稳定，也就是说用该构建体转染后的细胞所产生的逆转录病毒在此区中经常缺失(Emerman和Temin，病毒学杂志(J.Virology)50(1):42-49)。
同一研究还证明，在此处的单个结构基因是稳定的，可由LTR引导表达，从而不再需要启动子。既然此基因实际上可为任何结构基因，它也可以为选择性标志。C3包装细胞系有内源性的TK活性，因此必须将其与带有潮霉素B抗性的质粒共转染。为产生更完善的结构，将编码潮霉素B磷酸转移酶的基因克隆到逆转录病毒载体上。
然后在单一XbaⅠ位点插入表达载体，产生一个稳定结构，不再需要共转染但仍可滴定CEF细胞内的病毒。
逆转录病毒载体的构建pREVΔ的修饰图3为逆转录病毒载体的构建示意图。胸苷激酶的启动子和结构基因位于2kb的XbaⅠ-XmaⅠ片段上，在pSW272中二者都是单一的。用XbaⅠ和XmaⅠ酶切pSW272，在低熔点胶上回收较大片段(约7kb)。将上述片段与一段含有5个限制性位点的合成寡聚核苷酸连接。用ClaⅠ酶切来验证产生的构建体pREVΔ，因为ClaⅠ可识别合成的接头内部的一个位点和原病毒DNA外部的另一个位点。
潮霉素B磷酸转移酶基因的修饰pREP4的修饰购自Invitrogen的pREP-4质粒上含有潮霉素B磷酸转移酶基因。然而在潮霉素B磷酸转移酶基因的5′端和3′端均存在问题。在5′端，起始密码子周围有一不利序列，具体说是在第二个框架外上游4bp处的第二个起始密码。3′端含有可影响逆转录病毒滴度的多聚腺苷酸化信号和需被切除的来自Raus肉瘤病毒(RSV)的LTR。3′端还缺乏用以产生所需构建体的适宜限制性位点，通过重新设计，将这些位点包含入内。
质粒用其控制信号的性质命名。例如，含有一个启动子和一个多聚腺苷酸化信号的构建体称为p++。类似地，含有一个启动子但无多聚腺苷酸化信号的质粒称为p+-。p++的构建用合成的双链寡聚物修饰潮霉素B磷酸转移酶基因的3′末端。图12示意了Hyg基因3′端的修饰。在此基因内部，距离终止密码子60bp处有单一ScaⅠ位点(见图12)。将包含ScaⅠ位点、潮霉素标记基因的C末端密码子和终止密码子、一个HindⅢ位点以及NsiⅠ和SalⅠ的末端的一段合成寡聚核苷酸克隆至pREP4的NsiⅠ和SalⅠ位点。用HindⅢ-NruⅠ双酶切验证正确的重组体。并称之为p++。p+-的构建用ScaⅠ将p++部分酶切，在低熔点胶上回收6.3kb的片段，使其自身连接，产生一个除终止密码子外无3′控制元件的潮霉素基因构建体(见图12)。用ScaⅠ-ClaⅠ双酶切验证正确的重组体，该重组体称为p+-。p-+和p-的构建用类似方法修饰N端密码子。AflⅢ在p++中为单一位点，恰位于潮霉素B磷酸转移酶基因起始密码子的5′端。一个AatⅡ位点位于潮霉素基因内25个碱基处，使AflⅢ-AatⅡ双酶切便于切除启动子。p++中AatⅡ位点并非单一，所以使用了一个双酶切策略。先用ClaⅠ和AatⅡ酶切p++，再在一个单独反应中用ClaⅠ和AflⅢ酶切。将酶切产物走低熔点胶，回收5.5kb的ClaⅠAatⅡ产物和2.4kb的Cla AflⅢ产物。用一合成寡聚核苷酸将这两段DNA连接起来(见图13)得到p-+。通过BclⅠ Alw N1双酶切和序列分析来验证正确的重组体，同样方式处理质粒p+-得到质粒p-。
单独对p++和p+-进行基因N端部分的操作，所产生的四种构建体包括了控制信号的所有排列组合，分别为1)有启动子和poly A信号--位于p++的NruⅠ-HindⅢ片段上；2)有启动子无poly A信号--位于p+-的NruⅠ-HindⅢ片段上；3)无启动子有poly A信号--位于p-+的BclⅠ-HindⅢ片段上；4)无启动子无poly A信号--位于p-的BclⅠ-HindⅢ片段上。
带有启动子的片段(上述1和2)被克隆入pREVΔ多克隆位点的SmaⅠ(XmaⅠ)和HindⅢ位点上。由于总要考虑到不完全酶切后的重新环化，将pREVΔ质粒在三个位点酶切SmaⅠ，HindⅢ和AccⅢ。从低熔点胶上回收得到的2个有合适长度的片段确保了对多克隆位点内两个位点的酶切，在一个三分子连接反应中将上述片段连至NruⅠ-HindⅢ片段上，可容易地产生所需质粒。这些质粒称为p++R和p+-R。
用类似方法将无启动子的潮霉素磷酸转移酶基因克隆入REV中。用BclⅠ和HindⅢ将潮霉素构建体(p-+和p-)酶切后，在一个三分子连接反应中将其克隆到经凝胶纯化的pREVΔ的BclⅠ、HindⅢ和AccⅢ片段上，称为p-+R和p--R。
按下述将表达载体插入这些逆转录病毒载体。每个逆转录病毒载体都含有一个单一XbaⅠ位点。合适的质粒经XbaⅠ切开、去磷酸化并进行凝胶纯化。pBCWM包含的表达载体是位于一氯霉素抗性质粒上的5kb的XbaⅠ片段。pBCWM经XbaⅠ酶切，从低熔点胶上回收得到的5kb片段，将其连至合适的逆转录病毒载体上。通过XbaⅠ酶切来验证正确的重组体，并用EcoRⅠ酶切来检查方向。这些质粒用它们的逆转录病毒载体命名，再加上添加的酶和克隆编号。例如p++RE1即为，有启动子、多聚腺苷酸化信号、在REV上并有方向1的表达载体。
具体实施例3-基因转移方法1对一种给定的逆转录病毒载体，把两个方向的构建体中的每一个都转染入C3细胞系，筛选稳定的克隆。从克隆中分离出DNA并用Southern印迹法对整合的完整的原病毒DNA进行分析。在经潮霉素抗性筛选的CEF细胞内扩增及分析用于逆转录病毒的适宜的克隆。产生高滴度的克隆用于产生逆转录病毒，其通过过滤及/或离心使之进一步浓缩。
当找到可产生高滴度的完整病毒DNA的克隆时，将其注射入卵中，如美国专利No.5,162,215和Bosselman,R.A.等科学(Science)243:533-535(1989)所述，在此引入作为参考。新排下的O系SPF卵获自SPAFAS(Preston,CT)，保持20℃侧放至少5个小时。卵的顶部用70％乙醇预处理并在空气中干燥。然后用一个配有钢毛口的Dremmel motool把壳打开口。在囊胚层下方显微注射入15～25微升含逆转录病毒载体的溶液。封好卵口并在Humidaire孵箱中温育直至孵出。
孵出10天后，采集鸡血，用Southern印迹和PCR检测基因组中是否存在病毒DNA。待所有的鸡发育成熟后，检测这些嵌合鸡的卵中有无β-半乳糖苷酶，并用Southern印迹法检测公鸡精液中的病毒DNA。精液阳性的公鸡用来产生真正的杂合转基因鸡-G2鸡。
方法2把pBCWM的5 kb插入区(表达载体)用XbaⅠ酶切、去磷酸化、并在低溶点凝胶上纯化后，连至pREVΔ或p+-上。通过XbaⅠ酶切来筛选插入的克隆，并用EcoRⅠ酶切来检测插入方向。
在一个6孔板(孔径35mm)上以每孔2-3×105个细胞的浓度接种C3细胞并在37℃,10％CO2条件下培养过夜，所用培养基DMEM内包含有高浓度葡萄糖及L-谷氨酰胺、10mM HEPES、7％小牛血清、400μg/mlG-418、100μg/ml庆大霉素、5μg/ml两性霉素(两性霉素B)、100单位/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素。按照制造商说明，以1.5μgDNA:8μl脂质转染胺的比例用脂质转染胺试剂(Gibco LifeTechonologies)转染细胞。5个小时后抽吸掉转染培养基，换为含7％小牛血清和HEPES的0.5mlDMEM。温育48小时后除去培养基，用于显微注射或通过超滤法用截留分子量50kd的滤膜将培养基浓缩20倍后再用于显微注射。
新排下的白色来亨(leghorn)鸡的受精卵SPF获自SPAFAS，将其侧放至少5个小时。用一配有钢切割头的Dremmel mototool从卵的最顶端完整切下一块约0.5cm2的五角形蛋壳(113部分)。用一18号注射针切下壳膜。微量移液管由Sutter牵引器牵引，用剃刀片修整，并在显微镜下检查其直径和尖的角度。用Narishige显微操纵器(MN-151型)和显微注射器(IM-6型)将15至20μl培养基注入胚下空隙中。孔由供体膜补盖，该膜来自在含有上述浓度青霉素G和硫酸链霉素的PBS中短暂浸泡的卵的同一区域。把切下的蛋壳放到供体膜上面，空气干燥10分钟。用DUCO粘和剂封好边缘，空气干燥至少30分钟。然后将卵放入Humidaire温箱中按照厂家说明孵育。
从上述描述中本领域专业技术人员可以理解的是，根据本发明中的教导可以以多种形式实施。因此，尽管采用具体实例描述了本发明，本发明的真正范围不应仅限于此，因为对本专业人员来说，研究附图、说明及下列权利要求后便会发现其它修饰是显而易见的。
在此引用的所有专利和其他出版物均被明确地收入参考文献。
Sequence ID No.权利要求
1．一种复制缺陷型逆转录病毒载体，它包括a)一种被转基因；和b)被可操纵地连接到被转基因上且能引导被转基因产物在鸟类卵清中合成的控制元件，其中控制元件包括一种启动子、一段5’非翻译区和一段信号序列。
2．权利要求1的载体，其中复制缺陷型逆转录病毒载体来自REV-A。
3．权利要求1的载体，其中启动子选自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵类粘蛋白启动子及其组合。
4．权利要求1的载体，其中鸟类为鸡。
5．权利要求1的载体，其中控制元件还包括一种增强子。
6．权利要求3的载体，其中启动子包括一种卵白蛋白启动子。
7．权利要求5的载体，其中增强子包括一种类固醇激素应答元件。
8．权利要求5的载体，其中增强子是一种病毒增强子。
9．权利要求8的载体，其中增强子是SV40的一部分。
10．一种复制缺陷型逆转录病毒载体，它包括a)一种被转基因；和b)被可操纵地连接到被转基因上且能引导被转基因产物在鸟类卵黄中合成的控制元件，其中控制元件包括一种启动子、一段5’非翻译区、一段信号序列和一段吸收序列。
11．权利要求10的载体，其中复制缺陷型逆转录病毒载体来自REV-A．
12．权利要求10的载体，其中启动子选自卵黄原蛋白和载脂蛋白A启动子及其组合。
13．权利要求10的载体，其中的鸟类为鸡。
14．权利要求10的载体，其中控制元件还包括一种增强子。
15．权利要求14的载体，其中增强子包括一种类固醇激素应答元件。
16．权利要求14的载体，其中增强子是一种病毒增强子。
17．权利要求16的载体，其中增强子是SV40的一部分。
18．一种将一被转基因转移至鸡胚细胞中的方法，其包括把复制缺陷型逆转录病毒载体导入细胞内的步骤，其中的载体包括被转基因和被可操纵地连接到该基因上且能引导被转基因产物在卵清中合成的控制元件，其中控制元件包括一种启动子、一段5’非翻译区和一段信号序列。
19．权利要求18的方法，其中复制缺陷型逆转录病毒载体来自REV-A。
20．权利要求18的方法，其中控制元件还包括一种增强子。
21．权利要求18的方法，其中启动子选自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵类粘蛋白启动子及其组合。
22．权利要求20的方法，其中增强子包括一种类固醇激素应答元件。
23．权利要求20的方法，其中增强子是一种病毒增强子。
24．权利要求23的方法，其中增强子是SV40的一部分。
25．一种将一被转基因转移到鸡胚细胞中的方法，其包括把复制缺陷型逆转录病毒载体导入细胞内的步骤，其中的载体包括被转基因和被可操纵地连接到该基因上且能引导该被转基因产物在卵黄中合成的控制元件，其中控制元件包括一种启动子、一段5’非翻译区、一段信号序列和一段吸收序列。
26．权利要求25的方法，其中复制缺陷型逆转录病毒载体来自REV-A。
27．权利要求25的方法，其中控制元件还包括一种增强子。
28．权利要求25的方法，其中启动子选自卵黄原蛋白和载脂蛋白A启动子及其组合。
29．权利要求27的方法，其中增强子包括一种类固醇激素应答元件。
30．权利要求27的方法，其中增强子是一种病毒增强子。
31．权利要求30的方法，其中增强子是SV40的一部分。
32．一种产生转基因鸡的方法，包括下列步骤a)在被抑制在X阶段且含有胚胎的鸡卵上打一开口，暴露出囊胚层；b)经开口把溶液显微注射入囊胚层周围的区域，该溶液中含有复制缺陷型逆转录病毒载体，该载体包括一种被转基因和被可操纵地连接到该基因上且能引导该被转基因产物在卵清中合成的控制元件，其中控制元件包括一种启动子、一段5’非翻译区和一段信号序列；c)显微注射完毕密封开口；并d)温育该卵至鸡孵出。
33．权利要求32的方法，其中复制缺陷型逆转录病毒载体来自REV-A。
34．权利要求32的方法，其中控制元件还包括一种增强子。
35．权利要求32的方法，其中启动子选自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵类粘蛋白启动子及其组合。
36．权利要求34的方法，其中增强子包括一种类固醇激素应答元件。
37．权利要求34的方法，其中增强子是一种病毒增强子。
38．权利要求37的方法，其中增强子是SV40的一部分。
39．一种产生转基因鸡的方法，包括下列步骤a)在不超过7日龄且含有胚胎的鸡卵上打一开口，暴露囊胚层；b)经开口把溶液显微注射入囊胚层周围的区域，该溶液中含有复制缺陷型逆转录病毒载体，该载体包括一种被转基因和被可操纵地连接到该基因上且能引导该被转基因产物在卵黄中合成的控制元件，其中控制元件包括一种启动子、一段5’非翻译区、一段信号序列和一段吸收序列；c)显微注射完毕密封开口；并d)温育该卵至鸡孵出。
40．权利要求39的方法，其中复制缺陷型逆转录病毒载体来自REV-A。
41．权利要求39的方法，其中控制元件还包括一种增强子。
42．权利要求39的方法，其中启动子选自卵黄原蛋白和载脂蛋白A启动子及其组合。
43．权利要求41的方法，其中增强子包括一种类固醇激素应答元件。
44．权利要求41中的方法，其中增强子是一种病毒增强子。
45．权利要求44的方法，其中增强子是SV40的一部分。
全文摘要
提供了用以将遗传物质导入鸡或其它鸟类细胞中的载体和方法。更具体而言,提供了用以将一种被转基因转移入鸡胚细胞中,从而产生一种该被转基因可在其输卵管内表达并且被转基因产物可分泌入其卵及/或其后代中的转基因雌禽的载体和方法。在一种优选实施方案中,该被转基因产物被分泌入卵清中。
文档编号C07H21/00GK1225127SQ97196343
公开日1999年8月4日 申请日期1997年6月6日 优先权日1996年6月12日
发明者W·麦卡瑟 申请人:密执安州立大学执行理事会, 基因工程责任有限公司