N端1至9位氨基酸缺失的人白细胞介素11衍生物的制作方法

专利名称：N端1至9位氨基酸缺失的人白细胞介素11衍生物的制作方法
已经证明和发现在免疫系统和造血系统中起调节作用的蛋白质有数十种，它们统称为细胞因子，如集落刺激因子、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等。这些细胞因子具有广泛的靶细胞，包括骨髓细胞、外周血细胞、胎肝细胞、淋巴细胞等。由于细胞因子的自然来源十分有限，应用基因工程手段进行基因克隆、重组表达和高效的纯化，是目前众多细胞因子在基础研究和临床应用上的重要手段。
人白细胞介素11(interleukin-11，IL-11)是具有多种生物功能的蛋白。已经证实的主要作用有刺激巨核细胞增生，增加血小板数量，促进B细胞的发育和功能，保护粘膜细胞受损。天然成熟人白细胞介素11由178个氨基酸组成，分子量为20KD，是强碱性蛋白(pI 11.7)，疏水性强。人IL-11基因全长1100对碱基，其中5’端有72个碱基非编码区，3’端有431个碱基非编码区。阅读框架为597个碱基，翻译表达为199个氨基酸组成的人白细胞介素11蛋白，其中N末端1-21个氨基酸是信号肽序列，故天然活性的人白细胞介素11N末端为Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Ala Ser Pro Asp等。猿和鼠的白细胞介素11基因已被克隆和重组表达成功。人和猿的白细胞介素11在氨基酸和碱基序列方面有极高的同序性，其中氨基酸序列同源性93.7％，碱基序列同源性99.5％。
应用基因工程手段进行天然细胞因子的重组表达以及改造已成为一种重要手段。基因工程的改造主要包括基因的缺失、突变和融合，从而可以制备出各种形式的衍生物。改造的目的除了要进行蛋白的结构与功能研究外，在提高蛋白的生物功能和减少体内毒副作用方面，更具有药物升发价值。我们曾发明了一种应用基因工程重组手段对人白细胞介素11进行N末端改造的方法(专利申请号CN 99111463.9)，形成在人白细胞介素11的N末端缺失5个氨基酸的基础上，对第7个和第10位氨基酸进行替换成猿在相对应氨基酸位置上的改造型。在前面专利的基础上，本专利发明了N端1至9位氨基酸缺失的人白细胞介素11衍生物的改造和制备方法。N端1至9位氨基酸缺失的人白细胞介素11是在人白细胞介素的N末端缺失9个氨基酸的基础上，并对第一个氨基酸进行替换而成的新型衍生物，人白细胞介素11的N末端9个氨基酸的缺失和第10位氨基酸的替换主要采用基因工程技术，然后用重组表达形式经分离纯化而得。重组形式的N端1至9位氨基酸缺失的人白细胞介素11衍生物经体内外试验证明具有天然人白细胞介素11相同的生物活性和功能，且在动物实验中发现了有比天然人白细胞介素11所不具有的特点。在猕猴卡铂化疗模型中除了促进外周血血小板数目外，还具有升高中性粒细胞的功能。在动物代谢试验中，发现N端1至9位氨基酸缺失的人白细胞介素11衍生物在胃肠粘膜组织中的分布更强。在动物实验中发现和证明的这些特点具有极大的药用价值。
由于人白细胞介素11蛋白的特殊性，在大肠杆菌体系中需采用融合蛋白的表达形式来进行。根据不同表达质粒体系和融合蛋白切开的特点，在天然人白细胞介素11的N末端缺失9个以后的第一个氨基酸应不同，即天然人白细胞介素11的第10位氨基酸将被替换。在本专利实例说明中采用谷胱甘肽转硫酶(GST)作为融合蛋白，用凝血酶切开融合蛋白后形成的△1-9人白细胞介素11衍生物在N末端的第一个氨基酸被换成丙氨酸。选择丙氨酸的依据是根据前面专利(CN99111463.9)所述，在此位置人和猿的氨基酸有差异，即人为缬氨酸，猿为丙氨酸。这种Val到Ala的替换更合理。由于凝血酶识别位点的特异性是X1-X2-Pro-Arg-X3-X4，X1，X2是疏水氨基酸，X3，X4是非酸性氨基酸。在本方法中X1，X2的要求不会影响△1-9人白细胞介素11衍生物的制备，X3，X4因凝血酶切开后将是△1-9人白细胞介素11的前二个氨基酸，因此具有较大的选择性。本专利的衍生物只涉及缺失后的第一个氨基酸的替换，因此X4应为人白细胞介素11相应位置的氨基酸即Ser。X3虽然具有较大的选择性，我们研究发现首选序列是Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Met-Ser。这几种氨基酸作为X3，凝血酶均能有效的切开Arg后的肽键。应用本专利实例中的原理，可以用非凝血酶的方法来切开融合蛋白制备出△1-9人白细胞介素11衍生物，也可以用非GST(谷胱甘肽转硫酶)作为融合蛋白的质粒表达系统来制备出△1-9人白细胞介素11衍生物。
由于基因工程技术的进步，新的原核表达体系、酵母表达体系、昆虫表达体系、哺乳动物细胞表达体系、转基因动物表达体系、转基因植物表达体系制备重组蛋白的方法越来越多。本专利中所述△1-9人白细胞介素11衍生物同时可以在这些体系中重组表达。由于蛋白合成技术的进步，应用蛋白多肽自动合成仪或人工蛋白多肽合成方法同样可以制备出本专利所述的△1-9人白细胞介素11衍生物。实例说明I一.重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物融合表达系统的构建和测序选用含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达质粒pGEX-4T-1(Pharmacia)作为构建的载体，此载体含有凝血酶位点。根据人和猿的白细胞介素11的cDNA序列，以及新型改进型人白细胞介素11即N末端缺失5个氨基酸，N末端第7位和第10位氨基酸改为猿的Ser和Ala的要求，设计两对PCR引物，即正链5’-CT GGA TCC CCT CGA GCT TCC CCA GAC CCT CGG-3’，反链5’-TTATCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG CAG TAG CCC-3’。以人的白细胞介素11全基因cDNA为模板，扩增出的改进型人白细胞介素11基因片段与酶切后的pGEX-4T-1大片段相连，转化大肠杆菌JM105，筛选出含插入片段的重组子命名为pGEX-FK-11a(

图1)，经序列分析后可进行融合表达研究。
从pGEX-FK-11中用BamH I和Sal I双酶切下新型改进型人白介素11基因片段，与pUC-19经BamH I和Sal I双酶切后的大片段相连，用蓝白斑法筛选出重组子，命名为pUC-FK-11a。经AB I全自动基因测序后得到插入的新型人白介素11的基因序列以及相对应的氨基酸序列，结果分析与设计的完全一致。二.重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物的重组表达和制备含新型改进型人白细胞介素11基因的pGEX-FK-11a转化大肠杆菌JM105，在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.5mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含新型人白细胞介素11的融合蛋白GST-FK-11a(44.6KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的28％。
用1000ml发酵液，离心收集菌体约15克，用50mM磷酸缓冲液(pH7.8)含1％Triton溶液混悬菌体，在室温下破菌20分钟，破菌液经超声波处理至无粘稠后离心去沉淀。上清经Glutathion-Sepharose(Pharmacia)进行亲和层析纯化，吸附在柱上的含新型人白细胞介素11的融合蛋白，用人血浆凝血酶(每毫升含用5NIH单位凝血酶)室温下在位酶切1小时。酶切下的重组新型人白细胞介素11再经CM-Sepharose CL-4B纯化，最终产物的纯度超过98％，热原含量每mg蛋白低于10EU内毒素。三.重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物的理化性质和生物活性本方法制备的重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物分子量为18.2KD，等电点大于10.0，紫外最大吸收峰为281nm，溴化氰肽图分析含有二个甲硫氨酸。氨基酸组成分析与理论设计值一致，由169个氨基酸组成，其中无半胱氨酸。N末端测序证实是Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val LeuLeu，与设计的重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物N末端序列完全一致。
用依赖于白细胞介素6的细胞株7TD1和B911的MTT方法测活，参照品是美国Genetics Institute的缺失脯氨酸的重组人白细胞介素11和天然的人白细胞介素11。测得本方法制备的重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物的比活性分别是2.5×106U/mg(7TD1细胞)和8.0×106IU/mg(B911细胞)，与天然和缺失脯氨酸的人白细胞介素11的比活性完全一致。四。重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物增加猕猴外周血血小板和白细胞的数量猕猴静脉注射卡铂15mg/kg/day，连续3天，在第三次注射后18小时内sc△1-9(ala)人白细胞介素11衍生物，分二个剂量组，1次/日，连续给药14天。表(1)示重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物50μKD和100μKD均能明显提高猕猴外周血血小板数量，与neumega(美国GI公司上市的重组人白细胞介素11)100μKD效果完全一致。
表(1)△1-9(Ala)10人白细胞介素11衍生物对注射卡铂猕猴血小板计数的影响时间血 小 板 计 数 (109/L)(天) 模型对照组 50μKD组100μKD组 neumega(100μKD)给药前 396.9±90.9 397.1±98.8 379.1±79.0 397.8±38.8给药1天420.8±93.2 398.0±131.9320.0±62.9 346.5±28.93天385.2±104.6398.5±21.2 426.3±65.6 444.0±27.45天340.8±78.2 368.3±88.3 416.5±110.6 583.3±184.7*7天188.3±54.6 222.8±140.9535.0±134.4**477.8±274.59天98.0±70.8 293.8±131.3*476.8±167.7**491.3±301.7*11天 77.3±35.2 455.3±172.1**407.3±149.2**513.5±249.4*13天 215.0±48.2 409.8±144.3*399.5±36.4***300.0±192.2停药1天416.5±108.9609.5±155.2521.3±116.6 506.3±73.43天740.0±118.6951.5±221.6584.5±84.8 723.5±193.25天755.5±59.8 975.3±152.5*687.3±119.8 856.5±283.67天720.3±15.7 959.8±128.1**670.3±140.4 865.8±129.19天584.5±21.3 983.5±57.2***812.8±209.4 781.0±113.9**11天 525.3±56.9 901.0±105.6***743.0±89.4**874.3±61.6***13天 413.0±43.3 593.5±38.2***594.0±95.7*628.0±112.3*15天 352.5±23.8 608.3±124.0**510.5±108.3*472.3±62.9*注neumega为美国Genetics institute的已上市重组人白细胞介素11n＝4.与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与小计量组相比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.01
表(2)示重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物50μKD和100μKD均能明显提高猕猴外周血白细胞总数，而neumega(美国GI公司上市的重组人白细胞介素11)100μKD对猕猴外周血白细胞总数的增加效果不显著。
表(2) △1-9(Ala)10人白细胞介素11衍生物对注射卡铂猕猴白细胞总数的影响时间 白细 胞 总 数 (109/L)(天) 模型对照组50μKD组 100μKD组neumega(100μKD)给药前 12.1±5.9 10.3±0.810.9±2.611.9±1.6给药1天 11.5±9.4 10.8±3.815.3±5.812.1±3.63天 10.3±3.0 9.2±5.1 6.5±2.4 8.6±1.45天 7.2±3.3 6.9±5.4 11.4±6.410.1±2.37天 6.4±2.9 4.0±3.1 11.2±6.97.5±0.89天 6.0±1.0 6.3±3.6 7.3±2.7 6.0±1.011天 5.2±1.9 5.9±0.9 8.8±2.1*7.0±1.113天 6.0±2.1 8.1±0.7 8.0±2.6 6.0±2.3停药1天 3.6±1.1 10.0±3.2**6.7±1.9*6.0±2.43天 4.7±1.9 11.6±3.8*10.1±3.5*7.8±3.25天 4.4±1.3 8.9±1.4**12.2±4.9*6.8±1.97天 6.9±0.9 10.5±2.3*15.1±7.17.3±3.09天 9.8±3.3 11.8±2.115.1±7.28.0±2.211天 15.4±4.6 12.4±3.915.2±5.77.6±1.2*13天 14.0±2.2 11.5±5.114.2±3.910.5±3.115天 9.2±1.4 13.4±5.513.0±3.710.3±3.0注neumega为美国Genetics institute的已上市重组人白细胞介素11n＝4.与模型对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01五.重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物组织分布特性小鼠sc给药50μg/kg的重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物，0.1ml/20g(含125I-rh△1-9(ala10)IL-112.125μCi/只)，给药后0.25、2、4、8h处死动物测组织分布。表(3)结果显示，在给药后0.25h，组织含药量最大，以后逐渐降低，放射活性从高到低的顺序为胃、肾、肠、肺、脾、肝、心、脂肪、卵巢、睾丸、肌肉和脑；给药后8h，其分布还是以胃最高，其次是肠、肾、肝、肺、脾、脂肪，睾丸和脑中含量最低。
表(3)小鼠sc给药50μg/kg的重组人△1-9(ala10)白细胞介素11衍生物后用RA法测得的组织药物含量(*±S，n＝6)组织 药物含 量(ng/g)脏器0.25h1h 2h 4h 8h心 20.27±4.52 8.98±0.48 6.22±0.56 4.94±0.38 3.98±0.40肝 24.76±1.39 17.70±2.28 9.56±1.35 6.21±0.83 5.47±0.56脾 29.44±3.58 18.22±1.16 10.89±2.92 6.15±0.34 5.39±0.58肺 30.57±2.83 21.34±3.54 11.60±2.30 7.12±0.61 5.49±1.10肾 54.76±1.48 28.53±4.13 16.81±3.19 10.97±0.94 8.94±0.42胃 231.20±41.48249.94±41.03 142.03±11.86 136.46±25.6959.53±8.11小肠32.07±3.90 31.76±4.70 14.65±3.68 8.07±1.68 10.28±4.46肌肉12.79±3.15 14.23±1.54 4.94±1.62 2.53±0.37 1.90±0.36脑 2.82±0.05 1.96±0.15 1.66±0.65 0.53±0.06 0.54±0.07脂肪16.99±4.97 10.25±2.24 4.14±0.91 2.38±1.56 1.84±0.64卵巢14.70±1.10 26.48±4.62 10.71±0.31 8.10±0.19 2.80±0.09睾丸14.22±1.09 - 5.93±0.74 4.95±0.44 0.70±0.56血液61.79±12.66 37.56±7.86 22.08±7.76 9.88±1.56 10.02±3.84实例说明II重组人△1-9(gly10)白细胞介素11衍生物融合表达系统的构建和测序根据“实例说明1”所述，选用含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达质粒pGEX-4T-1(Pharmacia)作为构建的载体，此载体含有凝血酶位点。设计两对PCR引物，即正链5’-CT GGT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG-3’，反链5’-TTA TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG CAG-3’。以人的白细胞介素11全基因cDNA为模板，扩增出的改进型人白细胞介素11基因片段与酶切后的pGEX-4T-1大片段相连，转化大肠杆菌JM105，筛选出含插入片段的重组子命名为pGEX-FK-11g(图2)，经序列分析后可进行融合表达研究。从pGEX-FK-11g中用BamH I和Sal I双酶切下新型改进型人白介素11基因片段，与pUC-19经BamH I和Sal I双酶切后的大片段相连，用蓝白斑法筛选出重组子，命名为pUC-FK-11g。经AB I全自动基因测序后得到插入的新型人白介素11的基因序列以及相对应的氨基酸序列，结果分析与设计的完全一致。二.重组人△1-9(gly10)白细胞介素11衍生物的重组表达和制备同样根据“实例说明1”所述，含新型改进型人白细胞介素11基因的pGEX-FK-11g转化大肠杆菌JM105，在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.5mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含新型人白细胞介素11的融合蛋白GST-FK-11g(44.6KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的28％。用1000ml发酵液，离心收集菌体约15克，用50mM磷酸缓冲液(pH7.8)含1％Triton溶液混悬菌体，在室温下破菌20分钟，破菌液经超声波处理至无粘稠后离心去沉淀。上清经Glutathion-Sepharose(Pharmacia)进行亲和层析纯化，吸附在柱上的含新型人白细胞介素11的融合蛋白，用人血浆凝血酶(每克融合蛋白用5NIH单位凝血酶)室温下在位酶切1小时。酶切下的重组新型人白细胞介素11再经CM-Sepharose CL-4B纯化，最终产物的纯度超过98％，热原含量每mg蛋白低于10EU内毒素。三.重组人△1-9(gly10)白细胞介素11衍生物的理化性质和生物活性本方法制备的重组人△1-9(gly10)白细胞介素11衍生物分子量为18.2KD，等电点大于10.0，紫外最大吸收峰为281nm，溴化氰肽图分析含有二个甲硫氨酸。氨基酸组成分析与理论设计值一致，由169个氨基酸组成，其中无半胱氨酸。N末端测序证实是Gly Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr ValLeu Leu，与设计的重组人△1-9(gly10)白细胞介素11衍生物N末端序列完全一致。
用依赖于白细胞介素6的细胞株7TD1和B911的MTT方法测活，参照品是美国Genetics Institute的缺失脯氨酸的重组人白细胞介素11和天然的人白细胞介素11。测得本方法制备的重组人△1-9(gly10)白细胞介素11衍生物的比活性分别是2.5×106U/mg(7TD1细胞)和8.0×106IU/mg(B911细胞)，与天然和缺失脯氨酸的人白细胞介素11的比活性完全一致。
权利要求
1.△1-9人白细胞介素11衍生物，是在天然人白细胞介素11N末端缺失9个氨基酸的基础上，缺失后的第一个氨基酸进行替换后形成的衍生物。
2.条款1中缺失后的第一个氨基酸替换是将人白细胞介素在相应位置上的氨基酸Valine用其它氨基酸进行替换。
3.条款2中的替换氨基酸主要是Ala、Gly、Leu、Pro、Thr、Met、Ser，其它氨基酸也同样适用。
4.条款1、2中的缺失和替换是应用基因工程技术的方法。
5.条款1、2中的△1-9人白细胞介素11衍生物可以是重组形式和人工合成形式。
6.条款5中的重组形式适用于原核和真核表达体系，以及转基因动植物体系来完成。
7.条款5中的人工合成形式适用于蛋白多肽的自动合成和手工非自动合成方法来完成。
8.条款1、2中的△1-9人白细胞介素11衍生物具有白细胞介素11相应的生物学功效。
9.条款1、2中的△1-9人白细胞介素11衍生物具有治疗和预防疾病的功效，主要指血小板减少症、白细胞减少症和胃肠粘膜保护等。
10.条款8、9中的生物功效和药用功效具有药物和非药物价值。
11.条款10中的药物价值指各种剂型的药品。
12.条款10中的非药物价值指各种形式的商业产品。
全文摘要
利用基因工程手段对人白细胞介素11进行改造,制备出的衍生物证明具有各种生物功能。本发明的比人天然白细胞介素11N末端缺失9个氨基酸,且在缺失后的第一个氨基酸进行同源替换的衍生物Δ1—9人白细胞介素11,具有潜在的药物开发价值。
文档编号C07K14/52GK1264709SQ99123759
公开日2000年8月30日 申请日期1999年11月19日 优先权日1999年11月19日
发明者范开, 聂李亚, 马素永, 黄洪涛 申请人:重庆多泰制药有限公司