专利名称：阿糖核酸的合成与聚肌胞的制作方法
技术领域：
本发明提出了阿糖核酸(Arabinonucleic Acid，ANA)新概念、人工合成的Poly rIPoly aC属于高效干扰素诱导剂，具有抗病毒、抗肿瘤功能。
早在1935年Hoskins就发现了病毒间相互干扰现象。1957年Issacs确认了干扰素的存在，凡是能诱导细胞或生物体产生干扰素的物质，便叫做干扰素诱导剂。人们相继发现一些细菌、立克次体、原虫、真菌提取物(双链RNA)和植物凝集素以及化学合成的小分子(如太洛龙)等均能诱导产生干扰素。值得特别强调提出的，1967年Field等发现人工合成的Poly rIrC具有很强的诱导产生干扰素的能力。
国内外研究证明，Poly rIrC不仅具有抗病毒作用，而且能刺激吞噬作用，增强抗体的产生，具有抗肿瘤作用。其抗肿瘤作用具有广谱性。细胞培养和动物试验显示，Poly rIrC对多种病毒如疱疹性口腔炎病毒、副流感病毒、肝炎病毒和脑心肌病毒等的感染均有良好的保护作用。此外，对若干种转移性肿瘤也具有抗性，如L1210腹水瘤、网状细胞肉瘤、S91瘤、乳腺癌和纤维肉瘤等均有不同程度的抑制作用。有关Poly rIrC临床应用，70年代国内外均做了大量工作(ScientificAmerican 1971，22526；中国药物杂志1982，1898)。在治疗单纯疱疹角膜炎、带状疱疹和水痘和若干肿瘤病方面均显示了较好效果。
由于干扰素诱导剂比外源性干扰素具有多方面的生物效应和安全性较好的特点，因此在重组干扰素大量进入市场的今天，干扰素诱导剂的研究仍具有一定的意义。
已有的Poly rIrC结构与功能关系研究资料揭示(FEBSLetter，1972，24137，Antimicrob Agents chemother 1977，11299)Poly rIrC作为干扰素诱导剂具备以下条件(1)足够高的分子量，大于106道尔顿，(2)具有双螺旋结构，Tm值大于60℃，(3)两条链上的糖环上的2’位必须是羟基，(4)保持嘌呤环的完整性，(5)嘧啶环上的C-5不可取代，(6)对RNase有相当的抗性。在研究人工合成核酸干扰素诱导物的过程中，为了提高其诱导能力，主要注意力放在硷基和磷酸基团修饰上，虽已取得了若干有意义的结果，然而并没有使其干扰素诱导能力有很大的提高，在临床应用上没有实际意义。人们对糖环上的2’位羟基关心较少，也有人作了2’-OH的甲基化和乙酰化报道，其结果证明2’-OH是其诱导干扰素不可缺少的。本发明在于对其糖环上的2’-OH不增加任何化学基团的情况下，仅改变2’-OH空间位置，把构成核糖核酸中的核糖换成阿糖，由阿糖核苷酸人工合成的多聚体，即所谓阿糖核酸。阿糖核苷在治疗白血病方面取得了较好的疗效(Nature，1976，264／5587679)，其缺点在于体内半衰期短，由于脱氨酶的作用将ara-C脱氨转化成无效的ara-U。本发明人工合成多聚阿糖胞嘧啶核酸(pcly aC)与Poly rI构成Poly rIaC双螺旋，作为干扰素诱导剂，它可能具有抗RNase作用，结构稳定和高效诱导的优点。即使Poly rIaC经受RNase水解产生的aCMp或a-C，仍具有抗病毒抗肿瘤作用。
本发明主要内容包括大肠杆菌PNpase酶的制备，rIDP和aCDP的合成，酶促合成Poly rI和Poly aC，双螺旋核酸Poly rIaC的制备。
实施例(一)大肠杆菌PNpase酶的制备以自己筛选得到的PNpase酶高产大肠杆菌菌株为PNpase酶生产菌，采用蛋白胨-葡萄糖培养基，将菌种单个菌落挑出，经二级摇瓶(50m／250ml)，37度培养12小时，接入500ml培养液(装在3000ml三角瓶中)，31度振荡培养24小时，离心8000 rpm 10 min收集菌体(约14g)。
1、细胞裂解将菌体悬浮在30ml STE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8．0--1mM EDTA--100mM NaCl)，加入溶菌酶约80mg(溶在适量的STE中)，室温放置约20min，在搅拌下加入1．5mlTriton-100(以15ml STE稀释)和1／20体积的25mM PMSF，最后加入冷蒸馏水50ml，离心9000rpm 20min收集上清液95ml。
2、硫酸链霉素处理去除核酸类酸性物质在搅拌下加入5ml 10％硫酸链霉素(溶在*TE 溶液中)，边滴加边搅拌约20min加完，加完后继续搅拌10min，9000rpm 离心20min去除沉淀。
3、(NH4)2SO4分部沉淀加固体(NH4)2SO4于链霉素处理的上清液中，边搅拌边加(NH4)2SO4使之达到35％饱和液，并以4N KOH调pH7．0，9000rpm离心20min去沉淀，上清液继续加(NH4)2SO4饱和度达60％，室温(22℃)放置过夜，离心收集沉淀，以TE-溶解，对TE搅动透析，换TE4次，离心去沉淀，上清液即为粗酶液。
4、TEAE柱层析TEAE(Serva公司出品)经预处理，装柱，TE缓冲液平衡，将上述粗酶液上柱。淋洗分别以0．1M NaCl inTE和0．2M NaCl in TE 淋洗。洗脱以0．35M NaCl洗脱，分部收集，将活性高的部分合并。平均酶活性达30u／ml，20℃保存备用。
*TE20mM Tris-HCl，pH 8．2和1mM EDTA。
(二)rIDP和aCDP的制备rIDP的制备按靳传富等人的方法(生物化学与生物物理进展，1975，425)。
aCDP的合成以aCMP为起始原料，以啤酒酵母细胞为酶源，在高浓度无机磷条件下，进行磷酸化反应，获得aCDP。反应条件每毫升含葡萄糖145mg，aCMP 6．5mg，KH2PO428mg，MnCl213mg，和啤酒酵母0．5g，pH 6．5。盛于小三角瓶中，28℃摇荡15小时终止反应。100℃水浴5min，8000rpm离心20min去沉淀。分离纯化将上述上清液，以0．1M NH4HCO3溶液稀释10倍，上TEAE(Serva)柱。以0．3M--1．5M NH4HCO3溶液进行线型梯度洗脱。收集aCDP部分，减压浓缩。以4N HCl调pH2．5，加3倍体积95％乙醇，4℃过夜，10000rpm离心20min，收集沉淀，以无水乙醇脱水处理2-3次，减压干燥。
(三)Poly rI和Poly aC的酶促合成Poly rl的酶促合成参照靳传富等人的条件(生物化学与生物物理进展，1975，425)。
酶促反应液的组成Tris-HCL(pH8．5)，150mM，MgCL26mM，EDTA1mM和尿素300mM。
反应条件每毫升反应液中加入30mg rDIp和pNpase 2单位，35℃保温16小时。
加入等体积苯酶(150mM Tris-HCL，pH8．5饱和)振荡处理约10min，分层后吸取水相，以二分之一体积150mM Tris-HCL(pH8．5)反抽提一次，两次合并，在低温下，对10mM柠檬酸钠-50mM NaCL溶液搅拌透析，经检测，透析外液基本上无紫外吸收值(0．D248＜0．05)，10000rpm离心除去沉淀，加入3倍体积95％乙醇，-10℃放置3-4小时，10000rpm离心收集沉淀，无水乙醇洗三次。最后，置真空干燥器。产率为50％左右，平均分子量约18S(约合106道尔顿)。
Poly aC的酶促合成酶合成液的组成Tris-HCL(pH9．0)100mM，MnCL230mM，CuSO44mM和尿素300mM。
反应条件每毫升合成反应液中加入aCDP 20mg和pNpase 2单位，37℃保温12小时。加等体积苯酶终止反应，其它操作条件与PolyrI相同。
(四)人工合成核酸双螺旋Poly rIaC的制备将rIDP和aCDP按等量配制在pH7．2，6mM PBS-5mM MgCl2-100mMNaCl溶液中，预热至40℃，然后按等体积混合，40℃水浴保温20min，取出室温冷却后，-20℃保存。经分析减色效应一般＞30％，Tm值约60℃。
权利要求
1. 一种具有如下结构式的阿糖核酸(ANA)，其特征在于构成核酸的基本单元是核苷酸，它是由碱基、核糖和磷酸根组成，其糖环结构上与脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的区别为，DNA为2-脱氧核糖(D)，RNA为核糖(R)，ANA为阿糖(A)。注B碱基；P磷酸基团
2. 一种根据权利要求1人工合成ANA的方法，其特征在于(1) 以多核苷酸磷酸化酶(PNpase)分别以rIDP和aCDP合成多聚黄嘌呤核苷酸(Poly rI)和多聚阿糖胞嘧啶核苷酸(PolyaC)；(2) 按适当的比例，在一定条件下使Poly rI和Poly aC形成双链。
3. 根据要求2所述的方法，其中Poly rI平均分子量控制在106道尔顿以上，Poly aC平均分子量控制在104-105范围内。
全文摘要
本发明提出了阿糖核酸的概念和人工合成的方法以及对干扰素诱导剂聚肌胞研究的意义。
文档编号C07H21/00GK1292381SQ99121719
公开日2001年4月25日 申请日期1999年10月9日 优先权日1999年10月9日
发明者张其玖 申请人:张其玖