专利名称：人脑表达的x染色体连锁蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽—人脑表达的X染色体连锁蛋白(human brain expressed X-linked protein，简称“hBex”)，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。
印记基因(imprinted genes)就是在生物体内存在着一些的基因或染色体，它们保留配子的某些特征并进行选择性差异表达。这些印记基因在生物体内的特异表达均通过一基因组印记过程来完成。基因组印记(genomic imprinting)即某一基因的个别等位基因根据其父母本的不同来源而进行特异性地表达。这些等位基因在配子形成过程中或在发育早期已被特异性地标识出来，且这一标识是可遗传的，一代代间是可逆的，其表达与否很可能存在稳定的外遗传修饰。在生物体内已证实存在100-200种不同的印记基因，其中只有20-30种被确定。现约有25种印记基因被证实具有稳定的外遗传修饰，其中一些被表明在肿瘤的发生过程中起作用[Joyce JA，Schofield PN；Mol Pathol 1998Aug；51185-90]。研究发现，基因组印记在生物体内具有很多重要的生物学功能，其与胚胎发育、胚胎生长、各种增生滋生层疾病的发生及各种人体癌症的发生均有一定的关系[ChilosiM，Lestani M et al.，Adv Clin Path 1998 Jan；215-24]。
CAAX基序由一半胱氨酸残基后接两个脂肪族残基及一个C末端X残基组成，其中X可以是C、S、M、Q或A中的一个[Taparowsky，E.etal.，Cell，1983；34581-86]。该基序为蛋白转运前修饰的靶位点，在生物体有着非常重要的生物学功能。研究发现，该基序中半胱氨酸残基的异戊二烯化直接影响着蛋白发挥正常的生物学功能。只有经异戊二烯化，蛋白才能正确地与细胞膜结合，调节细胞的分化与增殖。通常由GGTase(异戊二烯基转移酶)对其进行修饰，将法尼基或牦牛儿基转移至末端Cys残基上，修饰后利用高度变化的C末端来完成蛋白与细胞膜的结合与相互作用[Hancock JF，Cadwallader K，et al.，EMBO J1991Dev；10；4033-4039]。研究证实，已知的各种含CAAX基序的蛋白(如Ras蛋白，G蛋白等)均存在这一转运前修饰过程[Brown AL，Kay GF；Hum Mol Genet，1999，Apr；8611-619]。这些蛋白高度变化的C末端决定了它们在不同细胞器膜上的定位。若C末端被去除，则这些蛋白与膜结合的特异性也将消失。另外，CAAX基序异戊二烯化修饰还可能与肿瘤发生及血胆脂醇过高等疾病有关[Schafer，W.R.；Rine，J.；Annu.Rev.Genet.，1992，26209-237]。
已表明，印记基因与一些疾病相关，例如胚胎发育、胚胎生长、各种增生滋生层疾病。因此，为治疗目的研究和开发人印记基因及其编码蛋白，以及有关激动剂/抑制剂有重要意义。
本发明的一个目的是提供分离的新的多肽-人脑表达的X染色体连锁蛋白(human brain expressed X-linked protein，简称“hBex”)以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供含有编码人脑表达的X染色体连锁蛋白的多核苷酸的重组载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码人脑表达的X染色体连锁蛋白的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供生产人脑表达的X染色体连锁蛋白的方法。
本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽-人脑表达的X染色体连锁蛋白的抗体。
本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽-人脑表达的X染色体连锁蛋白的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。
本发明的另一个目的是提供诊断和治疗与人脑表达的X染色体连锁蛋白异常相关的疾病的方法。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的人脑表达的X染色体连锁蛋白，该多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、类似物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供分离的编码这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少74％相同性(a)编码上述人脑表达的X染色体连锁蛋白的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中173-550位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-792位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有hBex活性的多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达hBex的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有hBex活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的hBex多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-792个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗hBex多肽活性的化合物，以及抑制hBex多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是hBex多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了用上述化合物来调节hBex在体内、体外活性的方法。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与hBex多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进hBex多肽活性的激动剂，或者筛选抑制hBex多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的hBex的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的hBex多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗胚胎发育不良及获得性和遗传性疾病；增生滋生层疾病；各种肿瘤及癌症的发生；听力失聪；X染色体连锁的智力迟钝及无脑回症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图中，
图1是人在脑中表达的与X染色体连锁的蛋白(hBex，上排)和鼠在脑中表达的与X染色体连锁的蛋白(mBex2，下排)的氨基酸比较。
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的人脑表达的X染色体连锁蛋白”是指人脑表达的X染色体连锁蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人脑表达的X染色体连锁蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。人脑表达的X染色体连锁蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明提供了一种新的多肽-人脑表达的X染色体连锁蛋白(hBex)，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人脑表达的X染色体连锁蛋白的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的人脑表达的X染色体连锁蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。
在本发明的一个实例中，编码人脑表达的X染色体连锁蛋白的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为792个碱基，其开放读框(173-550位)编码了125个氨基酸。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与与鼠在脑中表达的X染色体连锁蛋白的基因(Bex2)在蛋白水平上有72％同一性和85％相似性。而且，本发明多肽在C末端含有出现于类似CAAX基序。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一种多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50％，优选具有70％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时添加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码hBex的多核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的编码hBex的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶链反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定hBex转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在1000个核苷酸之内，较佳的为500个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素、荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等进行。
在第(4)种方法中，检测hBex基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因或其各种DNA片段的序列，可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用hBex编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中，编码hBex的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J.Bio.Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码hBex的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)、或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码hBex的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是用MgCl2进行处理。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的hBex。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码hBex的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗如恶性肿瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各类炎症等。
本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)hBex的药剂的方法。激动剂提高hBex刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞与标记的hBex一起培养。然后测定药物提高或阻遏hBex的能力。
hBex的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。hBex的拮抗剂可以与hBex多肽结合并消除其功能，或是抑制该多肽的产生，或是与该多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将hBex加入生物分析测定中，通过测定化合物对hBex和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。能与hBex结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对hBex分子进行标记。
本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对hBex抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
多克隆抗体的生产可用hBex直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备hBex的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗hBex的单链抗体。
抗hBex的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的hBex。
与hBex结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如hBex高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭hBex阳性的细胞。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与hBex相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断hBex的产生或活性。
本发明还涉及定量和定位检测hBex水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的hBex水平，可以用作解释hBex在各种疾病中的重要性和用于诊断hBex起作用的疾病。
本发明的多肽还可用作肽谱分析。例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
编码hBex的多核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于hBex的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计用于表达变异的hBex，以抑制内源性的hBex活性。例如，一种变异的hBex可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的hBex，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗hBex表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码hBex的多核苷酸转移至细胞内。构建携带编码hBex的多核苷酸的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，etal.)。另外重组编码hBex的多核苷酸可包装到脂质体中然后再转移至细胞内。
多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
抑制hBex mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
编码hBex的多核苷酸可用于诊断与hBex的相关疾病。编码hBex的多核苷酸可用于检测hBex的表达与否或在疾病状态下hBex的异常表达。如编码hBex的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断hBex的表达状况。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用hBex特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测hBex的转录产物。
检测hBex基因的突变也可用于诊断hBex相关的疾病。hBex突变的形式包括与正常野生型hBex DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。然而，现在只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其中重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomesa Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。hBex以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的hBex的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
此外，由于本发明的hBex具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
就hBex蛋白而言，本发明的多肽或其片段或其衍生物可以用来治疗胚胎发育不良及与之相关的各种获得性和遗传性疾病；增生滋生层疾病；各种肿瘤及癌症的发生；X染色体连锁的智力迟钝及无脑回症等疾病的方法。因hBex基因是一种在脑组织中表达的X染色体连锁的基因，其表达异常还可能引起听力及智力方面的疾病。
由于hBex蛋白C末端CAAX基序(具体氨基酸序列为CLMP)中半胱氨酸残基的异戊二烯化决定了其在不同细胞器膜上的定位。因此，该蛋白对细胞器间蛋白的转运和膜泡运输的正确定位及融合都具有非常重要的作用。因而通过基因工程生产或利用hBex蛋白调节细胞内蛋白的转运是非常有用的。另外，CAAX基序的异戊二烯化修饰还可能与肿瘤发生及血胆脂醇过高等疾病有关。
hBex蛋白必须由GGTase(异戊二烯转运酶)催化，将异戊二烯基转运至其C末端的半胱氨酸残基上才能发挥正常的生物学功能，因此GGTase的抑制剂可有效地阻断hBex的生物活性。对于由hBex蛋白异常表达而引发的各种肿瘤及癌症，GGTase的抑制剂将是一种非常有价值的药物。
此外，hBex蛋白多肽或其片段或其衍生物加到细胞系中可以刺激细胞分化及增殖，还可以借助脂质体、电穿孔等手段直接加入到活体细胞内。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1hBex蛋白cDNA的克隆用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quick mRNA分离试剂盒(Qiegene)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA.用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化DH5α，细菌形成cDNA文库。共获得3028个克隆。用双脱氧法测定所有克隆的5＇和3＇末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个克隆(286g05)的DNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对hBex蛋白克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，hBex蛋白克隆所含的全长cDNA是一个新的DNA序列(如SEQ IDNO1所示)，从第173bp至550bp有一个378bp的ORF，编码一个新的125氨基酸的蛋白质(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白质命名为人在脑中表达的与X染色体连锁的蛋白(human brain expressed X-linked protein，简称hBex)。
实施例2cDNA克隆的同源检索用hBex蛋白基因的序列及其编码的蛋白序列到Genbank，Swissport等数据库进行同源检索，用于检索的程序叫Blast(Basic local Alignment searchtool)(1993Proc Nat Acad Sci905873-5877)，Blast可以找出与人在脑中表达的X染色体连锁的蛋白同源的许多基因，其中与本发明的hBex基因同源性最大的基因为AF097439(这是Genbank准入号)。这些检索到的基因或蛋白序列可以从Genbank数据库中调出。调出的序列可以用GCG软件包中的Pileup(多序列)和Gap(两序列)程序做连配比较。新蛋白的功能预测可以用Motif程序进行分析。结果见附图1。
该结果显示hBex基因与鼠Bex2基因具有最高的同源性，两者相同性＝94/129(72％)，相似性＝110/129(85％)。
实施例3实施例3用RT-PCR方法克隆编码人脑表达的X染色体连锁蛋白的基因用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagene的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增引物15＇-GACTCGTGTCTCGCTACCAGCTCCC-3＇(SEQ ID NO3)引物25＇-TTTTTAAAGGTGCTTTATTAAC-3＇(SEQ ID NO4)引物1对应于位于SEQ ID NO1的5＇端的第1个碱基开始的正向序列；引物2对应于为SEQ ID NO1的3＇端反向序列。
扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR时同时设β-肌动蛋白为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO1所示的1-792bp完全相同。
实施例4hBex蛋白在大肠杆菌系统中的表达和纯化根据该新hBex蛋白相应的基因序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下引物A15＇-AAGCTTGGGCATAAGGCAAAACTCATCATGA-3＇(如SEQ ID NO5所示)引物A25＇-CCATGGCAGATGGAGTCCAAAGAGAAACTAG-3＇(如SEQ ID NO6所示)此两段序列分别含有HindIII和NcoI酶切位点，其后分别为目的基因3＇端和5＇端的编码序列，以含有全长目的基因的PBS质粒为模板，进行PCR反应。HindIII和NcoI的酶切位点相应于表达载体质粒PET-28b(+)(Novagen公司提供Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。用HindIII和NcoI分别对扩增序列和质粒PET-28(+)进行酶切并连接。将重组质粒转化入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)plySs，并用IPTG诱导进行表达。表达产物经过超声破菌，再上含6个组氨酸的亲和层析柱(Pharmacia公司提供)，得到了纯化的目的hBex蛋白。经SDS-PAGE电泳，在13.8KD处得到一单一的条带。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。
实施例5hBex蛋白在真核细胞(CHO细胞株)中的表达根据该hBex蛋白相应的基因序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下引物15′-AAGCTTGGGCATAAGGCAAAACTCATCATGA-3＇(如SEQ ID NO5所示)
引物25＇-CCATGGCAGATGGAGTCCAAAGAGAAACTAG-3＇(如SEQ ID NO6所示)此两段序列分别含有HindIII和NcoI酶切位点，其后分别为目的基因3＇端和5＇端的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII、NcoI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明hBex蛋白的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
实施例6人细胞中hBex蛋白的表达方式进行Northern印迹分析，测定人细胞中hBex蛋白表达水平.用BNAzolTM B体系(Biotecx Laboratories，Inc.6023South Loop East，Houston，TX77033)分离总细胞RNA样品。从各具体的人组织分离约10ug的总RNA，在1％琼脂糖凝胶上分离，并且印迹到尼龙滤器上(Sambrook，fritsch和Maniatis，MolecularCloning，Cold Spring HarborPress，(1989)。按照Stratagene Prime-It试剂盒用50ngDNA片段做标记反应。标记的DNA用Select-G-50柱纯化(5Prime-3prime，Inc.5603 Arapahoe Road，Boulder，Co 80303)。然后，滤器用放射标记的全长hBex基因，在65℃下，以1,000,000cpm/ml的速率在0.5M NaPO4、pH7.4和7％SDS中杂交过夜.用0.5XSSC、0.1％SDS在室温下冲洗两次和在60℃冲洗两次后，将滤器与强化荧光屏一起暴露在-70℃下。HBex蛋白的信使RNA富含于脑细胞、肝细胞、脾细胞等细胞中。
实施例7Northern印迹法分析hBex蛋白基因的表达用一步法提取总RNA[Anal.Biochem1987，162，156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。
用20g RNA，在含20mM3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mMEDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt＇s溶液和200μg/ml鲑精DNA。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为图2所示的PCR扩增的hBex编码区序列。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于65℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。
结果表明，hBex蛋白基因在脑组织中高表达，同时，其还特异性地在肝、脾、肾等组织中表达。
实施例8抗hBex蛋白抗体的产生用多肽合成仪(PE-ABI)合成下述hBex特异性的多肽Ser-Lys-Glu-Lys-Leu-Ala-Val-Asn-Ser-Leu-Ser-Met-Glu-Asn-Ala-Asn-Gln-Glu-Asn-Glu(如SEQ ID NO5所示)。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见Avrameas.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与hBex结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ii)发明名称人脑表达的X染色体连锁蛋白及其编码序列(iii)序列数目7(2)SEQID NO1的信息(i)序列特征(A)长度792bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GACTCGTGTC TCGCTACCAG CTCCCCGCTG CCCTGCGCTC GGCGGGCTGG CATCCGGCCC 60GGGGGAAAGC GGACCAGCCC TTCTGCAGGT CTGCGGGGCC AAGTGTCCCG GCGGCGCACC 120TCGTGGCGAG AATCGGGAGA AGGAGGAGAC TACAAGGATA GGCCCAGGAG TAATGGAGTC 180CAAAGAGAAA CTAGCAGTAA ACAGTCTCAG CATGGAAAAT GCCAACCAAG AAAATGAAGA 240AAAGGAGCAA GTTGCTAATA AAGGGGAGCC CTTGGCCCTC CCTTTGGATG CTGGTGAATA 300CTGTGTGCCT AGAGGAAATC GTAGGCGGTT CCGCGTTAGG CAGCCCATCC TGCAGTATAG 360ATGGGATATG ATGCATAGGC TTGGAGAACC ACAGGCAAGG ATGAGAGAAG AGAATATGGA 420AAGGATTGGG GAGGGGGTGA GACAGCTGAT GGAAAAGCTG AGGGAAAAGC AGTTGAGTCA 480TAGTCTGCGG GCAGTCAGCA CTGACCCCCC TCACCATGAC CATCATGATG AGTTTTGCCT 540TATGCCCTGA ATCCTGATGG TTTCCCTAAA GTTATTACGG AAACAGACCC CTGCTTTCGA 600ATTTACATGT TCATGATGTG CCCTTGTTGT AAACCTTTAC CTGTCACTTG TTTACGTGGG 660TCTCCTATTA CCAGCTTCTA ATTGAATATT GTGTTTTTGA ACCAGTCTGT AAGATTTTTG 720TTAGCAGAAG AATTTTACCT ATTGCATGGA AAGATGCTCA TTATAGTGAA GTTAATAAAG 780CACCTTTAAA AA 792(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征
(A)长度125个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Ser Lys Glu Lys Leu Ala Val Asn Ser Leu Ser Met Glu 15Asn Ala Asn Gln Glu Asn Glu Glu Lys Glu Gln Val Ala Asn Lys 30Gly Glu Pro Leu Ala Leu Pro Leu Asp Ala Gly Glu Tyr Cys Val 45Pro Arg Gly Asn Arg Arg Arg Phe Arg Val Arg Gln Pro Ile Leu 60Gln Tyr Arg Trp Asp Met Met His Arg Leu Gly Glu Pro Gln Ala 75Arg Met Arg Glu Glu Asn Met Glu Arg Ile Gly Glu Gly Val Arg 90Gln Leu Met Glu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Leu Ser His Ser Leu 105Arg Ala Val Ser Thr Asp Pro Pro His His Asp His His Asp Glu 120Phe Cys Leu Met Pro 125(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度25碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GACTCGTGTC TCGCTACCAG CTCCC 25(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4TTTTTAAAGG TGCTTTATTA AC 22(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度31碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AAGCTTGGGC ATAAGGCAAA ACTCATCATG A 31(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度31碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CCATGGCAGA TGGAGTCCAA AGAGAAACTA G 31(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Ser Lys Glu Lys Leu Ala Val Asn Ser Leu Ser Met Glu Asn Ala Asn 15Gln Glu Asn Glu 19
权利要求
1.一种分离的hBex多肽，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少72％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID No.1中173-550位的序列；(b)具有SEQ ID No.1中1-792位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有人hBex活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达hBex的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有hBex活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的hBex多肽特异性结合的抗体。
10.一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-780个核苷酸。
11.一种化合物，其特征在于，它选自下组(a)模拟权利要求1所述多肽的活性的化合物，(b)促进权利要求1所述多肽的活性的化合物，(c)拮抗权利要求1所述多肽的活性的化合物，(d)抑制权利要求1所述多肽的表达的化合物。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，它是SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列。
13.一种应用权利要求11所述化合物来调节hBex蛋白在体内、体外活性的方法。
14.一种检测与权利要求1所述的多肽异常表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，其特征在于，包括检测编码所述多肽的核酸序列中的突变。
15.如权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于筛选促进hBex多肽活性的激动剂，或者筛选抑制hBex多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。
16.如权利要求1O所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
17.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一种新的人脑表达的X染色体连锁蛋白(human brain expressed X－linked protein,hBex),编码此多肽的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法,如于胚胎发育不良及获得性和遗传性疾病;各种肿瘤及癌症的发生;听力失聪;X染色体连锁的智力迟钝及无脑回症等。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这种新的人脑表达的X染色体连锁蛋白的多核苷酸的用途。
文档编号C07K14/47GK1297943SQ99124179
公开日2001年6月6日 申请日期1999年11月30日 优先权日1999年11月30日
发明者毛裕民, 谢毅 申请人:上海博容基因开发有限公司