低成本黄胞胶的生产方法

专利名称:低成本黄胞胶的生产方法
一种用微生物发酵多糖胶地方法，属于工业微生物领域。
黄胞胶又称黄原胶(Xanthan gum)，是一种用微生物发酵产生的多糖胶。60年代美国开始投产，至今约有十个国家及地区进行生产。国内烟台味精厂1987年开始少量生产，用乙醇提取黄胞胶，将提取产生的废乙醇经蒸馏回收，能耗大，每生产1吨黄胞胶最后因不能回收而损耗的乙醇约为一吨，其生产成本约为15000元/吨干胶。而别的研究单位生产1吨黄胞胶要耗7-10吨乙醇，故不能投产。
自60年代黄胞胶在美国投产以来，许多厂家采纳黄单胞菌属(Xanthomonas)中不同的菌种或菌株及不同的方法进行生产，出现了各自不尽相同的黄胞胶系列产品，产品都有共同的特性，也有些独特之处及用途。例如有低丙酮酸含量黄胞胶的生产(EP.Pat.66961 1982);低钙黄胞胶的生产(US.Pat.4377637 1983);高粘度黄胞胶的生产(J.Pat.52165798 1983);高丙酮酸黄胞胶的生产(US.Pat.4394447 1983);耐热黄胞胶的生产(US.Pat.4485020 1984)等等。
现有的黄胞胶提取技术，多为用有机溶剂进行提取，黄胞胶能与甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等有机溶剂形成均匀溶胶，但有机溶剂在混合液中浓度超过50%时，黄胞胶会形成纤维状沉淀析出。如美国专利US-4316012，其提取方法，就是在发酵液中加入一种有机溶剂沉淀胶，再经离心、分离、过滤、烘干制成黄胞胶产品，另外，黄胞胶溶液能与钙盐如CaCl2、Ca(OH)2作用，在有机溶剂中形成黄胞胶-氢氧化钙复合物的凝胶沉淀，如欧洲专利EP-0068706，就是用有机溶剂和二价离子沉降黄胞胶。也有采用季胺盐沉降黄胞胶，即黄胞胶与季胺盐结合物生成絮凝沉淀来分离黄胞胶。国外还有采用喷雾干燥、闪蒸、减压、浓缩、超滤等方法提取黄胞胶。
目前国内外提取黄胞胶均采用直接干燥和有机溶剂沉淀提取两类方法，前者即为喷雾干燥、闪蒸、减压浓缩等法，能耗太大，在我国行不通;后者离不开价格昂贵的有机溶剂，废溶剂的回收也很耗能。本发明是筛选了一种黄单胞杆菌Xanthomonas sp.8420，其发酵液能用酸絮凝沉降，从而达到减少物耗、能耗，降低成本、设备少、简便易行的目的。
本发明是利用一种黄单胞杆菌发酵，制备黄单胞菌多糖胶的生产方法，其特征是，培养液经黄单胞杆菌Xanthomonas sp.8420发酵，发酵液加酸，沉淀提取黄胞胶。在发酵液中加入的酸，可用无机酸或有机酸，pH值调到3以下，絮凝沉淀。发酵液除了加酸外，还可辅以添加其它盐类，如钙盐、氯化钾等助凝物沉淀、提取黄胞胶。黄胞胶的生产方法如下
一、菌种
黄单胞菌Xanthomonas sp.8420于1984年筛选所得，该菌种已保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号0131。该菌特征为杆状，革兰氏阴性，端生一根鞭毛，在肉汁胨培养基上产生黄色非水溶性色素，菌落园形，菌苔不扩张、黄色。氧化葡萄糖，所产生的色素在石油醚中有418、437和463毫微米吸收峰。
本发明的黄单胞杆菌Xanthomonas sp.8420可应用全无机氮源的培养液生产黄胞胶。
二、培养基
1、斜面菌种培养基(配方来源于US.Pat.4394447.1983.7.9)
葡萄糖 1.2% (NH4)2HPO40.15%
酵母膏 0.15% K2HPO40.25%
蛋白胨 0.25% MgSO4·7H2O 0.01%
琼脂 1.7% pH7
15磅灭菌30分钟。
2、一级菌种摇瓶用培养基
同上，无琼脂。
3、二级菌种(或种子罐)培养液

0.2% MgSO4·7H2O 0.05%

0.25% FeSO40.001%
糖(蔗糖或葡萄糖) 1% pH 7.5
15磅灭菌3分钟，若使用葡萄糖、葡萄糖以8磅20分钟另行灭菌，然后加入。
4、生产培养液
培养液配方同上，但糖可用蔗糖、葡萄糖或淀粉糖化液。
发酵期间补料两次，每次补料，包括占全部发酵液1.5%的糖和0.05%的植物油，整个发酵周期中，培养液中投入总糖量为4%。蔗糖灭菌为15磅30分钟，葡萄糖灭菌为8磅20分钟。
培养液主要氮源来自无机态的NaNO3或KNO3、NH4NO3、尿素或再补添酵母膏、蛋白胨、鱼粉等，或补添其它各种微量元素者。
三、发酵工艺
1、过程
斜面菌种 (28℃±2℃)/(2－3) 一级菌种振荡培养 (28℃±2℃)/(24h.) 种子罐 (28℃±2℃)/(24h.) 生产罐
(第一次补料24－30h.)/( ↓) (第二次补料36－42h.)/(↓)
(28-30℃ )/(60h.) 放罐
试管斜面菌种于28℃培养2-3天。一级菌种使用500ml三角瓶，每瓶装150ml培养基，每瓶用一支试管斜面菌种接种，28℃摇床培养24小时(含菌量达8亿/ml以上)，种子罐接种量为2-4%，吹气量为0.5-1体积/分，罐压1kg/cm2，温度28-30℃。生产罐接种量为7-10%，吹气量0.8-1体积/分，罐压1kg/cm2罐温28±2℃，搅拌速度100-200rpm(1-24小时搅拌速度为100rpm，往后递增，36小时后，搅拌速度200rpm)其间补料两次，当培养料中残糖降至0.2%时补料，一般在24-30小时和36-42小时补料各一次。
2、设备要求
(1)摇床往返式或旋转式均可用，往返式摇床速度为100次/分以上，旋转式摇床速度170转/分以上。
(2)发酵罐此为高粘度的发酵液，罐高与罐直径比宜大，最理想为5∶1，若采用原有旧设备以不低于2.5∶1为宜。吹气量不低于1体积/分，搅拌速度200rpm以上。根据罐高，其搅拌浆应为三至六组，翼应具有涡孔，使之适合于高粘度液体的搅拌。同时发酵罐还应有相应的补料设备。
四、提炼工艺
发酵60小时糖含量降至0.2%以下，即可放罐。放罐后发酵液可用金属或陶瓷缸槽装盛，慢慢加入1∶20的盐酸，并以6-10rpm的速度搅拌，至发酵液pH下降至2.6时，胶和水分离，可用机械脱水。(该法所产生的发酵液，在pH2.6时产生胶水分离现象，但这是可逆的变化，应用中干胶能吸水复原，粘度基本不变)。机械脱水可采用离心机或板框压滤，可去除6/7至7/8的水份再将脱过水的胶于55-65℃烘干，粉碎，过0.25mm筛，含水量不得超过7%，用塑料袋包装封口。发酵60小时，每100ml发酵液可产干胶2.87g，提取率为89.9%，故每100ml发酵液可得干胶2.58g。碳源转化率为64.5%。
五、理化性质
本发明黄胞胶产品的理化性质
1、溶液粘度0.5%水溶液粘度为3200厘泊。
2、丙酮酸含量3.1%
3、盐类对粘度的影响
在5%至10%Na2CO3溶液中粘度不变。25℃，在10%NaCl或在KCl溶液中粘度降低16%。
4、加热对粘度的影响
从25℃加热至95℃有增粘作用。在10%KCl中加热至95℃粘度变化不大。
5、pH对粘度的影响
在pH3.5至11范围内粘度变化很小。pH11以上有轻微增粘用。pH2.6以下时产生絮凝作用，利用该特性可加稀酸提取。
6、触变性
有良好的触变性，1%水溶液3号钻子转速从每分钟6次增至12、30、60次时，其粘度则从11，800厘泊降至6800、3320、1990厘泊
本发明产品和美国Kelco公司生产的黄胞胶作比较，相同的特征与不同的特征如下(1)两者粘度接近，用旋转粘度计，25℃，4号转子30rpm测定，其0.5%水溶液的粘度为3200厘泊。
(2)在盐溶液中的稳定性基本一致。
(3)本发明产品对高温的抗性稍差，在10%KCl存在时，溶液加热至95℃粘度不变，100℃时冻化，而美国产品能耐120℃。
(4)丙酮酸含量属于美国商业产品合格范围。
(5)美国产品在pH1-11范围内，粘度仅有轻微变化，而本发明产品，在pH3-11范围内，粘度仅有轻微变化，pH2.6时产生絮凝反应。
(6)触变性能两者相近。
六、测定方法
1、粘度测定
用上海天平仪器厂NDJ-1旋转粘度计，25℃，溶液配制24小时后测定。
2、产胶量测定
称10g发酵液稀释成50ml，搅拌均匀，20，000rpm离心30分钟，上清液用120ml无水乙醇沉淀黄胞胶，沉淀用无水乙醇洗涤两次，60℃烘干，用0.01%天平称重。
3、残糖测定
100g发酵液用15ml1∶20的盐酸(HCl)沉淀，取滤液用NaOH中和至pH7，再用斐林试剂法测定。
4、菌种鉴定
细菌分类基础，王大耜编，科学出版社1977年
5、水份测定
用0.01%天平称1g样品于60℃烘干，置干燥器中，称重，计算水份百分比含量。
6、丙酮酸含量测定0.05%的黄胞胶水溶液，用丙酮酸2，4-二硝基苯腙法比色测定。
7、细菌数检测
(1)平板计数法以培养基1浇平皿，28±2℃处培养10天计数。
(2)比浊法用培养基3培养菌液36小时，再加无菌水稀释成含原菌液100%，90%，80%，70%，60%，50%，40%的各种稀释度，一方面用平板计数法测数，并用同一系列样品比浊，绘出表示菌数与浊度相关的标准曲线。在测定接种液菌数时，经测浊度，便可从曲线上查出菌数。
8、灰份测定 用0.01%天平称取10g样品置于550℃马福炉中燃烧1小时，称重，计算灰份百分比。
七、黄胞胶的用途
黄胞胶用途很广，适用于石油工业作泥浆添加剂;用于食品工业作乳化剂、增稠剂、悬浮剂、助泡剂等;还用于纺织印染、涂料、陶瓷上釉、胶体炸药、防火材料、医药及农药等工业。黄胞胶的应用可覆盖20多个行业，几十种产品，使这些行业的工艺、产品品质大为提高。我国每年进口黄胞胶80吨，由于价昂(13000$/吨)，只供中外合资的海滨油田钻井使用。据估计2000年左右国内黄胞胶的需求量至少在5000-10000吨左右。其中最大市场为石油部门，若每年1/4的油井采用黄胞胶为泥浆处理剂，就需3500-5000吨。黄胞胶有很好的流变性，并且增稠、抗盐、降失水性能好，有明显的提高产油量和防止井喷的作用。
按本发明方法，实验室生产的黄胞胶样品已三次送往华北油田测试，认为具有水溶性好、加量小、降低泥浆喷嘴粘度明显、剪切稀释性能强、降失水等优良性能。认为这是当前最优的适合于聚合物泥浆的一种新处理剂。
八、注意事项
1、发酵罐高径比宜大，若可能最好为5∶1。
2、根据发酵罐的高径比，罐中搅拌桨应为3-6组。
3、搅拌桨翼数目上层可为3翼，下层应为6翼，翼中应有孔，以适合高粘度液体搅拌。
4、生产罐发酵时，前24小时搅拌速度可以为100rpm，随着胶的产生，搅拌速度增加36小时后应增至200rpm以上。
5、生产罐接种量应为7-10%，过小易污染或使胶产量下降。
6、吹气量为0.8-1体积/分，或可达1.5体积/分。
7、絮凝时，盐酸浓度以1∶20(HCl∶H2O)为宜，浓度过大易使胶变性，浓度过小，不易絮凝并排污量增大。
8、絮凝后，固状物和液体很容易分开，最简单易行的方法是用机械压榨，根据工厂具有的设备，若有工业离心机、板框过滤也可应用。
9、烘房温度宜在55-65℃之间。
10、干燥产品粉碎后应过0.25mm筛，并密封防潮，水份应在7%以下。
现有的黄胞胶生产方法都是采用有机溶剂(或有机化合物)提取、或直接干燥。本发明筛选了特殊的菌株，该菌所产的多糖胶，在pH2.6以下的水溶液中能产生絮凝作用，故只需用酸如稀盐酸便可使胶絮凝沉降，这在黄胞胶提取工艺中，作出了重大改进。同现有技术相比，本发明具有如下优点和积极的效果。
1、成本低国内现有技术生产的黄胞胶成本为15000元/吨，本发明生产的黄胞胶成本为6000-7000元/吨。
2、能耗低现有技术每提取一吨黄胞胶要使用40吨以上酒精，对废有机溶剂(酒精)进行回收，要消耗大量能源，本发明对废酸不必回收，能耗大大减少。
3、物耗省国内现有技术生产黄胞胶，因有机溶剂不可能全部回收，每吨产品消耗有机溶剂(如酒精)一吨以上，本发明生产的黄胞胶每吨产品只需消耗盐酸0.25吨。
4、设备少。现有技术除需要相应的设备外，还要增加废有机溶剂回收车间。本发明设备要求低，有拌料缸、压榨机或工业离心机即可，一般味精厂、生化制药厂也均有条件生产。
本发明实施例如下
实施例14.5升摇床发酵
1、斜面菌种培养同前培养基1。菌种试管规格为12×150mm，盛培养基5ml，接种后28-30℃恒温箱内培养2-3天。
2、二级菌种培养培养液配方为NaNO30.2% MgSO4·7H2O 0.05% K2HPO40.25% FeSO40.001% 糖(蔗糖或葡萄糖)1% pH7.5 15磅灭菌30分钟，若使用葡萄糖，葡萄糖以8磅20分钟另行灭菌。用500ml三角瓶，每瓶装培养液150ml，共3瓶，用上述培养斜面菌种接种，1支菌种接种1瓶，在转速为170rpm，旋转式摇床上28-30℃培养24小时，菌数达8亿/ml以上即可作种子。
3、摇瓶发酵产胶培养液配方同上。用500ml三角瓶每瓶装培养液150ml，共30瓶，用上述二级菌种接种，每瓶接种量为15ml，在转速为170rpm的摇床上，28-30℃培养60小时，培养期间，第24-30小时进行第一次补料，每瓶添加45%的糖液5ml，第36-42小时进行第二次补料，每瓶添加45%的糖液5ml。补料时间应根据发酵液残糖量的测定，残糖量在0.2%以下，即应补料。培养液中投入总糖量为4%，发酵60小时左右，残糖量再度降至0.2%以下时，即可终止发酵。
4、提取黄胞胶
将发酵液倒入塑料、玻璃或搪瓷容皿中，缓缓注入1∶20的稀盐酸0.5升用粗玻棒慢慢搅拌至pH降至2.6以下，此时发酵液中的胶进行絮凝，10分钟左右可完成絮凝沉降，静止30-60分钟，用1mm尼龙筛或尼龙布过滤，使用筛可用重力压挤，使用尼龙布则可用双手挤压，此法可除去发酵液中6/7-7/8的水份。
5、成品的制取
将上述挤干的胶团撕散，置55-65℃烘箱干烘干，用小型粉碎机粉碎，过0.25mm筛，贮于玻瓶或塑料袋中。
实施例20.1吨发酵罐发酵
1、斜面菌种培养菌种试管规格为15×200mm，盛培养基8ml，其它同例1。
2、二级菌种培养培养液配方为NaNO30.2% MgSO4·7H2O 0.05% K2HPO40.25% FeSO40.001% 糖(蔗糖或葡萄糖)1% pH7.5
15磅灭菌30分钟，若使用葡萄糖，葡萄糖以8磅20分钟另行灭菌。1000ml三角瓶30个，每瓶装培养液250ml，用上述培养斜面菌种接种，1支菌种接种1瓶，在速率为100次往返式摇床上，28-30℃培养24小时，菌数达8亿/ml以上即可用作种子。
3、发酵罐生产胶培养液配方同上。经无菌操作将上述二级菌种培养液合并，全部接入发酵罐，发酵罐投料0.08吨，罐温28-30℃，培养期间两次补料，第一次在24-30小时，第二次在36-42小时，补料期间均根据发酵液残糖量的测定而定，残糖量降至0.2%以下即应补料。每次加入2700ml45%的灭菌糖溶液和0.04公斤植物油的混合液，培养液中投入总糖量为4%。发酵60小时左右，残糖量再度降至0.2%以下时，即可终止发酵。
4、提取黄胞胶将发酵液倒入塑料、搪瓷或不锈钢槽内，最好为配有搅拌浆的拌料桶，缓缓注入1∶20的稀盐酸10公斤，以每分钟6-10转的速度缓缓搅拌，充分絮凝后，静止60分钟，用工业离心机1000转/分的速度脱水，或压榨机脱水。可除去发酵液中6/7-7/8的水份。
5、成品制取将上述脱水的胶，置55-65℃烘房中烘干，用粉碎机粉碎，过0.25mm筛，包装防潮。
实施例320吨发酵罐发酵
1、斜面菌种培养同例2。
2、茄瓶菌种培养培养基1(培养基配方同上)。每瓶装培养基50ml，共50瓶，接种后培养28-30℃，2-3天。
3、种子罐培养培养液配方为NaNO30.2% MgSO4·7H2O 0.05% K2HPO40.25% FeSO40.001% 糖(蔗糖或葡萄糖)1% pH7.5
15磅灭菌30分钟，若使用葡萄糖，葡萄糖以8磅20分钟另行灭菌。投料1.6吨，用灭菌的培养液5000ml将茄瓶中菌苔洗下，一次接入种子罐，罐温28-30℃，吹气量0.5体积/分，搅拌速度100-150rpm，培养24小时。菌数达8亿/ml以上即可用作种子。
4、大罐发酵培养液配方同上。20吨发酵罐，投料14.4吨，将种子罐的1.6吨种子液一次接入，每次残糖量降至0.2%时补料。补料包括540公斤45%的糖溶液和9公斤植物油，共2次，第一次约在第24-30小时间，第二次约在第36-42小时间，培养液中投入的总糖量为4%。罐温28-30℃，在1-24小时期间吹气量为0.8体积/分，搅拌速度100rpm，往后递增，36小时后，吹气量达1体积/分，搅拌速度200rpm，罐压1kg/cm2，罐高与罐直径比最理想为5∶1，搅拌浆为6组，浆翼上有涡孔。发酵60小时后，残糖降至0.2%以下时，发酵完成。
5、成品制取同例2。
参考文献
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权利要求
1、一种黄胞胶的生产方法，由培养液经黄单胞杆菌发酵后提取黄胞胶，本发明的特征是培养液经黄单胞杆菌发酵，发酵液加酸沉淀提取黄胞胶。
2、根据权利要求
1所述的生产方法，其特征是所指的黄单胞杆菌是Xanthomonas sp.8420，可应用全无机氮源培养液生产黄胞胶。
3、根据权利要求
1所述的生产方法，其特征是生产培养液配方为NaNO30.2% MgSO4·7H2O 0.05% K2HPO40.25% FeSO40.001%糖(蔗糖或葡萄糖)4% pH7.5
4、根据权利要求
3所述的生产方法，其特征是培养液主要氮源来自无机态的NaNO3或KNO3、NH4NO3、尿素，或再补添酵母膏、蛋白胨、鱼粉等，或补添其它各种微量元素者。
5、根据权利要求
1所述的生产方法，其特征是酸可用无机酸或有机酸，pH值调到3以下，絮凝沉淀，提取黄胞胶。
6、根据权利要求
1所述的生产方法，其特征是发酵液加酸外还可辅以添加其它盐类，如钙盐、氯化钾等助凝物沉淀提取黄胞胶。
专利摘要
本发明是利用微生物发酵多糖胶及其提取方法，属于工业微生物领域。现有黄胞胶的生产方法，采用有机溶剂或有机物沉淀或直接干燥提取黄胞胶。这种方法，提取工艺复杂，耗能大，设备多，成本高。本发明筛选了一种黄单胞杆菌，对培养液进行发酵，其发酵液可加酸使胶絮凝沉降，从而提取黄胞胶。这种方法，提取工艺简单，能耗省，设备少，成本低。
文档编号C12P19/04GK87106960SQ87106960
公开日1988年4月27日 申请日期1987年10月21日
发明者程桂荪, 刘小秧 申请人:中国农业科学院土壤肥料研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan