专利名称：一种新的人蛋白质及其编码序列,以及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人Rab4b的cDNA序列，该蛋白是大鼠Rab4的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
在真核细胞内，膜泡运输是胞内物质运输的重要方式。细胞的内吞作用，胞吐作用，内质网与高尔基体之间、高尔基体各囊膜之间的物质运输过程，以及高尔基体形成溶酶体的过程都是由各类运输小泡所介导的。运输小泡以出芽的方式从供体膜上产生，然后通过与特定受体膜的融合，将小泡中包含的物质转运到另一细胞器中或者实现细胞内外物质的交流。
研究表明，一类低分子量的GTP/GDP结合蛋白Ypt/Rab蛋白，在调节膜泡运输过程中起着重要的作用。Ypt/Rab蛋白和Ras蛋白同属于GTP/GDP结合蛋白超家族。它们在蛋白结构上存在四个与GTP/GDP结合作用相关的保守区域GXXXXGKS/T，DTAGQE，NKXD和SAK/L(Nature 1989，341(6239)209-214)。除此之外，在Ypt/Rab蛋白家族中，保守的位点还有DTAGQE区前的色氨酸，DTAGQE区后相距约10个氨基酸的精氨酸以及SAK/L区后的苯丙氨酸等。
在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的Ypt/Rab家族成员共有11个(Ypt1，Sec4，Ypt31，Ypt32，Ypt51，Ypt52，Ypt53，Ypt6，Ypt7，Ypt10，Ypt11)(TrendsBiochem Sci1997；22(12)468-472)；在哺乳动物中，已发现的Rab蛋白约有40个，如Rab1，Rab3，Rab8，Rab10，Rab30等。1987年，Touchot，N.等首先报导从大鼠脑cDNA库中分离了Rab4 cDNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，84(23)，8210-8214)。1989年，Zahraoui A等又从人的副神经节瘤cDNA库中也分离到了大鼠Rab4的同源基因。以后在小鼠、Dictyostelium discoideum(一种网柱菌属生物)等中了也发现了Rab4的同系物。
Ypt/Rab蛋白家族成员的多样性提示，不同的蛋白可能在不同的膜泡运输途径的不同步骤中发挥作用。例如，Sec4蛋白参与了高尔基体分泌小泡向质膜的运输过程(Cell 1987；49(4)527-538)，而Rab8被证明介导了极化的MDCK细胞中由TGN区向基底外侧区的膜泡运输(J Cell Biol 1993；123(1)35-45)。Rab1与从内质网到高尔基体顺式面及随后的从高尔基体顺式面到中间高尔基体的囊泡运输有关(J.Cell.Biol.1991，115，31-43)；Rab3A可能在神经递质的释放有关(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87，1988-1992)。Rab4和Rab5则参与了核内体的融合过程，并被认为控制了内吞过程的限制性步骤(Cell，1990，62，317-329；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；Cell，1992，70，729-740；Cell，1991，64，915-925；Cell，1992，70，715-728)。
Rab蛋白在介导膜泡运输过程中还涉及到其它因子如GDP解离抑制因子(GDP-dissociation inhibitor，GDI)，GTP/GDP交换因子(GTP/GDP-exchangefactor，GEF)，GTP酶活化因子(GTPase-activating protein，GAP)，GDI置换因子(GDI-displacement factor，GDF)的共同作用。
在介导膜泡运输中Rab蛋白的循环过程如下(a)在细胞质中，GDI与Rab-GDP结合，抑制了Rab蛋白非选择性地与膜结合。(b)Rab-GDP在牻牛儿基牻牛儿基转移酶(geranylgeranyltransferase，简称为“GGTase”)的作用下，使Rab蛋白C末端两个半胱氨酸的异戊二烯化。异戊二烯化是Rab与质膜结合所必需的。GGTase包含两个组分组分A又称Rab护卫蛋白(Rab escort protein，REP)，此蛋白与未异戊二烯化的Rab蛋白结合并将其呈递给催化组分B，催化组分B负责催化半胱氨酸的异戊二烯化。异戊二烯化的Rab蛋白在GIP作用下定位于特定的供体膜上(Cell 1993；73(6)1091-1099)。当Rab-GDP结合于供体膜上时，GDI在GDF作用下从Rab上解离下来。(c)在GEF催化作用下，GTP替换下了Rab上的GDP从而活化了Rab。(d)运输小泡以出芽方式从供体膜上产生。(e)在GTP-Rab的介导下(或者还有受体膜上的效应分子的共同作用下)，运输小泡与受体膜结合，GTP在GAP催化下发生水解。(f)GDI与受体膜上的Rab结合，将Rab重新释放到细胞质中(Curr Opin Cell Biol，1997，9(4)496-504)。
此外，Rab蛋白与某些疾病存在一定的相关性。例如，1993年Culine S.等报道，在Sezary综合征病人的外周血单核细胞中，Rab2表现为过度表达，这提示Rab2可能在肿瘤发生的免疫反应中发生作用(Leuk Lymphoma 1998；28(5-6)515-522)。
然而，在本申请之前，还没有公开或发表过本发明所涉及的这种Rab蛋白或其编码序列。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码Rab/Ypt家族的一个新成员，本发明的Rab/Ypt家族成员被命名为人Rab4b。
本发明的另一个目的是提供一种新的人的Rab/Ypt家族成员，该蛋白被命名为人Rab4b蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的Rab4b多肽的方法。
本发明还提供了这种人的Rab4b核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人Rab4b蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人Rab4b蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Rab4b蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Rab4b蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人Rab4b蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Rab4b蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为988个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于89-730位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人Rab4b蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人RAB4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中89-730位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框89-730位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中89-730位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人Rab4b相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人Rab4b蛋白多肽”指具有人Rab4b蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人高效淋巴细胞趋化因子相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人Rab4b蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人Rab4b DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人Rab4b多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人Rab4b多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人Rab4b多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人Rab4b多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人Rab4b蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人Rab4b多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人Rab4b保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还包括人Rab4b多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人Rab4b的表达。
本发明还包括一种可用作探针和引物的核酸分子，该分子通常具有人Rab4b多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人Rab4b的核酸分子。
本发明还包括检测人Rab4b核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人Rab4b多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用各种市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人Rab4b DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Rab4b基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Rab4b基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人Rab4b蛋白的分子，也包括那些并不影响人Rab4b蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人Rab4b基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人Rab4b基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人Rab4b或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6511，1976；Kohler等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人Rab4b功能的抗体以及不影响人Rab4b功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人Rab4b基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人Rab4b基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人Rab4b核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明中，人Rab4b的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15’-AGATTACTATGGAGATCTGGCTG -3′为正向引物，寡核苷酸A25′-GGAGCTCTTGGGATATGGTTAGG-3’为反向引物，进行PCR。测序后得到SEQID NO.3的全长cDNA序列。
Rab/Ypt家族调控了真核细胞内的膜泡运输。Rab/Ypt家族成员的多样性提示不同成员在膜泡运输的不同途径不同步骤中发挥作用。对已发现的一些Rab4基因/蛋白的研究显示，Rab4与早期内吞体相联系(Proc.Nat.Acad.Sci.USA1991，88，6313-6317；J.Cell.Biol.1993，121，997-1010)并且被认为可能参与了细胞表面受体(如转铁蛋白受体)从内吞体到细胞膜表面的循环过程(Cell，1992，70，729-740)。这样，Rab4向胞质的分配可能既影响了胞吐过程，也影响了胞吐过程。特别是有关实验说明，Rab4与携带葡萄糖转运复合物GLUT4的囊泡紧密联系，可能与胰岛素诱导的GLUT4的转移有关，从而与胰岛素的作用机制相关。另外，实验还暗示Rab4还可能参与了有丝分裂期膜运输的抑制机制。
在附图中，
图1为本发明的人Rab4b(hRab4b)与狗Rab4蛋白(dRab4)和大鼠Rab4b蛋白(rRab4b)之间的氨基酸序列同源比较图。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人Rab4b的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15’-AGATTACTATGGAGATCTGGCTG-3’(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸A25’-GGAGCTCTTG GGATATGGTTAGG-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、66℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到约1000bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A1/A2与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共988bp，详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于89-730位核苷酸。
根据得到的全长基因组序列推导出人Rab4b的氨基酸序列，共213个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO4。
实施例2同源比较用本发明的人Rab4b的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它们与Rab/Ypt家族基因及其编码蛋白具有广泛的同源性，例如，它与狗Rab4、大鼠Rab4b、小鼠Rab4a、人Rab4a等在蛋白水平上的同一性(又称为“相同性”)分别达到98％(图1)、98％(图1)、84％和84％。另外，与Rab/Ypt家族的其他成员如Rab2，Sec4，Ypt1等也具有很高同源性(数据未给出)。
对氨基酸保守区的研究分析表明，本发明的人Rab4b蛋白与其同系物在蛋白结构上存在四个与GTP/GDP结合作用相关的保守区域GXXXXGKS/T，DTAGQE，NKXD和SAK/L(Nature 1989，341(6239)209-214)，因此，本发明的人Rab4b蛋白可归入GTP/GDP结合蛋白超家族。除此之外，本发明的人Rab4b蛋白还具有Ypt/Rab蛋白家族特异保守位点如DTAGQE区前的色氨酸，DTAGQE区后约10个氨基酸距离的精氨酸以及SAK/L区后的苯丙氨酸等。这都进一步证实了本发明蛋白是Rab4b蛋白在人体中的同系蛋白。
Rab4已被证实与早期内吞体相联系(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；J.Cell.Biol.1993，121，997-1010)，并且被认为可能参与了细胞表面受体(如转铁蛋白受体)从内吞体到细胞膜表面的循环过程(Cell，1992，70，729-740)。这样，Rab4向胞质的分配可能即影响了胞吐过程，也影响了胞吐过程。
体外研究显示，Rab4可以作为cdc2这一在有丝分裂期表现活力的激酶的底物，特别是在完整细胞及体外实验中都证实了，Rab4羧基端cdc2识别位点的点突变会影响cdc2对Rab4的磷酸化(Nature，1991，350，715-718；EMBO J，1992，11，4379-4389)。1997年，Ayad，N等发现在有丝分裂细胞中，Rab4的磷酸化与它在胞质中的聚集过程相联系(EMBO J，1997，16(15)，4497-4507)。以上事实都暗示，Rab4的磷酸化可能与细胞有丝分裂期间膜运输的抑制有关。
胰岛素的一个主要作用是促进肌细胞和脂肪细胞对葡萄糖的摄取。这些细胞表达有对胰岛素敏感的葡萄糖转运复合物GLUT4。在胰岛素刺激下，携带该复合物的囊泡由胞内移至细胞表面，从而激发了细胞对葡萄糖的摄取(J.Biol.Chem.1980，255，4758-4762；Eur.J.Biochem.1994，219，713-725)，然而对其中胰岛素诱导的GLUT4的转动运程的机制仍不清楚，据认为应和胞吐作用相关。Rab4在大鼠脂肪细胞(J.Biol.Chem.1993，268，19491-19497)和3T3-L1脂肪细胞(FEBS Lett，1994，347，42-44)中都有表达，并且与携带GLUT4的囊泡紧密联系(J.BIOL.Chem.1993，268；Biochem.Biochem.Res.Commun.1995，215，321-328；Endocrinology 1996，137，266-273)。胰岛素的作用使得Rab4从囊泡转移到了胞质中(J.Biol.Chem.1993，268)，当胰岛素不再作用时，这一过程可以被逆转，所以Rab4可能与胰岛素诱导的GLUT4的转移有关。上述猜测已被进一步的实验所证实。Shibata，H.等人发现受胰岛素诱导的Rab4上的鸟嘌呤核苷酸交换是以一种wortmannin敏感方式进行的，这证明了Rab4是受胰岛素诱导的磷酯酰肌醇3激酶的底物(J.Biol.Chem.1997，272(23)，14542-14546)。另一个实验中，对3T3-L1注射无论是Rab4的GTP结合缺陷型，还是Rab4的抗体都能使GLUT4的转运明显下降(Endocrinology，1997，138(11)，4941-4949)而对照组则无这些现象。由于胰岛素同样能诱导3T3-L1细胞的细胞骨架重排(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，93，8401-8406)；对于Rab4在这方面的作用同样进行了上述实验并初步证实了Rab4在其中的作用。
本发明的人Rab4b不仅可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人Rab4b还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人Rab4b的N端与小鼠的Rab4蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人Rab4b的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人Rab4b核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人Rab4b的表达水平或者抑制人Rab4b的过度表达。本发明的人Rab4b蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人Rab4b缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人Rab4b在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码人Rab4b的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人Rab4b cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TCAGGTCGACATGGCTGAAGACAGACACT-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人Rab4b编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TTGGAAGCTTTCAGCAGCCACACGGCTGAG-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人Rab4b的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人Rab4b的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人Rab4b。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人Rab4b。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约24KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人Rab4b在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人Rab4b的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人Rab4b cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TCAGAAGCTTATGGCTGAAGACAGACACT-3′(SEQ ID NO.7)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人Rab4b编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TTGGGAATTCTCAGCAGCCACACGGCTGAG-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人Rab4b的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人Rab4b的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1MNaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为24Da。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人Rab4b基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白特异性地发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称一种新的人蛋白质及其编码序列，以及制法和用途(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1AGATTACTAT GGAGATCTGG CTG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GGAGCTCTTG GGATATGGTT AGG 23(2)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)长度988bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3AGATTACTAT GGAGATCTGG CTGCTCGCCT GGGCTATTTC CCCAGTAGCA TTGTCCGAGA 60GCACAGACCC TGAAACCTGG CAAAGTCGAT GGCTGAAGAC AGACACTTCC TCTTCAAATT 120CCTGGTGATT GGCAGTGCAG GAACTGGCAA ATCATGTCTC CTTCATCAGT TCATTGAGAA 180TAAGTTCAAA CAGGACTCCA ACCACACAAT CGGCGTGGAG TTTGGATCCC GGGTGGTCAA 240CGTGGGTGGG AAGACTGTGA AGCTACAGAT TTGGGACACG GCTGGCCAGG AGCGGTTTCG 300GTCAGTGACG CGGAGTTATT ACCGAGGGGC GGCTGGAGCC CTGCTGGTGT ACGACATCAC 360CAGCCGGGAG ACATACAACT CACTGGCTGC CTGGCTGACG GATGCCCGCA CCCTGGCCAG 420CCCCAACATC GTGGTCATCC TCTGTGGCAA CAAGAAGGAC CTGGACCCTG AGCGGGAGGT 480CACTTTCCTG GAGGCCTCCC GCTTTGCCCA GGAGAATGAG CTGATGTTCC TGGAGACCAG 540CGCTCTCACA GGCGAGAACG TGGAGGAGGC GTTCCTCAAG TGTGCCCGCA CTATCCTCAA 600CAAGATTGAC TCAGGCGAGC TAGACCCGGA GAGGATGGGC TCTGGCATTC AGTACGGGGA 660TGCGTCCCTC CGCCAGCTTC GGCAGCCTCG GAGTGCCCAG GCCGTGGCCC CTCAGCCGTG 720TGGCTGCTGA GCTCTGTGGA GCCAGCTCAC CTGTTCTCCA GGACCAGCCC TGCTGGGCCC 780AGGCCCAGGC TCTGAGAGGC CGTGTCCTAA CCTGCCCTGG CCCCGGAGAA GCTACGTTGC 840CACCTGTCCC CCTTCCCTGG CCTGGTGGGG CCTGGCTTTG GGGCAAGACT GAGCCACGGG 900GGAAGGGGGA ATCCCGTACC TGCTGCTGCT TCCTCTGTCT TGGCTAACGT CTGTCCCCCT 960GAACCCCTAA CCATATCCCA AGAGCTCC 988(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度213个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ala Glu Asp Arg His Phe Leu Phe Lys Phe Leu Val Ile Gly 15Ser Ala Gly Thr Gly Lys Ser Cys Leu Leu His Gln Phe Ile Glu 30Asn Lys Phe Lys Gln Asp Ser Asn His Thr Ile Gly Val Glu Phe 45Gly Ser Arg Val Val Asn Val Gly Gly Lys Thr Val Lys Leu Gln 60Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Ser Val Thr Arg 75Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Tyr Asp Ile 90Thr Ser Arg Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Ala Ala Trp Leu Thr Asp 105Ala Arg Thr Leu Ala Ser Pro Asn Ile Val Val Ile Leu Cys Gly 120Asn Lys Lys Asp Leu Asp Pro Glu Arg Glu Val Thr Phe Leu Glu 135Ala Ser Arg Phe Ala Gln Glu Asn Glu Leu Met Phe Leu Glu Thr 150Ser Ala Leu Thr Gly Glu Asn Val Glu Glu Ala Phe Leu Lys Cys 165Ala Arg Thr Ile Leu Asn Lys Ile Asp Ser Gly Glu Leu Asp Pro 180Glu Arg Met Gly Ser Gly Ile Gln Tyr Gly Asp Ala Ser Leu Arg 195Gln Leu Arg Gln Pro Arg Ser Ala Gln Ala Val Ala Pro Gln Pro 210Cys Gly Cys 213(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGGCTGAAG ACAGACACT 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度30碱基(B)类型核酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TCAGCAGCCA CACGGCTGAG 30(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGGCTGAAG ACAGACACT 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度30碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TCAGCAGCCA CACGGCTGAG 30
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列。
4.一种分离的人Rab4b蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人Rab4b蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Rab4b蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Rab4b蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人Rab4b蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Rab4b蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸89-730位。
12.一种能与权利要求4所述的人Rab4b蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的人基因核苷酸序列,更具体地说,本发明提供了人Rab4b的cDNA序列,该序列编码的蛋白是大鼠Rab4的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C07K14/435GK1257124SQ98125320
公开日2000年6月21日 申请日期1998年12月11日 优先权日1998年12月11日
发明者余龙, 张宏来, 屠强, 赵勇, 傅强 申请人:复旦大学