专利名称：13－脱氧蒽环类抗生素衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及13-脱氧蒽环类抗生素衍生物及其制备方法。所述13-蒽环类抗生素衍生物没有对心脏毒性副作用。
背景技术：
与所有其它癌化学治疗剂相比，蒽环类抗生素具有最广谱的抗人癌活性。最周知的蒽环类抗生素类抗癌药是含13-酮基的阿霉素和柔红霉素。其中，美国专利No.3,590,028中公开的阿霉素具有广谱抗癌疗效，除白血病、淋巴瘤和实体肿瘤之外是对肉瘤和癌最有效的药物之一。
美国专利No.3,616,242中公开的接近的结构类似物柔红霉素对肉瘤和癌无效，这种差异似乎是由于柔红霉素缺少14-OH。然而，柔红霉素可用于治疗急性白血病。
但蓄积性心脏毒性限制了这些药物的应用。基于这些原因，心脏毒性通常将用常用剂量的阿霉素进行治疗的持续时间限制至约9个月。阿霉素或柔红霉素的总累积剂量不能超过550 mg/m2(E.A.Lefrak等，Cancer，32302，1973)。即使是或接近推荐的最大总累积剂量(430-650mg/m2)，在60％的患者中也出现显著和持续的心脏功能失调，14％的患者出现充血性心力衰竭(A.Dresdale等，Cancer，5251，1983)。因此，虽然这些药物可用于抑制癌生长，但其严重的心脏毒性副作用使患者可能死于充血性心力衰竭。
除化合物自身的心脏毒性作用之外，已知的制备蒽环类抗生素化合物的方法产率较低，约为30％左右(参见Smith等，J.Med.Chem.，21280-283，1978)。
阿霉素在消除肿瘤上的成功及其在临床应用上的限制已是全世界研究人员开发更好的阿霉素的根据。基于这些原因，长期以来，人们需要一种阿霉素类似物，它不受蓄积性不可逆性心脏毒性的限制。虽然在过去的25年里，已合成了2000个以上的类似物，但阿霉素没有显著的改进(R.B.Weiss，我们究竟能否发现更好的阿霉素？(The anthracyclinesWill we ever find a betterdoxorubicin？)，Seminars in Oncology，19670-686，1992)。
在过去的25年里已进行了全面的研究以探明蒽环类抗生素心脏毒性的机理。曾提出的一种广为接受的理论是自由基理论。根据该理论，蒽环类抗生素的心脏毒性源于由蒽环类抗生素分子的苯醌部分产生的自由基(J.Dorowshow等，J.Clin.Invest.，681053，1981；D.V.Unverferth等，Cancer Treat.Rev.，9149，1982；J.Goodman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，77797，1977 ；J.L.Zweier，J.Biol.Chem.，2596056，1984)。
然而，该理论由于自由基清除剂和抗氧化剂未能预防蓄积性心脏毒性而令人失望(D.Propper和E.Maser，阿霉素在家兔肝和心脏中的羰基还原(Carbonylreduction of daunorubicin in rabbit liver and heart)，Pharmacology and Toxicology，80240-245，1997；J.F.Van Vleet等，Am.J.Pathol.，9913，1980；D.V.Unverferth等，Am.J.Cardiol.，56157，1985；C.Myers等，Seminars in Oncology，1053，1983；R.H.M.Julicher等，J.Pharm.Pharmacol.，38277，1986；和E.A.Porta等，Res.Comm.Chem.Pathol Pharmacol.，41125，1983)。
换言之，业已发现，抑制自由基的产生不能消除这些蒽环类抗生素的心脏毒性(P.S.Mushlin等，Fed.Proc.，45809，1986)。Richard D.Olson博士和PhillipS.Mushlin博士在过去的15年时间中研究了蒽环类抗生素诱发的心脏毒性机理并提出了“代谢物理论”，该理论目前被认为是会成为一种流行的理论(R.D.Olson和P.S.Mushlin，阿霉素心脏毒性流行假设的分析(DoxorubicincardiotoxicityAnalysis of prevailing hypotheses)，FASEB Journal，43076-3086，1990)。根据该理论，蒽环类抗生素心脏毒性是由母体化合物的13-OH代谢物介导的。
该研究显示，表现为心肌收缩性减小的阿霉素和柔红霉素心脏毒性与13-酮基部分被代谢性还原成13-二氢代谢物相关。在阿霉素没有明显代谢的试验体系，仅在非常高的浓度(200-400μg/mL)时才能观察到13-二氢化合物的心脏毒性作用(P.S.Mushlin等，Fed.Proc.，441274，1985；R.D.Olson等，Fed.Proc.，45809，1986)。
如果让阿霉素即使是短时间地留在试验体系中，也会出现某些代谢转换并有足够量的13-二氢代谢物形成，使得心脏毒性开始显现(L.Rossini等，Arch.Toxicol.Suppl.，9474，1986；M.Del Tocca等，Pharmacol.Res.Commun.，171073，1985)。因此，已积累了阿霉素和柔红霉素等药物的心脏毒性来源于它们的13-二氢代谢物产生的强心脏毒性作用的实质性证据(P.Mushlin等，RationalDrug Therapy，221，1988；S.Kuyper等，FASEP Journal，2A1133，1988；R.Boucek等，J.Biol.Chem.，26215851，1987；和R.Olson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，853585，1988) 。
与上述的不同，较低浓度(1-2μg/mL)的13-二氢代谢物(即，阿霉素醇和柔红霉素醇)在相同的这些试验系统中产生心脏毒性(R.D.Olson等，Proceed.Am.Assoc.Cancer Res.，26227，1985；R.D.Olson等，Proceed.Am.Assoc.Cancer Res.，28441，1987)。
考虑到上述情况，如下所示，由细胞内羧基还原酶将阿霉素还原成阿霉素醇，其中，13-酮基被还原成醇
该理论提供了对蒽环类抗生素心脏毒性时间延迟性的解释。最近，已有人对Olson和Mushlin的研究进行了复查并证实了许多论点(D.Propper和E.Maser，阿霉素在家兔肝和心脏中的羰基还原(Carbonyl reduction of daunorubicin inrabbit liver and heart)，Pharmacology and Toxicology，80240-245，1997)。
例如，研究证实了心脏内C13-醇代谢物的蓄积与心肌收缩和松弛能力下降之间的直接关系。此外，在长期使用阿霉素的过程中，其13-醇代谢物(即，阿霉素醇)在大鼠和家兔心脏组织中选择性地蓄积。而且，研究证实，柔红霉素醇的体外心脏毒性作用比其母药大得多。
此外，研究证实，阿霉素醇在抑制家兔乳头肌的心脏收缩方面30倍强于阿霉素。还有，研究证实，心脏功能失调的机理与ATP酶抑制有关，因为阿霉素醇(但不是阿霉素)是肌质网的Ca2+-Mg2+-ATP酶、线粒体的Mg2+-ATP酶和肌纤维膜的Na+-K+-ATP酶活性的抑制剂。此外，在动物研究中用柔红霉素处理后第2日在心脏组织中发现了柔红霉素醇(但不是柔红霉素)。
最近，蒽环类抗生素醇代谢物诱发的心脏毒性的基本机理已由Minotti等(阿霉素的二级醇代谢物使人心肌层的细胞溶质部分中的顺乌头酸酶/铁调节蛋白-1不可逆地钝化(The secondary alcohol metabolite of doxorubicin irreversiblyinactivates aconitase/iron regulatory protein-1 in cytosolic fractions from humanmyocardium)，FASEB Journal，12已付印，1998)阐明。Minotti等证实，阿霉素醇(但不是阿霉素)干扰铁代谢并将铁调节蛋白-I(IRP-I)不可逆地钝化。其结果是，铁无法被需铁酶利用。这些酶的钝化导致心脏毒性。
与这些发现一致的是以下事实螯合剂右雷佐生(dexrazoxane)可用于减少阿霉素心脏毒性(G.Weiss等，右雷佐生(ICRF-187)通过铁调节蛋白的活化而调节运铁蛋白受体的表达(Modulation of transferrin receptor expression bydexrazoxane(ICRF-187)via activation of iron regulatory protein)，BiochemicalPharmacology，531419-1424，1997)。右雷佐生似乎刺激可抵消阿霉素醇作用的IRP-I的活性。
Olson和Mushlin作了这样的构思无法形成醇代谢物的13-羰基蒽环类抗生素类似物将不会有心脏毒性。最有吸引力的可能性是，将13-羰基还原成亚甲基。没有已知的将该基团代谢成醇的酶。根据该构思而得到的结果是蒽环类抗生素阿柔比星。
与阿霉素相比，阿柔比星有许多改变，包括没有14-OH。与其缺乏14-OH基团一致的是，该药对肉瘤或癌无效。但它对急性白血病有效。阿柔比星也没有13-酮基，但有13-亚甲基。
该药在法国和日本有售。阿柔比星明显地没有不可逆的蓄积性心脏毒性。使用高达3,000mg/m2的患者没有心脏功能失调或心肌病变的迹象(D.C.Case等，对急性原始粒细胞性白血病的阿柔比星II期研究(Phase II study ofaclarubicin in acute myeloblastic leukemia)，American Journal of ClinicalOncology，10523-526，1987)。该领域的专家不了解阿柔比星没有心脏毒性，不正确地设想这是由于其分布和药物动力学所致。但Olson和Mushlin相信，它证实了没有13-酮基部分对心脏毒性的重要性。
图1是心脏毒性产生途径的示意图。
发明概要本发明的一个目的是提供13-脱氧蒽环类抗生素衍生物并不抑制心脏毒性的证据。
本发明的另一个目的是提供改进的制备这样的13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法。
本发明的再一个目的是提供某些13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的前体及制备这些前体的方法。
根据这些和其它一些目的和优点，本发明的一个方面是提供式1所示的13-脱氧蒽环类抗生素衍生物
式中，R1是H或OH；R2是H、OH或OMe；R3是H或OH；R4是H或OH；R5是碳水化合物或取代的碳水化合物。本发明还提供式1化合物的药用盐。药用盐包括得自药用无机和有机酸和碱的盐。合适的酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、三氟乙酸和苯磺酸。得自合适的碱的盐包括碱金属盐(如钠盐)和铵盐。
本发明的另一个方面是提供对需要抗癌治疗的哺乳类宿主进行治疗的方法。将抗癌有效量的至少一种下面所示的式1化合物给药于宿主。
式中，R1是H或OH；R2是H、OH或OMe；R3是H或OH；R4是H或OH；R5是碳水化合物或取代的碳水化合物。
本发明的再一个方面是提供制备13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法。该方法包括形成蒽环类抗生素13-甲苯磺酰腙与作为还原剂的氰基氢硼化物的酸性溶液。将该溶液温和地回流。使反应混合液冷却。往该溶液中加入饱和的碳酸氢钠水溶液，然后加入卤代烃类溶剂。过滤混合物。将滤液酸化。对滤液进行制备性色谱法分离，得到13-脱氧蒽环类抗生素衍生物。
此外，本发明的目的是解决已知的13-脱氧蒽环类抗生素衍生物制备方法中的上述缺陷。
因此，本发明的又一个目的是提供产率高于已知方法的改进的13-脱氧蒽环类抗生素衍生物制备方法。
因此，本发明的又一个方面是提供13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的制备方法。
蒽环类抗生素一般具有下面的式1所示结构
式中，R1、R2、R3、R4和R5的定义同上。
根据已知的方法，可容易地将蒽环类衍生物转化成13-甲苯磺酰腙。在酸性条件下用氰基氢硼化钠将蒽环类抗生素13-甲苯磺酰腙还原成13-脱氧蒽环类抗生素衍生物。用制备性色谱法将产物纯化而无需提取步骤。该方法的产率约为70-80％。
本发明的还有一个方面是提供制备13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法。该方法包括形成13-甲苯磺酰腙与氰基氢硼化物的酸性溶液。将该溶液温和地回流。使反应混合液冷却。往该溶液中加入饱和的碳酸氢钠水溶液，然后加入卤代烃类溶剂。过滤混合物。将滤液酸化。对滤液进行制备性色谱法分离，得到13-脱氧蒽环类抗生素衍生物。
本发明的再有一个方面是提供制备13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法。该方法包括将约1g的阿霉素13-甲苯磺酰腙盐酸盐和约2.4g的对甲苯磺酸溶解在约50mL的无水甲醇中形成溶液。往该溶液中加入约0.8g的氰基氢硼化钠。将该溶液加热至约68-72℃。在氮气氛下将该溶液温和地回流约1小时。将反应混合液浓缩至约20mL。将反应混合液在冰箱中冷却至约0-4℃。往反应混合液中加入约2mL的饱和的碳酸氢钠水溶液。再往反应混合液中加入约200mL的氯仿。然后加入无水硫酸钠。滤去盐。用含氯化氢的乙醚将滤液酸化。将溶液加样于硅胶柱中。用氯仿/甲醇洗脱至流出液为无色。含产物的流分用甲醇洗脱。将甲醇洗脱液蒸发。将蒸发所得残余物溶解在含30％乙腈的甲酸铵缓冲液中。用苯基柱对产物进行制备性HPLC分离。用乙腈/甲酸铵梯度将产物与其它杂质分离。然后将经HPLC纯化的流分冻干，得到约600mg的13-脱氧阿霉素盐酸盐。
附图的简单说明图1是心脏毒性产生途径的示意图；图2是在175μM的本发明一个实例的化合物中温育的右心房和心室标本中的阿霉素醇或阿霉素的浓度与时间的关系的曲线图；图3是存在本发明一个实例的化合物或阿霉素时[3H]-胸苷被HL-60细胞摄取的曲线图，该图显示了细胞生长的抑制；图4是存在本发明一个实例的化合物或阿霉素时[3H]-胸苷被P388细胞摄取的曲线图，该图显示了细胞生长的抑制；图5是存在本发明一个实例的化合物或阿霉素时[3H]-胸苷被MCF7细胞提取的曲线图，该图显示了细胞生长的抑制；图6是存在本发明一个实例的化合物或阿霉素时[3H]-胸苷被MDA-MB-231细胞摄取的曲线图，该图显示了细胞生长的抑制；图7是本发明的化合物B和阿霉素对收缩功能的作用的图示；图8a-c分别是由用本发明一个实例的化合物处理20-23周后或用阿霉素处理过的家兔得到的左心室组织或对照样本的组织病理的放大200倍的显微照片，该图显示了阿霉素样品中肌细胞液泡形成和肌原纤维丧失，而在本发明的化合物A或对照样本中则没有此现象。
本发明的最佳实施方式及各种实施方式本发明利用了13-脱氧型的阿霉素、柔红霉素或其它类似的蒽环类抗生素不会由于代谢作用而转化成有心脏毒性的13-二氢型这样一个事实，从而提供一种无心脏毒性的数量的本发明化合物的给药方法，该方法没有总累积剂量的限制。
本发明包括式A的改进型阿霉素
以下称该化合物为化合物A。
改进的化合物A通过将阿霉素的13-酮基还原成亚甲基而得到。体外实验显示，改进的化合物A在与阿霉素被转化成阿霉素醇相同的条件下不会被心脏组织代谢成该代谢物。
下述体外实验研究了本发明的改进型阿霉素的生物转化。研究的目的是确定本发明的化合物A是否会在离体的家兔心肌标本中被代谢成C-13羟基代谢物。在由新西兰白种家兔得到的游离的右心室和右心房壁条中用荧光HPLC技术对阿霉素、阿霉素醇和化合物A进行了分析。心房和心室条被温育于含充氧的克雷布斯-碳酸氢盐缓冲液的肌肉浴(30℃)中。将阿霉素(175μM)或化合物A(175μM)加入到浴中并每隔30分钟取出心房和心室条，此操作进行了210分钟。将各条带用生理盐水简单地冲洗后用吸水纸吸干，对半切割并称重。将组织于-70℃贮存在管瓶中，以便测定组织中的阿霉素、阿霉素醇和化合物A浓度。阿霉素、阿霉素醇和化合物A的组织浓度通过由3个独立的实验得到的标准曲线加以确定，用平均值±平均标准误表示。观察到化合物A和阿霉素的心房和心室浓度的具时间依赖性的增加。温育210分钟后，化合物A和阿霉素的心房组织浓度(ng/mg湿重)无显著差异(化合物A743±89；阿霉素617±35)。温育210分钟后，化合物A在心室中的浓度显著高于阿霉素的心室浓度(化合物A626±31；阿霉素407±30；P＜0.05)。然而，仅阿霉素被代谢成C-13羟基代谢物(即阿霉素醇)。未检测到化合物A的代谢。这些实验表明，化合物A在离体的心脏标本中不会形成C-13羟基代谢物。
该研究的目的是确定化合物A是否会在离体的家兔心肌标本中被代谢成C-13羟基代谢物。
用本发明的化合物A和阿霉素进行了试验。
用家兔全心室、右和左心房组织、右心室游离的壁、克雷布斯-碳酸氢盐缓冲液(pH7.4)、生理(0.9％)盐水、硫酸铵、异丙醇、氯仿、柔红霉素、阿霉素、阿霉素醇和甲醇进行了分析。
试验方案包括将新西兰白家兔游离的右心室壁和心房的薄条(各80-100mg)温育于含充氧的克雷布斯-碳酸氢盐缓冲液(pH7.4)的离体肌肉浴(30℃)中。如先前所报道的(P.S.Mushlin等，Br.J.Pharmacol.，110975-982，1993)，离体肌肉浴的组成如下127mM氯化钠、2.5mM氯化钙、2.3mM氯化钾、25mM碳酸氢钠、1.3mM磷酸二氢钾、0.6mM硫酸镁和5.6mM葡萄糖。
至于阿霉素醇的合成，用Takanashi和Bachur法(S.Takanashi和N.R.Bachur，Drug Metab.Disp.，417-87，1976)的略作改进了的方法(P.S.Mushlin等，Br.J.Pharmacol.，110975-982，1993)合成阿霉素醇。
根据对实验结果的统计学分析，在3个不同的实验中测定了阿霉素、阿霉素醇和化合物A的组织浓度(ng/mg湿重)并表示为平均值±平均标准误。通过双因子分析法(方差分析)用Prizm(GraphPad)程序分析经不同时间间隔的处理的效果。
观察和检查结果包括观察到化合物A和阿霉素在家兔心房(表1)和游离的右心室壁(表2)组织中的浓度均有时间依赖性的增加(图1)。化合物A在心房和心室中的浓度均等于或高于阿霉素在心房和心室中的浓度。然而，仅阿霉素被代谢成C-13羟基代谢物(即，阿霉素醇)，在家兔心房(表1)和心室(表2)组织中均观察到阿霉素醇的时间依赖性的蓄积(图2)。未检测到化合物A的代谢(图2)。
表1试验化合物和阿霉素醇在家兔心房组织中的浓度(ng/mg湿重)
ND表示未检测出化合物A的C-13羟基代谢物。由3个不同实验得到的组织浓度表示为平均值±平均标准误。ND和平均值由3个独立的实验得到。
表2试验化合物和阿霉素醇在家兔右心室游离壁组织中的浓度(ng/mg湿重)
1P＞0.05，化合物A与阿霉素比较。ND表示未检测出化合物A的C-13羟基代谢物。由3个独立的实验得到的组织浓度表示为平均值±平均标准误。ND和平均值由3个独立的实验得到。
对实验的讨论和由实验得到的结论包括实验结果表明，化合物A在离体的家兔心脏标本中不会形成C-13羟基代谢物。然而，相关结构的化合物阿霉素被代谢成阿霉素醇(即，C-13羟基代谢物)。此外，实验结果表明，阿霉素在心房组织中代谢成阿霉素醇的反应似乎大于其在心室组织中的反应。
图2图示在温育于175μM的本发明化合物A或阿霉素中的右心房(A)和心室(V)标本中的阿霉素醇随着时间变化的浓度。由图2可知，本发明化合物的浓度远低于已知的阿霉素。
其它体外研究显示，本发明化合物A在抑制人癌细胞生长方面与阿霉素同样有效。
显示本发明化合物在抑制癌细胞生长方面的效果的实验将本发明化合物A和阿霉素对体外细胞增殖的效果进行了比较。
根据显示本发明化合物效果的实验，将化合物A对得自人和鼠白血病(HL60和P388)和人乳房癌(MCF7和MDA-MB231)的培养细胞系的抗增殖效果与阿霉素进行了比较。通过测定[3H]胸苷的细胞参入来研究对癌细胞增殖的抑制。在同一培养条件下将化合物A的抗增殖效果与阿霉素进行了比较。由曲线拟合分析法得到产生最大抑制的50％(IC50)的浓度。平均IC50值(用nM表示)和95％置信度如下所示。由3或4个各重复3次的独立分析测得平均值。
在所研究的4个细胞系的每一个中，化合物A和阿霉素均完全消除了[3H]胸苷的细胞参入。这些研究证实，化合物A和阿霉素是强有力的体外癌细胞增殖抑制剂，虽然如IC50值的比(强度比)所示，阿霉素在所有4个细胞系中抑制[3H]胸苷参入的能力略强于化合物A(P＜0.05)。
此研究的目的包括用已建立的胸苷参入规程(E.Severison和E.L.Larsson，对多克隆B和T细胞活化剂的淋巴细胞反应(Lymphocyte responses to polyclonal Band T cell activators)，D.M.Weir编， Cellular Immunology，第2卷第4版，Blackwell Scientific Publications出版，第631页，1986年)确定化合物A抑制许多得自人和鼠白血病(HL60和P388)和人乳房癌(MCF7和MDA-MB231)的培养的恶性细胞系的细胞生长(增殖)的强度，以计算出试验化合物在4个细胞系中的每一个中产生最大反应的50％所需的有效浓度(IC50)和将该值与由阿霉素得到的数值进行比较。
在下述范围内用细胞特异性介质稀释试验化合物
在各孔中加入50μl稀释物，每个稀释物3份，让细胞在试验化合物的存在下生长24小时。
统计学分析包括非配对t测验，若合适的话。显著性程度选择为P＜0.05。
观察和检查结果如下。在所试验的4个癌细胞系中，化合物A和阿霉素产生[3H]胸苷摄取的浓度依赖性抑制。产生最大反应的50％的浓度(IC50)值由曲线拟合分析法得到。IC50值(单位为nM)如下所示，表示3-4个每个重复3次的试验的平均值(括号内是95％的置信限)。<
>结果表明，化合物A在所有4个体外细胞系中抑制细胞增殖的效能小于阿霉素。但两个化合物同等有效。
对体外试验结果的讨论和结论表明，在所研究的4个细胞系中的每一个中，化合物A和阿霉素均完全消除了[3H]胸苷的细胞参入。如IC50值之比(强度比)所示，阿霉素抑制[3H]胸苷参入所有4个细胞系的能力强于化合物A(P＜0.05)。见图3-6。这些研究证实，化合物A和阿霉素均是强有力的癌细胞体外增殖抑制剂。图8a-c是图示与已知的阿霉素化合物和对照样本相比，本发明化合物对心脏组织的影响的显微照片。
体内研究显示，化合物A在小鼠白血病模型中可有效地延长生存期而全身毒性小于阿霉素(具体结果如下所示)。
下面叙述化合物A对小鼠P388白血病的效果。
在第0日在CDF1雄性小鼠腹膜内接种106个P388鼠白血病细胞。在第1至第9日，往腹膜内注射阿霉素或化合物A。每日测量体重并记录生存情况。在一个这样的研究中，给小鼠注射阿霉素或化合物A的剂量为0.8mg/kg/日。在第22日，在赋形剂组中，小鼠的生存率为0/8，阿霉素组为7/8，化合物A组为5/8。阿霉素和化合物A相对于赋形剂有显著性差异，而它们彼此之间则没有。
在另一个同样的鼠白血病模型研究中，阿霉素的注射剂量为0.8mg/kg/日，而化合物A的注射剂量为1.6、2.4或3.2mg/kg/日。
表 3
上面的数值为平均值±标准误；*相对于赋形剂，P＞0.05；#相对于阿霉素，P＜0.05。
在第19日，化合物A的剂量为1.6mg/kg/日，其抑制由白血病发展及伴随的腹水导致的体重增加的疗效几乎与阿霉素相同。当化合物A的剂量为2.4和3.2mg/kg/日时，其抑制体重增加的疗效大于阿霉素。在第25日，所有剂量的化合物A在维持生存方面与阿霉素同样有效。到第32日为止，与赋形剂和阿霉素比较，仅化合物A(3.2mg/kg/日)有效地延长了生存期。在该研究中所用的阿霉素剂量是该模型的最大有效剂量。阿霉素剂量增大实际上会降低生存率。因此，虽然化合物A的强度小于阿霉素，但在较大剂量水平上，它比阿霉素更能有效地延长生存期。
业已用Mushlin等在Br.J.Pharmacol.，110975-982，1993中描述的家兔心脏模型显示，化合物B(柔红霉素的13-脱氧类似物)也没有柔红霉素在体外心脏收缩功能方面的心脏毒性。结果示于图7。
如下所示，也用体内大鼠模型显示，化合物B没有阿霉素的心脏毒性。下面的讨论证实，在下面的大鼠静脉内注射中所用的本发明化合物B没有心脏毒性作用。
在雄性Sprague Dawley大鼠的静脉中每隔一天注射柔红霉素盐酸盐或化合物B盐酸盐水溶液(5mg/kg/日)，注射3次(总剂量15mg/kg/日)。另用赋形剂作对照。第一次注射后第7日，在各大鼠的腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)使其麻醉。把导管插入大鼠的气管内使其呼吸100％氧气。用加热灯和温度控制器使其体温维持在37℃。在右颈动脉中插入导管并伸入主动脉中，用Statham压力传感器和Gould记录仪记录平均动脉压(MAP)和心率(HR)。然后将导管伸入左心室中记录左室收缩压(LVSP)、最大左室dP/dt(dP/dt)和左室舒张末期压(LVEDP)。
在用柔红霉素处理过的大鼠中，与赋形剂对照组相比，MAP、LVSP和dP/dt明显地大大下降了(表4)。在用柔红霉素处理过的大鼠中，体重也显著下降了。而在赋形剂对照组与用化合物B处理过的大鼠之间，它们的MAP、LVSP和dP/dt和体重大同小异(表5)。这些数据显示，在柔红霉素会使心脏收缩力和心脏功能产生实质性下降的剂量水平上，化合物B没有心脏毒性。结果表明，化合物B可以治疗剂量给药而不会产生心脏毒性，而相同治疗剂量的柔红霉素则会削弱心脏功能。
表4反复给药后柔红霉素和赋形剂对大鼠左心室功能的影响
表4中的数值为平均值±标准误；每隔一日在大鼠静脉内注射化合物(5mg/kg/日)，共3次；在第一次注射后第7日进行测定。体重1＝第0日的体重，体重2＝第7日的体重。*表示相对于赋形剂，p＜0.05。
表5反复给药后化合物B和赋形剂对大鼠左心室功能的影响
每隔一日在大鼠静脉内注射化合物(5mg/kg/日)，共3次；在第一次注射后第7日进行测定。体重1＝第0日的体重，体重2＝第7日的体重。
也用家兔慢性阿霉素心脏毒性模型对化合物A进行了评价。在该模型中，阿霉素削弱了心脏功能，其组织病理学变化与长期用阿霉素治疗的人的类似。在用阿霉素处理过的6只家兔中，有5只出现心脏组织病理学变化和/或功能损伤。在同样条件下，化合物A未出现与临床相关的心脏毒性。
本发明化合物无心脏毒性得到下述研究结果的支持，在该研究中，用慢性家兔模型评估了阿霉素和化合物A的心脏毒性。
根据该研究，将24只雄性新西兰白兔随机分成4组。往6只家兔耳缘静脉内注射阿霉素(1mg/kg)，每周2次，共8周。往另外6只家兔耳缘静脉内注射化合物A(1mg/kg)，每周2次，共8周。每日监测阿霉素注射组和化合物A注射组的家兔的食物消费并给性别和年龄相当的作为对照的家兔喂食相同量的食物，同时在对照组家兔耳缘静脉内注射赋形剂(0.9％氯化钠)，每周2次，共8周。在研究过程中每周用多普勒超声技术监测主动脉根的加速。从研究的第10周开始，每隔一周用M型超声心动图测定缩短分数(fractionalshortening)并持续至研究结束。在研究开始后第20周开始或者当缩短分数小于25％或至少3周维持在25-29 ％时，让家兔安乐死。由各被处死的家兔制备左心室乳头肌、左心室游离壁和心尖样本以便进行组织病理学分析，并由对处理过程不了解的组织病理学家进行评分。根据液泡形成、肌原纤维退化、单核性炎症和坏死的程度，将损害分成轻微、中等或严重。在阿霉素处理组、化合物A处理组、阿霉素对照组和化合物A对照组(每组6只家兔)中，分别有4只、0只、1只和0只家兔出现缩短分数异常。在阿霉素处理组、化合物A处理组、阿霉素对照组和化合物A对照组(每组6只家兔)中，分别有3只、0只、0只和0只家兔出现异常的主动脉根加速(其数值在9m/s/s以下)。在阿霉素处理组中，6只家兔均出现轻微至严重的组织病理学异常；而用化合物A处理的6只家兔中有2只出现轻微的组织病理学异常。在二个对照组的家兔心脏组织中，均未发现组织病理学损害。当3个心脏毒性试验中的至少2个为异常时，确定心脏总体状态为异常。使用这些标准，阿霉素处理组的6只家兔中，5只家兔的心脏总体状态为异常；在其它3个组中，没有1只家兔异常(P＜0.05，Fisher氏Exact检验)。与阿霉素相比，化合物A在所试验的剂量水平上基本上没有心脏毒性。此外，化合物A对血液变化和体重增加没有明显的影响，而阿霉素明显地使血液学产生了变化并抑制了体重增加。在该给药方案中，化合物A对家兔的心脏毒性和全身性毒性小于阿霉素。
评估心脏毒性实验的目的包括用慢性家兔模型比较化合物A与阿霉素的心脏毒性。
67％(4/6)的用阿霉素处理过的家兔出现左心室缩短分数异常。在6只用阿霉素处理过的家兔中有3只(50％)出现异常的主动脉根加速。而用化合物A处理过的家兔无一有任何心脏毒性的功能性迹象。最敏感的心脏毒性指标是组织病理学变化。所有用阿霉素处理过的家兔均出现以肌细胞液泡形成和肌原纤维丧失为主要特征的组织病理学损害。6只家兔中有4只出现轻微心脏毒性，1只有中等损害，1只有严重损害。用化合物A处理过的6只家兔中有2只有轻微组织病理学损害(见图8)。将所有3个心脏毒性试验的结果汇总，在阿霉素处理组的6只家兔中有5只出现心脏状态异常，而化合物A处理组则1只也没有(P＜0.02，Fisher氏Exact检验)。当3个心脏毒性试验中的至少2个为异常时，确定心脏总体状态为异常。在研究过程的第8周，从耳缘动脉采取血样以得到血细胞读数。与用赋形剂或化合物A处理的动物相比，用阿霉素处理使白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白、平均微粒血红蛋白浓度和红细胞分布宽度出现显著性下降(P＞0.05)。与赋形剂相比，化合物A不改变这些变数，只是红细胞分布宽度略有增加。此外，与化合物A处理相比，阿霉素处理抑制了体重增加。用化合物A处理的家兔在研究开始时和结束时的体重分别为3.17±0.06kg和4.10±0.10kg，而用阿霉素处理的家兔在研究开始时和结束时的体重分别为3.19±0.10kg和3.54±0.06kg(P＞0.05，单向方差分析，Duncan氏新的多重范围检验)。
异常主动脉根加速被定义为数值在9.0以下。加速度单位为m/s/s。N＝正常心脏功能；A＝异常心脏功能。
往大鼠的静脉内注射1mg/kg的阿霉素(DOX)或化合物A(DOXA)，每周2次，共8周(总累积剂量为16mg/kg)。对年龄相当、喂食同样饲料的阿霉素对照组(C)或化合物A对照组(CX)的大鼠仅注射赋形剂。
阿霉素组与化合物A、CX或C组存在显著性差异(P＜0.05；2X2列联Chi方分析(2X2 continguency Chi square analysis)，双尾)。
往大鼠的静脉内注射1mg/kg的阿霉素(DOX)或化合物A(DOXA)，每周2次，共8周(总累积剂量为16mg/kg)。对年龄相当、喂食同样饲料的阿霉素对照组(C)或化合物A对照组(CX)的大鼠仅注射赋形剂。
N＝心脏功能或组织病理学正常；A＝心脏功能或组织病理学异常。当3个心脏毒性试验中的至少2个为异常时，定义心脏总体状态为异常。异常的缩短分数的定义是，趋势或维持值在25％左右或更低。异常主动脉加速的定义为其数值在9.0mists以下。组织病理学异常的定义是，出现液泡、肌原纤维损害和单核性炎症(参见上面关于方法的讨论)。组织病理学变化如前所述评价为正常、轻微、中等或严重。与化合物A、C和CX组相比，阿霉素处理组中总体心脏状态异常的大鼠明显地更多(P＜0.02，Fisher氏Exact检验，双尾)。
表6化合物A对兔心脏毒性的评价
1剂量1mg/kg，每周2次，共8周2异常组织病理学液泡、肌原纤维损害3相对于阿霉素，p＜0.02由心脏毒性研究得出的结论是，在本发明中，化合物A不改变心脏功能，在6只家兔中，仅2只有轻微的组织病理学影响。另一方面，在阿霉素处理组的6只家兔中，有5只的心脏功能发生了变化，在该心脏毒性的慢性家兔模型中，所有的家兔均出现了组织病理学异常。与阿霉素相比，化合物A在所试验的剂量水平上基本上没有心脏毒性。此外，化合物A对血液学和体重增加没有明显的影响，在本发明的给药方案中，化合物A对家兔的心脏毒性和全身性毒性小于阿霉素。
用小鼠进行的亚急性毒性试验也显示，化合物A的骨髓毒性小于阿霉素。具体结果如下。
表7化合物A对小鼠红血细胞和骨髓淋巴细胞的影响(n＝4-5)
在第1、5和9日静脉注射药物。在第15日进行测定。数值为平均值±标准误。+表示不同于赋形剂，p＜0.05；#表示不同于化合物A，p＜0.05。二个剂量均是最大亚致死剂量。
上述研究的结果清楚地表明，化合物A是阿霉素的无心脏毒性形式。由于化合物A保留了14-OH部分，因此，化合物A很可能除白血病之外对治疗肉瘤和癌有用。由于化合物A不形成有毒的13-醇型代谢物，因此，预期其没有剂量限制性心脏毒性。由此，与阿霉素不同，只要需要，可用化合物A给药以缓解病情和/或防止疾病复发和病灶转移。在这点上，化合物A和其它13-脱氧蒽环类抗生素在癌的蒽环类抗生素化学治疗上是一个重要的突破。
结果表明，与化合物A类似的蒽环类抗生素衍生物应比其非13-脱氧蒽环类抗生素衍生物对应物在临床上更有效，因为前者由于其全身毒性较小且没有剂量限制性的蓄积性心脏毒性而可以以较高的有效剂量和较长的时间给药。本发明的用于治疗患可用阿霉素和柔红霉素治疗的癌的患者的13-脱氧蒽环类抗生素衍生物可以13-酮基型对应化合物的有效或等效累积剂量的至少1.5倍给药。
本发明还提供形成13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的改进方法。表8提供可根据本发明合成的13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的例子。如前面所讨论的，已知表8所示的这些化合物具有抗肿瘤性能。
与已知的方法不同，本发明的方法对温度不那么敏感。例如，本发明的操作可在约0-75℃进行。较好的是，本发明的操作在约65-75℃进行。更好的是，本发明的操作在约68-72℃进行。温度超过约72℃通常会使反应物和产物分解。
本发明的方法包括许多一般条件。例如，本发明的操作最好在酸性条件下进行。换言之，pH应约为6.5或更低。已知的制备上述化合物的方法在反应混合物内使用碱性条件，业已发现，这会使反应物和产物分解。反应或其任何部分(如仅回流)可在没有氧、水和/或氮气氛下于高达约75℃进行。
此外，反应不应含氧和水。反应最好在氮气氛或惰性气体气氛下用无水溶剂进行。
本发明方法的产率远高于已知的化合物制备方法。例如，发现已知方法的产率约为30％。另一方面，发现本发明方法的产率约为70-80％。
根据上面所述，本发明提供制备上述式I化合物的方法。
下面提供反应过程中分子转化的例子。
式中，R1、R2、R3、R4和R5的定义同上。
下面的流程图举例说明了本发明的13-脱氧阿霉素(它是13-脱氧蒽环类抗生素衍生物)制备方法的一个实施方式的例子。
下面是蒽环类抗生素衍生物的例子及它们的合成。
表 8
在上面的化合物中，R5可以是不同蒽环类抗生素类似物的变型。此外，可将D环氟化。
本发明的方法一般包括用还原剂形成13-脱氧蒽环类抗生素的溶液。将该溶液温和地回流。然后，可将反应混合物冷却。根据一个实施例，将反应混合物冷却至约0-4℃。然后往反应混合物中加入碱。该碱可以是冷的。例如，碱可约为0-4℃。碱的一个例子是饱和的碳酸氢钠水溶液。可往反应混合物中加入卤代烃溶剂。可将卤代烃溶剂与碱一起同时加入到反应混合物中。卤代烃溶剂可以是冷的。例如，卤代烃溶剂可约为0-4℃。可用的卤代烃溶剂的例子是氯仿。然后将反应混合物过滤。过滤也可在较低的温度下进行。例如，过滤可在约4-15℃进行。
上述碱和卤代烃溶剂的加入最好能促使水解沉淀。可将无机盐沉淀物从反应混合物中滤去。过滤后，可将滤液酸化。将滤液用硅胶柱进行色谱法分离。可用极性较小的溶剂将疏水性杂质洗脱除去。然后可将13-脱氧蒽环类抗生素产物洗脱下来并将洗脱物进一步纯化。
本发明的方法最好包括在无水甲醇中用对甲苯磺酸和氰基氢硼化钠形成蒽环类抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液。在氮气氛下将溶液温和地回流，然后冷却。加入饱和的碳酸氢钠水溶液和氯仿。滤去盐沉淀物，用含氯化氢的乙醚将滤液酸化，然后用硅胶柱分离。用氯仿与甲醇的混合液将分解产生的疏水性杂质洗脱出来。用甲醇将产物即13-脱氧蒽环类抗生素洗脱出来。通过制备性HPLC将甲醇洗脱物进一步纯化。
根据上述方法的任一个，在分离13-脱氧蒽环类抗生素之前或之后，可用一种或多种还原剂和/或可将13-酮基部分还原成亚乙基部分的其他试剂处理13-脱氧蒽环类抗生素。
下面提供本发明方法的例子。
实施例制备13-脱氧阿霉素盐酸盐将1g阿霉素13-甲苯磺酰腙盐酸盐和2.4g对甲苯磺酸溶解在50mL无水甲醇中。往该溶液中加入0.8g氰基氢硼化钠。将所得溶液加热至68-72℃并在氮气氛下温和回流并保持1小时。
然后将反应混合物浓缩至约20mL，在冰箱中冷却至0-4℃。加入2mL饱和的碳酸氢钠水溶液，然后加入200mL氯仿。加入无水硫酸钠，振荡后滤去盐。将滤液用含氯化氢的乙醚酸化。
接着将溶液加样于硅胶柱(2.5×5cm)上。用氯仿/甲醇(10/1)洗脱，直至流出液成无色。将含产物的结合流分(bound fraction)用甲醇洗脱。将甲醇洗脱物蒸发，并将残余物溶解在30％乙腈/甲酸铵缓冲液(pH＝4.0，0.5％)中，用制备性HPLC分离。用苯基柱和乙腈/甲酸铵梯度(用30分钟将乙腈从27％增加至30％)将产物与其它杂质分离。将HPLC纯化的流分冻干，得到13-脱氧阿霉素甲酸盐固体，然后将其溶解在含氯化氢的甲醇中。蒸去溶剂，将产物沉淀于甲醇/乙醚中，得到600mg13-脱氧阿霉素盐酸盐。产率为80％。TLC∶Rf＝0.38 氯仿∶甲醇∶水30101U.V.λmax＝233、252、293、485nmMS530(M+H)
1HNMR(甲醇-d4)(见下面)δ 1.30(d，3H，6′-H3)1.85(m，2H，13-H2)2.05(m，2H，10-H2)2.06(d，1H，12-H)3.05(d，1H，12-H)3.55(m，1H，5′-H)3.90(m，2H，14-H2)4.05(m，3H，O-CH3)4.25(m，1H，4′-H)4.95(m，1H，3′-H)5.40(m，1H，1′-H)7.50(dd，1H，3-H)7.80(m，2H，1-和2-H)。
本发明还包括对需要抗癌治疗的哺乳动物宿主进行治疗的方法。这些方法包括将抗癌有效量的至少一种式1化合物给药于宿主。
本发明化合物的抗癌有效量可根据哺乳动物的种类、体重、年龄、个体状况和给药方式而定。本发明化合物可通过常用的方法给药，既可作为治疗剂单独给药，也可与治疗剂组合给药。它们可单独地但一般与根据所选给药途径和标准药学实践而选择的药用载体一起给药。
给药剂量当然将根据已知因素(如具体药剂的药效特征及其模式和给药途径)，接受者的年龄、健康状况和体重，症状的性质和程度、同时进行的治疗的种类，治疗频率和所希望的效果而变化。活性成分的日剂量可约为0.001-1000mg/kg体重，最好为0.1至约30mg/kg。
剂型(适合给药的组合物)含约1-100mg活性成分/单元。在这些药用组合物中，活性成分通常占组合物总重量的约0.5-95％。
活性成分可以固体剂型(如胶囊、片剂和粉剂)或以液体剂型(如酏剂、糖浆和混悬液)口服给药。也可以灭菌液体剂型通过肠胃外给药。活性成分还可通过鼻内(滴鼻剂)或通过吸入给药。也可采用其它剂型，如用药膏或软膏透皮给药。
明胶胶囊含活性成分和粉末载体(如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等)。可用类似的稀释剂制造压制片。片剂和胶囊均可制成缓释产品以使药剂在数小时内连续释放。可在压制片上以糖或膜包衣，掩饰不快的味道和防止片剂被空气破坏，或者可制成肠溶片以在肠胃道中选择性崩解。
口服液体剂型可含着色剂和调味剂以使患者更易接受。
一般而言，水、合适的油、盐水、葡萄糖水溶液及相关的糖溶液和二醇(如丙二醇或聚乙二醇)适合用作肠胃外给药用溶液的载体。肠胃外给药用溶液最好含活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂，如果需要，最好还含缓冲物质。抗氧化剂(如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸)是合适的稳定剂，它们可单独使用，也可组合使用。也可使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠。
此外，静脉内注射或腹膜内注射用剂型可含冻干粉末，在注射时可将该粉末用注射用灭菌的水或灭菌的盐水重新配制。这些溶液可含防腐剂，如苯扎氯铵、羟苯甲酯或羟苯丙酯、三氯叔丁醇。
合适的药用载体在本领域的标准参考书Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company出版)中有叙述。
权利要求
1.对需要抗癌治疗的哺乳动物宿主进行治疗的方法，该方法包括以下步骤将抗癌有效量的至少一种式1表示的化合物给药于宿主而没有总累积剂量的限制
式中，R1是H或OH；R2是H、OH或OMe；R3是H或OH；R4是H或OH；R5是碳水化合物或取代的碳水化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述总累积剂量是相应的13-酮基型化合物的等效累积剂量的至少1.5倍。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述化合物是13-脱氧阿霉素。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述化合物具有以下结构式
5.制备13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法，该方法包括以下步骤形成蒽环类抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液；加入还原剂，将13-酮基部分还原成亚甲基部分；将上述溶液回流；使反应混合物冷却；加入饱和的碳酸氢钠水溶液；往反应混合物中加入卤代烃类溶剂；将反应混合物过滤；将滤液酸化；对滤液进行色谱法分离，分离出13-脱氧蒽环类抗生素衍生物。
6.制备13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法，该方法包括以下步骤在无水甲醇中用对甲苯磺酸和氰基氢硼化钠形成蒽环类抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液；在氮气氛下将溶液温和地回流；将溶液冷却；往溶液中加入饱和的碳酸氢钠水溶液和氯仿，形成沉淀物；滤去沉淀物；用含氯化氢的乙醚将滤液酸化；用硅胶柱分离出含于滤液中的盐；用氯仿与甲醇的混合液将盐分解产生的疏水性杂质洗脱出来；用甲醇将13-脱氧蒽环类抗生素产物洗脱出来；用制备性HPLC将甲醇洗脱物进一步纯化。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述溶液的pH为6.5或以下。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述回流在约68-72℃进行。
9.如权利要求6所述的方法，其中，所述回流在约65-75℃进行。
10.如权利要求6所述的方法，其中，所述回流在高达约75℃的温度下进行。
11.如权利要求6所述的方法，其中，所述回流在没有氧的条件下进行。
12.如权利要求6所述的方法，其中，所述回流在没有水的条件下进行。
13.如权利要求6所述的方法，其中，所述回流在氮气氛下进行。
14.如权利要求6所述的方法，其中，所述回流在惰性气体气氛下进行。
15.如权利要求6所述的方法，该方法的产率约为70-80％。
16.制备13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法，该方法包括以下步骤形成蒽环类抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液；加入还原剂；将上述溶液回流；使反应混合物冷却；加入饱和的碳酸氢钠水溶液；往反应混合物中加入卤代烃类溶剂；将反应混合物过滤；将滤液酸化；对滤液进行色谱法分离，分离出13-脱氧蒽环类抗生素衍生物。
17.制备13-脱氧蒽环类抗生素衍生物的方法，该方法包括以下步骤将约1g的阿霉素13-甲苯磺酰腙盐酸盐和约2.4g的对甲苯磺酸溶解在约50mL的无水甲醇中形成溶液；往该溶液中加入约0.8g的氰基氢硼化钠；将该溶液加热至约68-72℃；在氮气氛下将该溶液温和地回流约1小时；将反应混合液浓缩至约20mL；将反应混合液在冰箱中冷却至约0-4℃；往反应混合液中加入约2mL的饱和的碳酸氢钠水溶液；往反应混合液中加入约200mL的氯仿；加入无水硫酸钠；振荡后将由加入无水硫酸钠而产生的盐滤去；用含氯化氢的乙醚将滤液酸化；将溶液加样于硅胶柱中；再用氯仿/甲醇洗脱至洗脱液为无色；用甲醇洗脱出含产物的流分；将甲醇洗脱液蒸发；将由蒸发而得到的残余物溶解在含30％乙腈的甲酸铵缓冲液中；用苯基柱对产物进行制备性HPLC分离；用乙腈/甲酸铵梯度将产物与其它杂质分离；将经HPLC纯化的流分冻干，得到约600mg的13-脱氧阿霉素盐酸盐。
全文摘要
作为无心脏毒性的蒽环类抗生素衍生物的13－脱氧蒽环类抗生素衍生物及其制备方法。
文档编号C07H15/252GK1270522SQ98809247
公开日2000年10月18日 申请日期1998年8月13日 优先权日1997年8月13日
发明者张席妮, R·D·奥尔森, G·M·沃尔什 申请人:杰姆药物股份有限公司