专利名称：石莲花多糖的制作方法
石莲花(Echevaria glsuca)是一种野生或人工栽培的肉质景天科常绿植物，最先发现其提取的混合组分具有高效降血糖功能(中国专利申请号为97100285.1)。经长期动物实验研究与临床发现，其有效组分中富含多糖，即石莲花多糖(Echevaria glaucapolysaccharides)，简称EGP，现就EGP的提取分离，纯化和保肝以及抗动脉硬化(降血脂的功能)，人群实验降低体脂肪(减肥)的效果，阐述如下1、EGP的提取方法现将石莲花的根、茎、叶乃至全株或从石莲花原粉(按中国专利申请号为97100285.1方法提取)中分别用不同的方法提取石莲花多糖(EGP)。1.1实施例1取洗净的鲜石莲花全株1kg，粉碎后，用石油醚(30-60)回流脱脂2h，残渣置于1升无离子水，煮沸0.5h，过滤，残渣继续重复上述操作3次，合并4次滤液，浓缩至小体积，加氯仿(A、R)至分层，沉淀弃蛋白，上层溶液浓缩至小体积，加无水酒精浓度调至95％，沉淀EGP，过滤，沉淀干燥。粗EGP产量2.196g，收率2％。(见附
图1-1)。1.2实施例2取石莲花原粉200g溶于2升无离子水，加热煮沸5分钟，过滤，滤液浓缩至小体积，再用3％的三氯乙酸(V/V)沉淀蛋白，静置后离心，以200mol/L NaoH中和后，透析，浓缩，加放3倍体积乙醇，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得到粗石莲花多糖(EGP)19.6g，为灰棕色粉末。取10g粗EGP溶于100ml无离子水中，进行DEAE-Cellulose柱层析(CI型，90cm×3.0cm)先用水洗脱，再以0.2mol/L NaCL梯度洗脱，水洗脱部分得到3.5g，NaCL洗脱部分得到6.02g，将9.52gEGP再经Sepharose 4B柱层析(50cm×2.0cm)，用0.05mol/L Nacl洗脱，得到纯化的EGP占98g，产率为69.8％。1.3实施例3取60g石莲花原粉，加入无离子水100ml，加热煮沸10分钟，冷却，过滤，保留，滤渣，重复上述操作2次，合并3次滤液浓缩至一定体积用酒精调至70％，沉淀蛋白、蛋白多糖、多糖，过滤，滤液再调至95％的酒精浓度，沉淀粗多糖，过滤，合并沉淀，烤干，得2.196gEGP，收率为10％。(见附图1-2)1.4实施例4
为了日常保健和用药剂量的方便，现按实施例1-3内容中收率关系，鲜石莲花、干石莲花、石莲花原粉、粗EGP、EGP重量关系对照表汇总于后(见表1-1)表1-1 不同季节采摘时，其含水量不同，这里的重量取平均值。1.5实施例5取实施例3提取的粗EGP7mg配以43mg褐藻酸钠和150mg螺旋藻粉制粒后压片(200mg/片)或灌装胶囊(200mg/粒)，每日3片或3粒胶囊作为人群实验药品使用。2、EGP的抗肝炎功能1.1实验材料2.1.1动物昆明小鼠(体重18-22g)北京大学动物学部提供。2.1.2实验试剂四氯化碳(A、R)、市售纯香油，配成5％四氯化碳的香油溶液。2.1.3试验灌胃样品取1粗EGP、EGP各50mg分别加100ml蒸馏水，浓度均为0.5mg/ml，每只小鼠灌胃(PO)0.15mg/0.3ml/日，共灌胃9天。2.2方法与结果2.2.1对四氯化碳所致的小鼠GPT升高的保护作用将小鼠随机分组，对照组给蒸馏水，四氯化碳组和实验组分高低剂量给3实验第3、6、9天注射(ip)5％四氯化碳香油溶液，灌胃9天，第10天断头取血，以常规方法测定谷一丙转氨酶(GPT)。2.2.2实验结果如表2-1所示表2-1
*与5％CCL4组比较从表2-1中可见，CCL4组与对照组比较升高133％，而PO给予粗EGP(64×9、32×9mg/kg×d)加5％CCL4与对照组比较，GPT分别仅升高56％和68％，表明EGP能明显对抗由CCL4引起的肝炎，起到消炎保肝作用。3、EGP抗动脉硬化(降血脂)功能本发明的EGP可明显降低高脂血症大鼠血清游离胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、β-脂蛋白含量，降低高胆固醇血症小鼠血清胆固醇含量，并可防止高胆固醇引起的小鼠高胆固醇血症的形成。高脂血症作为动脉硬化、冠心病的危险因素之一。也是作为衡量动脉硬化的标准。3.1材料与方法3.1.1动物 昆明种小鼠，体重18~25g，北京大学动物学部，雄性。高胆固醇小鼠模型的形成用常规方法。Wistar大鼠，雌雄兼有，体重200~250g。高脂血症大鼠喂以高胆固醇饲料(配方4％胆固醇、10％猪油、0.2％甲基硫氧嘧啶及89％基础饲料)。3.1.2药品与试剂粗EGP及其精品由北京泰达士经贸公司生物化学所提供。洋地黄皂甙(杭州第一制药厂)。肝素、高碘酸钠、4-甲基硫化尿嘧啶均为分析纯，胆固醇(Merck)公司。3.1.3仪器721型分光光度计3.1.4方法用乙醇提取、高铁-硫酸显色法测定血清总胆固醇(TC)含量。用洋地黄皂甙沉淀法测定血清游离胆固醇(FreeCh)及胆固醇(chE)。用正庚烷—异内醇混合液提取法测定血清甘油三酯(TG)。用肝素—锰比浊法测定血清β脂蛋白(β-Lp)。3.2实验结果3.2.1粗EGP与EGP对高胆固醇血症小鼠血清胆固醇含量的影响3.2.1.1 EGP降血脂作用的时效关系取健康雄性小鼠52只，随机分成5组，1组为正常对照组，其余4组在禁食16h后，每鼠一次静脉注射75％蛋黄乳剂0.5ml，以形成高胆固醇血症，其中1组为实验对照组。另外3组为给药组，在给蛋黄乳剂后第13，16，19h分别注射EGP 10mg/kg，高胆固醇血症实验对照组在乳剂注射后第20h，由眶静脉取血，3组给药组分别在注射后1，4，7h取血，然后测定血清TC。如表3-1所示，粗EGP后1h，血清TC已有所降低，4h降TC作用最强，7h作用已减弱。
表3-1 EGP对小鼠血清TG降血脂作用的时效关系
1)P＞0.052)P＜0.05与实验对照组比较3.2.1.2 EGP降血脂作用的量效关系3.2.1.2.1对高胆固醇血症小鼠的治疗作用取健康小鼠47只，随机分成5组，1组为正常对照组，1组为高胆固醇血症实验对照组，其余3组为给药组。禁食16h后静脉注射75％蛋黄乳剂0.5ml/只，16h后高胆固醇血症实验对照组静脉注射生理盐水，每只0.5ml，给药组注射EGP，剂量组注射分别为3，6，10mg/kg。注射后4h，自眶静脉取血，测血清TC。结果(见表3-2)表明EGP需较大剂量(10mg/kg)方可对抗已形成的高胆固醇血症。
表3-2 EGP对小鼠血清TC降血脂作用的量效关系(x±SD)
1)P＞0.053)P＜0.01与实验对照组比较3.2.1.2.2对高胆固醇血症形成的预防作用取健康小鼠72只，随机分成9组，1组高胆固醇血症组为实验对照组，1组为正常对照组，4组EGP组，3组粗EGP组，计9组，每组8只，禁食4h后，高胆固醇血症实验对照注射生理盐水0.5ml/只，给EGP药组注射剂量分别为6，10，14，18mg/kg，给粗EGP注射组剂量分别为6，10，14mg/kg，注射后2h，给药组及高胆固醇血症实验对照组静脉注射75％蛋黄乳剂0.5ml/只，20h后自眶静脉取血，测定血清TC。表3-3指出小剂量的EGP、粗EGP即可对抗高胆固醇血症的形成，其作用强度EGP＞粗EGP。
表3-3 EGP、粗EGP对小鼠高胆固醇血症形成的预防作用
1)P＞0.052)P＜0.053)P＜0.01与实验对照组比较3.2.2 EGP、粗EGP对正常小鼠血清胆固醇含量的影响取健康小鼠31只，随机分成3组，禁食12h后，1组为对照组，其余3组分别注射EGP、粗EGP各10mg/kg，注射后4h自眶静脉取血，测定血清TC。结果(见表3-4)表明10mg/kg EGP、粗EGP均不降低正常小鼠血清TC。
表3-4 EGP与粗EGP对小鼠血清TC含量的影响(x±SD)
1)P＞0.05 与正常对照组比较3.2.3 EGP、粗EGP对高血脂症大鼠血脂含量的影响取健康大鼠43只，随机分成4组。1组正常对照组，1组高脂血症对照组(HI)，其余2组为给药组。正常对照组及高脂血症对照组每天上午注射生理盐水0.6ml/只，其余各给药组注射剂量分别为EGP 20mg/kg、粗EGP 30mg/kg，下午除对照组外，均用高脂肪胆固醇饲料饲养，连续8d。第9天禁食12h后，心脏穿刺取血。测TC、Free Ch、ChE、TG、β-Lp。表3-5表明EGP、粗EGP使进食高脂肪胆固醇饲料大鼠血清中TC、Free Ch、ChE、TG、β-Lp含量明显降低。表3-5 EGP、粗EGP对高血脂症大鼠血清TC、Free Ch、ChE、TG和β-Lp含量的影响(x±SD)
1)P＞0.052)P＜0.053)P＜0.01与III对照组比较3.4 附图简要说明图1是从鲜石莲花生产其粗多糖的工艺流程图2是从石莲花原粉生产其粗多糖的工艺流程图3是人群实验组体脂肪分布4是血糖值与GOT、GPT、γ-GTP关系5是从体脂肪下降观察服用EGP的效果图6是从体脂肪观察服用EGP降GOT的效果图7是从体脂肪观察服用EGP降GPT的效果图8是从体脂肪观察服用EGP降γ-GTP的效果图9是从饮酒量水平观察服用EGP降γ-GTP的效果图10是人群实验对象每周饮酒水平分布11是人群实验对象的动脉硬化分布12是从动脉硬化症观察服用EGP降体脂肪的效果图13是从动脉硬化观察服用EGP降低γ-GTP的效果图14是从动脉硬化观察服用EGP降低TC的效果3.5实验结果讨论根据损伤反应学说，动脉硬化首先是高血脂使动脉内膜受到损伤而引起。动脉硬化症的发生和发展，随血脂含量的增加而危险性增大，血清中的TC、β-Lp和TG是冠心病的促进因子。本发明的实验表明，EGP、粗EGP可有效地阻止小鼠实验性高胆固醇血症的形成，并且可使进食高脂饲料大鼠血清TC、Tree Ch、ChE、TG、β-Lp含量较对照组明显降低，本实验证实了EGP有肯定抗动脉硬化、降血脂效果。4、EGP人群保肝、抗动脉硬化、降体脂肪的减肥实验4.1实验对象和方法4.1.1人群实验组其对象为40岁至60岁(平均年龄52岁)的健康成人男性42名，女性2名，共44例。4.1.2实验方法用现代医学检查肝功能与体脂肪每天饭前或饭后服用1片，EGP 3个月，每日3片，每月医生问诊1次，见表4-1指标检验生化指标。谷氨酸草酰酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酸(GPT)、乌苷三磷酸酶(γ-GTP)和体脂肪。在服用EGP片前后比较上述肝功能与体脂肪的变化。
表4-1 服用EGP前后人群实验对象的生化指标变化一览表 4.1.3判断标准肝功能(GOT、GPT、γ-GTP)指标除正常外，均为异常，体脂肪除正常外，对瘦身、轻度肥胖、肥胖、超肥胖均属超标。4.1.4生化指标处理方法采用统计学处理，P＜0.05具有显著意义。4.2实验结果4.2.1服用EGP前的状况4.2.1.1人群实验组的具体对象的体脂肪为瘦身型占16％；正常型占18％；轻度肥胖型占43％；肥胖型占14％；超肥胖型占9％；肥胖型居多。见图3。4.2.1. 2生化指标主要是指肝功能与体脂肪值正常、异常。见表4-1。4.2.2服用EGP后的状况4.2.2.1从血糖值变化观察其效果从图4血糖值跟GOT、GPT、γ-GTP的关系可见，高血糖组和正常血糖组随着GOT、GPT、γ-GTP的降低而降低。4.2.2.2从体脂肪值的变化观察服用EGP的效果现将肥胖、超肥胖(体脂肪在30％以上)组、轻度肥胖组(体脂肪在25％-29％)、正常和瘦身型组(体脂肪在24％以下)分成3个组，观察体脂肪、GOT、GPT、γ-GTP的变化。4.2.2.2.1、3个组体脂肪值都下降，但在肥胖度亢进时下降的幅度有增大的倾向，从体脂肪下降观察服用EGP的效果(见图5)。4.2.2.2.2、对GOT来说，轻度肥胖组可见变化略有上升，其它组都降低、以肥胖、超肥胖组降低幅度最大，从体脂肪下降观察服用EGP降GOT的效果(见图6)。4.2.2.2.3、GPT 3组都降低，但降低幅度从大到小依次为肥胖、超肥胖组、正常与瘦身型组、轻度肥胖型组，从体脂肪观察服用EGP降GPT的效果(见图7)。4.2.2.2.4、对γ-GTP来说3组都下降，但降低幅度从大到小依次排列如下肥胖、超肥胖型组、正常与瘦身型组，轻度肥胖组，从体脂肪观察服用EGP降γ-GTP的效果(见图8)。
体脂肪降低幅度大的组(相对值降低在10％以上)，同样可观察到GOT、GPT、γ-GTP的变化，对肥胖、超肥胖组下降的倾向几乎是相同的，尤其是γ-GTP数值大幅度降低。见图6、7、8所示。4.2.2.3从饮酒量水平观察服用EGP的效果4.2.2.3.1、普通饮酒组每周饮10小瓶以下(二锅头白酒180ml/小瓶)的人群。4.2.2.3.2、多饮酒组每周超过10小瓶的饮酒人群(见图9，从饮酒量水平观察服用EGP降γ-GTP的效果)。
从服用EGP片的前后γ-GTP值的变化如图9可见，每周喝10小瓶以下的普通饮酒组的γ-GTP的平均值服用前60.4，而服用后γ-GTP下降至56.4。而每周喝10小瓶以上的多饮酒组，服用前γ-GTP平均值为208.5，服用后降至138.9，这就证明EGP片显著地改善了肝功能。4.2.2.3.3、饮酒人群分布图(见图10，人群实验对象每周饮酒水平分布图)。4.2.2.4从动脉硬化观察服用EGP的效果见表4-1，从动脉硬化观察EGP双向调节血糖的效果(见图11，人群实验对象动脉硬化分布图)，将人群实验对象动脉硬化分成无、有倾向、有、亢进四个组、动脉硬化与血糖值、体脂肪、γ-GTP、TC乃至TG有关。4.2.2.4.1血糖值随动脉硬化变化的状况无、有倾向、有动脉硬化3个组降低可见，尤以有动脉硬化组、统计值P＜0.05具有显著意义。从动脉硬化与亢进组可见，血糖值反而升高(见图12，从动脉硬化症观察服用EGP降血糖的效果)。4.2.2.4.2体脂肪随无动脉硬化、有动脉硬化倾向，有动脉硬化3组变化而大幅降低，其P＜0.05。动脉硬化亢进组未见体脂肪变化反而上升。(见图13，从动脉硬化症观察服用EGP服用降体脂肪的效果)。4.2.2.4.3观察无动脉硬化、有动脉硬化倾向、有动脉硬化以及亢进等4组降低γ-GTP、特别对有动脉硬化具有显著的意义，其P＜0.05，(见图14，从动脉硬化观察服用EGP降低γ-GTP的效果)。4.2.2.4从TC来看，对无动脉硬化、有动脉硬化倾向、有动脉硬化及亢进4组具有对抗倾向，尤其有动脉硬化具有显著的意义P＜0.05，(见图15，从动脉硬化观察服用可见EGP降TC的效果)。4.3结果讨论综上所述，随着体脂肪降低，糖耐量趋于正常化，同时改善了胰岛素的感受性，由于降低了肝功能GOT、GPT、γ-GTP的指标，使肝功能转为正常，服用EGP片后血糖值、肝功能、动脉硬化、体脂肪均有明显的改善，因此EGP具有预防内脏胖肥、动脉硬化、脂肪肝的效果。
权利要求
1.本发明是一种新近发现的石莲花多糖(EGP)的最新功效，主要具有保肝、抗动脉粥样硬化，减肥等功能。
2.根据权利要求1所述，从提取液中沉淀的石莲花多糖(EGP)其中含蛋白多糖，将沉淀多糖的酒精浓度调为70-95％。
3.根据权利要求1所述，加热煮沸温度90-100℃，不低于90℃。
4.根据权利要求3述，加热煮沸不仅起破坏细胞壁的作用，而且还可增大EGP或蛋白多糖的溶解度。
5.根据权利要求1所述，EGP与粗EGP(均含量蛋白多糖)在动物实验中它们之间无显著差异。
6.本发明的EGP或粗EGP均具有保肝、抗动脉粥样硬化、减肥(减体脂肪)攻效，均具有非常显著的意义，其P＜0.01。
7.本发明，对食品、保健食品以及药品临床推荐EGP在7～30mg/日。
全文摘要
本发明涉及保健食品、医药品领域的功能型食品或药品,还涉及到石莲花多糖(EGP)的提取、分离、纯化的操作技术,EGP不仅具有原始石莲花提取物的降血糖功效,而且本发明还发现了经提取分离或纯化的EGP都具有保肝、抗动脉硬化、减肥等功效。
文档编号C08B37/00GK1355254SQ0013366
公开日2002年6月26日 申请日期2000年12月1日 优先权日2000年12月1日
发明者丁庆 申请人:丁庆