专利名称：寡糖衍生物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及寡糖衍生物及其制造方法，尤其涉及能有效预防和治疗胃及十二指肠等消化器官粘膜的炎症或溃疡发生的寡岩藻糖或寡鼠李糖衍生物。
背景技术：
作为先有技术上使用的抗溃疡剂，已知有以抑制胃酸分泌为目的的H2-阻滞剂或质子泵抑制剂。此外，以积极治疗胃炎或胃粘膜细胞为目的，近年来对前列腺素或碱性纤维芽细胞增殖因子等的利用也进行了探讨。这些药剂一方面显示出有效的治疗效果，另一方面也有引起溃疡发病、特别是其涉及幽门螺杆菌(H.pylori)的复发之虞，因而指出，为了消化性溃疡的根本治疗，包括根除该菌在内的治疗是必要的(浅香正博，“Helicobacter pylori と胃粘膜病变”，先端医学社，1995年7月1日)。
也已知，某种双岐杆菌或乳酸菌以及从海蕴或青海苔等制备的多糖类或寡糖类，不仅能预防溃疡而且也能有效促进其治愈，可以作为抗溃疡剂使用(特开平6-247861号公报，特开平7-138166号公报)。这些多糖或寡糖以岩藻糖或鼠李糖为主成分。其中，作为岩藻糖聚合物的岩藻依聚糖，不仅对溃疡形成有预防效果或治愈促进效果，而且对幽门螺杆菌(H.pylori)也有粘连抑制作用。然而，这些多糖或寡糖本身就抗溃疡活性而言还不十分令人满意，而且也难以得到分子量等的均一性。
本发明的主要目的是提供均一性比上述多糖类高、而且有更优异抗溃疡效果的寡糖衍生物及其制造方法。
发明公开本发明涉及的寡糖衍生物可用以下通式表示Y1-OCH(CH2NHR)2式中，Y1是聚合数2～20的寡岩藻糖，其一部分羟基也可以是硫酸酯化的。此外，R是苯基、高级烷基苯基、高级烷基、或-(CH2)n-NHXn是1～10的整数，X是高级链烷酰基、或烷胺基。在这种情况下，烷胺基也可以有取代基。
本发明涉及的另一种寡糖衍生物可用以下通式表示Y2-OCH(CH2NHR)2式中，Y2是聚合数2～20的寡鼠李糖，其一部分羟基也可以是硫酸酯化的。此外，R是苯基、高级烷基苯基、高级烷基、或-(CH2)n-NHX，n是1～10的整数，X是高级链烷酰基、或烷胺基。在这种情况下，烷胺基也可以有取代基。
这些寡糖衍生物有优异的抗溃疡效果等诸性质。
此外，本发明涉及的寡糖衍生物的制造方法包含使寡岩藻糖或寡鼠李糖的还原性末端糖残基氧化分解而转化成醛基的步骤，让对应的烷胺、芳胺类中至少一种作用于该醛基而生成席夫碱的步骤，和使该席夫碱还原的步骤。
即，岩藻依聚糖(岩藻糖多糖)或鼠李聚糖(鼠李糖多糖)通过酸处理等制成寡糖(大约3～20个岩藻糖或鼠李糖的低聚物)，进而通过过碘酸氧化、与对应胺类反应、及还原处理，来制造寡糖衍生物的方法。
按照本发明，提供一种幽门螺杆菌用抑制剂，这种药剂含有本发明的寡糖衍生物1种或2种以上，即寡岩藻糖衍生物和/或寡鼠李糖衍生物。
此外，按照本发明，也提供消化器官预防/治疗剂，这种药剂含有本发明的寡糖衍生物1种或2种以上，即寡岩藻糖衍生物和/或寡鼠李糖衍生物。
本发明的寡糖衍生物的制造方法之一的实施形态包含以下步骤1～8步骤1从含有岩藻依聚糖或鼠李聚糖或鼠李聚糖硫酸酯的海藻类(海蕴、黑海布、墨角藻、青海苔等)，用众所周知的萃取方法萃取多糖。
步骤2所得到的多糖类溶解在0.075N～0.1N左右的盐酸或三氟乙酸溶液中，在100℃进行10～20分钟加热处理，使多糖转化成寡糖。处理后有氢氧化钠中和，向该溶液中加NaBH4，在室温或4℃进行16小时还原处理。
步骤3从步骤2的操作得到的寡糖的糖醇体溶液，用透析(分级分子量500)或电渗析或离子交换树脂脱盐。
步骤4向步骤3得到的溶液中加偏高碘酸钠，在冰冷却温度下反应1小时左右。在结构上还原末端和非还原末端以外的糖链不会氧化的寡糖例如1→3结合的寡糖等的情况下，也可以反应更长时间。相对于反应液中的过碘酸而言，添加过量乙二醇，再反应1小时左右。用与步骤3同样的方法使本溶液脱盐。从这个操作，可以得到末端有醛基的寡糖衍生物(液体)。
步骤5向步骤4得到的液体中添加乙酸使之能达到0.5M浓度，在室温下反应20小时。反应液用分级分子量500的透析膜透析，使内液冷冻干燥，得到作为目的的寡糖。此外，寡糖级分除用透析法脱盐外，还可以用活性炭柱色谱法或凝胶过滤等，脱盐兼配制任意分子量尺度的级分。
步骤6步骤5得到的寡糖级分溶解在含40～50％丙醇的水溶液中，添加芳胺、烷胺类，在45℃反应2小时，生成席夫碱。在这种情况下，所用溶剂只要是能溶解寡糖和烷胺的物质(二甲基亚砜、二甲基磺酰胺等)即可。在这种情况下，作为可以反应的烷胺类、芳胺类，其选择没有特别限制，但较好的是有取代和无取代的苯胺类、有取代和无取代的高级烷胺类，在这种情况下，作为取代基，可以列举烷基、链烷酰胺基、烷胺基等。
步骤7向步骤6得到的液体中加硼烷三甲胺，在45℃使席夫碱还原20小时。作为还原剂，除硼烷三甲胺外，也可以适当利用与本目的一致的还原剂(例如硼烷二甲胺、NaCNBH3、NaBH4等)。
步骤8步骤7的还原反应结束后，用蒸发器等蒸出溶剂，然后用氯仿∶甲醇∶水＝2∶1∶1的混合液分配，收集水层。水层用氯仿洗涤后冷冻干燥，得到寡糖烷胺复合物组成的寡糖衍生物。分配萃取中使用的溶剂可根据烷胺的性质适当改变。
按照本发明的寡糖衍生物可以确认具有对消化器官溃疡病原菌幽门螺杆菌(H.pylori)的粘连抑制效果，以及乙酸诱发溃疡的治疗效果。
按照本发明得到的消化器官溃疡预防·治疗剂的剂型或给药量可以任意选定。然而，一般来说，较好将本药剂与医药上可接受的液态或固态载体配合，必要时添加溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等剂型再使用。此外，本药剂的成人每日较好给药量是约0.1mg/kg～10mg/kg，更好的是0.3mg/kg～3mg/kg。
附图简单说明
图1是寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物(OFDAD)的NMR(13C-NMR)谱图。
图2是寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物(OFDAD)的IR谱图。
图3显示乙酸诱发溃疡的操作流程图。
发明实施最佳形态实施例1 寡岩藻糖衍生物的制备(1-1)岩藻依聚糖的萃取和岩藻糖寡糖的制备冲绳海蕴(Cladosiphon okamuranus Tokida)用去离子水进行脱盐后，以每1kg藻体1升去离子水的比例悬浮在去离子水中，本悬浮液用盐水调至pH2。此液在100℃加热萃取10分钟后，用纱布滤出藻体，滤液进一步离心分离(9000rpm，60分钟)以除去不溶物。
得到的上清液用NaOH中和后，加偏高碘酸钠使之达到0.2M浓度以使混入的藻酸分解，在避光下反应20小时后，用乙二醇使反应停止。向本溶液中添加硼氢化钠使之达到0.2M浓度，在室温反应16小时。此溶液用超过滤(分级分子量5,000)法浓缩后、透析。透析内液用盐酸调至pH2，在100℃加热处理10分钟。处理液透析后冷冻干燥，得到岩藻依聚糖(4g/lkg湿藻体)。
这种岩藻依聚糖以200mg/ml的浓度溶解，加盐酸(或三氟乙酸)使之达到0.075M～0.1M浓度。在100℃加热10分钟后，冷却至室温。此液用NaOH中和后，以200mg/lg岩藻依聚糖的比例添加NaBH4，在4℃反应20小时。反应液用乙酸调至pH6，用电渗析装置(旭化成，MicroaeilyzerTM，使用AC 220膜)脱盐、脱盐后，向试样溶液中添加NaIO4使之达到0.2M浓度，在冰冷却温度下反应1小时。向反应液中添加相对于过碘酸而言2当量乙二醇，在冰冷却温度下再反应1小时。反应液用分级分子量500的透析膜(Spectrum公司制)透析，透析内液冷冻干燥，得到寡糖标品(平均分子量约1000～3000，或平均聚合度8～14)。
(1-2)岩藻糖寡糖的过碘酸氧化向岩藻糖寡糖的溶液(2％，100ml)中添加NaIO4使之达到0.2M浓度，在冰冷却温度下反应1小时。向此反应液中加当量乙二醇，在冰冷却温度下进一步反应1小时。得到的反应液添加到500ml容量的活性炭柱(和光纯药公司制，色谱法用活性炭)中，用3升水使非吸附物洗脱。向本柱中加3升35％乙醇水溶液，回收吸附的级分。此级分用蒸发器浓缩，得到寡糖的醛型衍生物(收率约25％)。
(1-3)与胺类反应和还原反应(1-2)中制备的寡糖的醛衍生物以50mg/ml的比例溶解在50％正丙醇水溶液中，以10mg/ml的比例添加十二烷基苯胺。在45℃反应2小时后，添加硼烷二甲胺复合物使之达到10mg/ml。在45℃反应20小时，反应液减压蒸发至干。将残渣添加分配于氯仿∶甲醇∶水＝2∶1∶1的混合液中。收集水层，向水层中添加等量氟仿，进行分配洗涤。此操作重复2次后，水层冷冻干燥，得到寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物(OFDAD)(收率约64％)。本物质的结构从甲基化分析和NMR的解析结果可确定为如下的(1)式。要说明的是，岩藻糖残基的4位羟基中有一部分生成了硫酸酯。图1是寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物(OFDAD)的NMR(13C-NMR)谱图，图2是寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物(OFDAD)的IR谱图。
同(1-3)一样，不与十二烷基苯胺而与己基苯胺、苯胺、或月桂胺等烷胺反应，以同样方式分配反应液，得到(2)式的寡岩藻糖己基苯胺衍生物(OFHAD)、(3)式的寡岩藻糖苯胺衍生物(OFAN)、(4)式的寡岩藻糖月桂胺衍生物(OF-LA)等寡糖衍生物。
实施例2 寡鼠李糖衍生物的制备(2-1)鼠李糖寡糖的制备青海苔(Monostroma nitidum)的干燥藻体悬浮在10倍量的水中，在100℃加热2小时，浸出鼠李糖聚糖硫酸酯。离心分离除去固形物之后，添加乙醇、收集沉淀的多糖类、溶解在水中，用透析法除去低分子量成分，得到内液中的鼠李糖聚糖硫酸酯。然后，向含有鼠李糖聚糖硫酸酯的内液中添加盐酸使其浓度达到0.01当量，在100℃加热、进行脱硫酸反应。然后进行再透析、得到内液中的鼠李糖聚糖。
这种鼠李糖聚糖用与上述岩藻依聚糖的情况同样的方法进行弱酸分解、还原，以同样方式进行过碘酸氧化，制备了寡糖醛型衍生物(平均分子量约1000～1500)。
(2-2)与胺衍生物的反应本级分和十二烷基苯胺通过与上述同样的操作结合，得到(5)式的寡鼠李糖十二烷基苯胺衍生物(OR-DA)(收率约10％)。
除用以上所示实施例1、2制备的(1)式～(5)式衍生物外，还将利用上述制备法制成的衍生物清单列于以下(6)式～(10)式中。
实施例3 抗溃疡作用的试验1对于实施例1得到的寡岩藻糖十二烷基苯胺，用乙酸诱发溃疡进行抗溃疡作用试验。图3是显示乙酸诱发溃疡的操作流程图。如图3中所示，实验和效果判定是这样进行的对8周龄的SD大鼠，第1日将20％乙酸30μl注入胃内，使乙酸诱发溃疡发作，从第2日至第9日每日1次经口给药1μl试样溶液。要说明的是，在试验期间，饵料和水是自由摄取的。
在最后给药后使大鼠绝食，第10日摘除胃，用福尔马林固定后，测定溃疡部分的短径和长径(溃疡指数)，进行治愈率评价。当相对于对照组而言以5％以下的危险率确认效果时，该评价视为有意义。要说明的是，治愈率(％)＝(1-给药组溃疡面积/对照组溃疡面积)×100。结果列于下表1中。
表1
相对于对照组而言，危险率在5％以下。
实施例4 抗溃疡作用的试验2试样溶液换成实施例1得到的寡岩藻糖烷胺衍生物，进行同样的抗溃疡作用试验。具体地说，用寡岩藻糖己基苯胺以及寡岩藻糖月桂胺作为试样溶液，进行与实施例3同样的操作，检验寡岩藻糖己基苯胺和寡岩藻糖月桂胺对乙酸溃疡的效果。结果列于以下表2和表3中。
表2
*相对于对照组而言，危险率在5％以下。
表3
相对于对照组而言，危险率在5％以下。
实施例5 抗溃疡作用的试验3为了考察寡岩藻糖十二烷基苯胺对NSAIDS等诱发溃疡的防御效果，进行了关于对消炎痛(indomethacin)伤害的防御作用的效果检定。
具体操作如下。寡岩藻糖十二烷基苯胺溶解在0.5％羧甲基纤维素溶液1ml中，对绝食18小时和绝水2小时的大鼠经口给药。对对照组只给药羧甲基纤维素溶液。试样给药2小时后给药50mg/ml消炎痛1ml，以引起胃粘膜伤害。引起伤害2小时后，在麻醉下摘除胃、用福尔马林固定后，测定伤害部位(出血斑)的长和宽，计算其面积，求出伤害形成的抑制率，以验证寡岩藻糖十二烷基苯胺对消炎痛胃伤害的预防效果。结果列于以下表4中。
表4
*相对于对照组而言，危险率在5％以下。
实施例6 对幽门螺杆菌的粘连抑制效果和增殖抑制效果的检定幽门螺杆菌(H.pylori)，作为消化性溃疡的病原菌，是近年来引人注目的菌。特别是在本菌感染的患者中，已发现溃疡的复发率非常高，而且在通过大量给药抗生素等来根除了本菌的患者中复发率低下，因此，就防止消化性溃疡复发而言，本菌的根除或感染预防看起来很重要。事实上，欧美国家已经把本菌的根除列为溃疡治疗的指导准则，而在日本，随着老龄化进程的推进，感染率也在增加，因而在今后的溃疡治疗药方面也期待着对本菌的效果。
在本菌的根除方面，大量抗生素与质子泵抑制剂并用是有效的疗法，但从耐性菌的问题等来看，也有必要考虑其它疗法的开发。关于本菌的感染，据认为是从胃粘膜层借助于鞭毛运动而移向胃上皮细胞，在此特异性地认识并粘附到胃上皮细胞上的路易斯b型(Leb)糖链的岩藻糖残基上。也有人报告说，本菌的粘附涉及涎酸、硫酯类、昆布氨酸等，但就对胃上皮细胞本身的特异性粘附而言，岩藻糖被认为是重要的识别部位。
特别是来源于海蕴的岩藻依聚糖，已知不仅有抗溃疡效果，而且也能抑制这种粘附过程。对于上述寡糖烷胺衍生物来说，只要能抑制幽门螺杆菌的粘连，就不仅能促进本药剂对溃疡的治愈，而且可以期待能预防本菌感染和防止溃疡复发，因此，对其粘附抑制效果也进行了效果检定。此外，对增殖抑制效果也进行了确认。
具体操作，按照P.W.Tang等人的方法(Biochem，Biophys.Res.Commun.，vol.132，1985，p474-480)，使Leb型糖链的还原末端还原，再用过碘酸使这个还原末端氧化来制备寡糖。本寡糖与二氨基己烷结合，再进一步固定到氨基固定用微量培养板(Covalink PlateTM，NUNC公司制)上。向本培养板上添加生物素标记的幽门螺杆菌(H.pylori)，在室温下反应1小时。此时，与寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物适当共存。反应液用缓冲液洗涤，以除去未结合的菌体。
然后，向各孔中添加100μl链球菌抗生物素蛋白(50μg/ml)，在室温下反应1小时。这样，链球菌抗生物素蛋白就会选择性地结合到孔中残存的菌体上。洗涤除去过剩的链球菌抗生物素蛋白，然后添加100μl过氧化物酶标记的生物素溶液(2.5μg/ml)。在室温下反应30分钟后，除去过剩的酶标记生物素。通过本操作而生物素化了的菌体选择性地结合酶标记生物素，这种酶活性是通过添加100μl基质溶液(KPL公司制，ABTS过氧化物酶基质体系)并反应10分钟来检测的。检测是通过测定波长405nm的吸光度进行的。测定的吸光度表示认识、结合了Leb型糖链的菌体量，因此，从寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物的添加而引起的吸光度减少率，就能知道其粘附抑制率。
上述试验中，若在10～1000μg/ml范围内共存寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物，则如以下表5的寡岩藻糖十二烷基苯胺引起的幽门螺杆菌对Leb型糖链的粘附抑制活性结果所示，吸光度随添加量的增加而减少，由此可知，幽门螺杆菌(H.pylori)与Leb型糖链的结合受到了寡岩藻糖十二烷基苯胺衍生物的抑制。
表5
然后，用寡岩藻糖的十二烷基苯胺检定其对幽门螺杆菌(H.pylori)的增殖抑制效果。在含有0.1％β-环糊精的布鲁氏培养基中培养的临床分离株幽门螺杆菌6-34(1.5×108CFU/ml)100μl悬浮在相同培养基1ml中，添加试样(寡岩藻糖十二烷基苯胺)溶液10μl，培养72小时。效果判定是从相对于对照组菌液浊度(OD 600nm)而言的试样溶液浊度用下式计算增殖抑制率来判定的。其结果，得到71.8％的增殖抑制率增殖抑制率(％)＝(1-试样溶液浊度/对照组浊度)×100如上所述，按照本发明，提供有溃疡治愈促进作用和幽门螺杆菌(H.pylori)粘附抑制作用、可用于预防和治疗会转变成溃疡或胃癌的胃粘膜炎症的药剂。特别是上述物质在非常低剂量时就显示出对消化性溃疡的治愈促进效果或对粘膜伤害的防御效果，此外，通过寡糖化，可以比多糖更容易地制备物性和活性均匀的物质，因此，就作为药剂的利用也更容易进行而言，也是优异的。
权利要求
1.以下通式所示的寡糖衍生物Y1-OCH(CH2NHR)2式中，Y1是聚合数2～20的寡岩藻糖，其一部分羟基也可以是硫酸酯化的；此外，R是苯基、高级烷基苯基、高级烷基、或-(CH2)n-NHX，n是1～10的整数，X是高级链烷酰基、或烷胺基。
2.以下通式所示寡糖衍生物Y2-OCH(CH2NHR)2式中，Y2是聚合数2～20的寡鼠李糖，其一部分羟基也可以是硫酸酯化的；此外，R是苯基、高级烷基苯基、高级烷基、或-(CH2)n-NHX，n是1～10的整数，X是高级链烷酰基、或烷胺基。
3.寡糖衍生物的制造方法，其特征在于是用于制备以下通式所示寡糖衍生物的方法，包含使寡岩藻糖或寡鼠李糖的还原性末端糖残基氧化分解而转化成醛基的步骤，让对应的烷胺、芳胺类中至少一种作用于该醛基而生成席夫碱的步骤，和使该席夫碱还原的步骤；Y-OCH(CH2NHR)2式中，Y是聚合数2～20的寡岩藻糖或寡鼠李糖，其一部分羟基也可以是硫酸酯化的；此外，R是苯基、高级烷基苯基、高级烷基、或-(CH2)n-NHX，n是1～10的整数，X是高级链烷酰基、或烷胺基。
4.幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)用抑制剂，其特征在于含有权利要求1记载的寡糖衍生物中的1种或2种以上。
5.幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)用抑制剂，其特征在于含有权利要求2记载的寡糖衍生物中的1种或2种以上。
6.消化器官溃疡预防/治疗剂，其特征在于含有权利要求1记载的寡糖衍生物中的1种或2种以上。
7.消化器官溃疡预防/治疗剂，其特征在于含有权利要求2记载的寡糖衍生物中的1种或2种以上。
全文摘要
与岩藻糖或鼠李糖多糖类相比均匀性高、而且有优异抗溃疡效果的以下通式所示寡糖衍生物:Y－OCH(CH
文档编号C07H17/00GK1275129SQ98810098
公开日2000年11月29日 申请日期1998年8月21日 优先权日1997年8月22日
发明者长冈正人, 柴田英之, 木村逸子, 桥本秀介 申请人:株式会社雅库路特本社