专利名称：键合环糊精类化合物的高效液相色谱有机相整体柱及其制备方法
技术领域：
本发明提供了键合环糊精类化合物的高效液相色谱有机相整体柱的制备。整体柱基质为多孔的体型的甲基丙烯酸缩水甘油酯-亚乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。其特征在于将环糊精或其衍生物键合到整体柱基质上，可以获得用于小分子分离和手性拆分的高效液相色谱有机整体柱。
背景技术：
整体柱(monolithic column)又称整体固定相(monolithic stationary phase)、棒柱(rod)、连续床(continuous bed)等，是在柱管内原位聚合或固定化了的连续整体多孔结构，可根据需要对整体材料的表面作相应的衍生化，是一种新型的在管柱内以原位(in situ)聚合的方式形成的用于分离分析或作为反应器的多孔介质。用于高效液相色谱的整体柱材料同样包括无机和有机聚合物两类。前者主要用溶胶-凝胶法制备；后者目前主要分为以下几类聚丙烯酰胺类，聚甲基丙烯酸酯类和聚苯乙烯类。
文献(Liao J L，Zhang R，Hjertén S.J.Chromatogr.，1991，58621-26；ZengC M，Liao J L，Nakazato K，et al.J.Chromatogr.，1996，753227-234)报道聚丙烯酰胺整体柱的水相聚合方法。另有文献报道(Xie S F，Svec F，Fréchet J MJ.J.Chromatogr.A，1997，77565-72；Xie S F，Svec F，Fréchet J M J.J.Polym.Sci.A，1997，351013-1021)有机相聚合制备聚丙烯酰胺整体柱。这类整体柱的特点是有着良好的生物兼容性，适合分离生物大分子，如蛋白、核酸及多糖。
关于聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-亚乙基二甲基丙烯酸酯)整体柱的文献为(Svec F，Fréchet J M J.Anal.Chem.，1992，64820-822；Svec F，Fréchet J MJ.J.Chromatogr.A，1995，70289-93)。对于聚合物中的环氧基团，作者采用了两种衍化方式1.泵入0.5mol/mL硫酸水溶液，水浴60℃反应3h，这样得到含二醇官能团的多孔聚合物。2.注入2mL二乙胺，加热反应，得到含1-(N，N-二乙基胺)-2-羟基丙基官能团的离子交换色谱柱可分离蛋白。
关于聚(苯乙烯-二乙烯基苯)整体柱，现有报道(Oberacher H，Parson W，Muhlmann R.Anal.Chem.，2001，735109-5115；Premstaller A，Oberacher H，Huber C G.Anal.Chem.，2000，724386-4393；Moore R E，Licklider L，SchumannD，et al.Anal.Chem.，1998，704879-4884)多为分析蛋白质或核酸(单链和双链)的。Fréchet小组报道(Petro M，Svec F，Gitsov I，et al.Anal.Chem.，1996，68315-321；Petro M，Svec F，Fréchet J M J.J.Chromatogr.A，1996，75259-66；Wang Q C，Svec F，Fréchet J M J.Anal.Chem.，1993，652243-2248)用所制的聚苯乙烯整体柱发展了在柱的沉淀-再溶色谱(“On-Column”Precipitation-Redissolution Chromatography)，并分离了苯乙烯的寡聚物和高聚物。
目前获得手性拆分整体柱的方法主要是原位聚合法合成的另外一类分子印迹型的聚合物整体柱(Matsui J，Kato T，Takeuchi T，et al.Anal.Chem.，1993，652223-2224；黄晓冬(Huang X D)邹汉法(Zhou H F)毛希琴(Mao X Q).色谱(Chinese Journal of Chromatography)，2002，20436-438)。本发明使用直接在基质上键合手性选择剂的方法，所获得的整体柱，具有更广的应用范围，可用于各种小分子分离、多种手性化合物的拆分分离、以及生物大分子分离。
发明内容
本发明的要解决的问题在于提供了键合环糊精类化合物的的高效液相色谱有机相整体柱及其制备方法。这种整体柱上键合有环糊精或其衍生物，可以在高效液相色谱中使用。
本发明提供了一种键合环糊精类化合物的的高效液相色谱有机相整体柱，这种整体柱上键合有环糊精或其衍生物，可以在高效液相色谱中使用。所述的环糊精或其衍生物推荐在被键合前有羟基存在，该羟基可以是未被取代的羟基，也可以是取代基团上的羟基。所述的取代基团推荐为C1～C6的烷基、羟烷基(其中烷基为C1～C6的烷基或烷基醚)。所述环糊精衍生物可以是羟丙基β-环糊精、2，6-二甲基β-CD、全甲基化β-CD、部分甲基化β-CD、羟乙基β-CD、2，3-二氧乙酰β-CD、1-(1-萘基)乙基氨甲酰β-CD、磺化β-CD、磺丁基β-CD、磺乙基β-CD、羧甲基β-CD、羧乙基β-CD、6A-甲胺基β-CD、6A，6D-二甲胺基β-CD、以及β-CD聚合物；所述的β-CD代表β-环糊精。所述的环糊精或其衍生物进一步推荐为β-CD(β-环糊精)、羟乙基β-环糊精或HP-β-CD(β-环糊精羟丙基醚，又称羟丙基β-环糊精)。所述的环糊精或其衍生物更进一步推荐为β-CD或HP-β-CD。所述的整体柱基质推荐为多孔的体型的甲基丙烯酸缩水甘油酯-亚乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。
本发明提供了上述高效液相色谱有机相整体柱的制备方法，该方法是将所述的环糊精或其衍生物通过柱上衍生化的方式键合到整体柱基质上。即先制备出整体柱基质，再使衍生反应混合物通过基质与其发生反应而得到。
其中所述的整体柱基质推荐由甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)与亚乙基二甲基丙烯酸酯(EDM4)在致孔剂十二醇和环己醇的存在下，用偶氮二异丁腈(AIBN)引发聚合得到。
其中GMA为单体，EDMA为交联剂，十二醇和环己醇作为致孔剂，AIBN作为引发剂。GMA、EDMA、十二醇、环己醇至少为国产分析纯，使用之前推荐经过减压蒸馏；AIBN推荐为分析纯，使用之前推荐经过重结晶。推荐的聚合用混合物的组成及配比为GMA∶EDMA＝2∶3-3∶2(质量比)，十二醇∶环己醇＝9∶1-7∶3(质量比)，单体和交联剂∶致孔剂＝1∶3-1∶1(质量比)，AIBN为单体和交联剂的0.5-2％(质量百分比)。推荐在混合均匀后通氦气15min后使用。推荐每次都现配现用。推荐将聚合用混合物按比例混合之后灌入管中，两端封住，垂直放于水浴中进行聚合反应。聚合反应条件推荐如下聚合温度55-60℃，优选值为57℃；反应时间10-48h。
聚合完毕后将制好的整体基质柱装入柱套(所述的柱套例如Z-MODULETMRadial Compression Separation System，购自Waters公司，Waters Corporation，MA01757，USA)，推荐利用乙醇，推荐流速·0.5mL/min冲洗2-3h，将未反应掉的单体、交联剂以及致孔剂完全冲洗干净。之后，推荐用ACN为流动相，流速推荐为1mL/min，推荐254nm检测，推荐用联苯、萘和苯甲酸乙酯作为小分子样品，对整体柱基质的柱效作初步的评价，推荐选择柱效在400NTP/10cm以上的基体柱做进一步的衍生化实验。
衍生化试剂配制方法推荐为β-CD或HP-β-CD溶于DMSO/ACN(体积比为2∶1-1∶3，优选1∶1)混合溶液中，其中β-CD或HP-β-CD和DMSO/ACN的用量比推荐为3-15克/100毫升，加入BF3·Et2O(BF3的含量推荐为46.8-47.8％)，其中BF3·Et2O的用量推荐约1-10％(体积百分比)，优选3.5％。将衍生化试剂利用HPLC泵注入整体基质柱中，室温下的实现循环在柱衍生化。推荐反应48h后，利用HPLC泵将相同体积比的DMSO/ACN混合溶液注入整体柱中，将可能的衍生化产生的物质和未反应的衍生化试剂替换出来。
整体柱制备完成后，要进行常规的柱效评价(推荐流动相为ACN，流速1mL/min，样品为萘等小分子化合物)，并评价衍生化前后，相同样品在柱子上保留行为的变化。对于整体柱的手性拆分能力，可以利用安息香等手性样品，流动相推荐为ACN/H2O＝75∶25，在254nm下检测。
本发明提供的高效液相色谱有机整体柱的制备方法，可以在室温下将β-CD或HP-β-CD键合到整体基质柱上，用于小分子样品的分析，和手性拆分。本发明提供的液相色谱柱可用于小分子样品分离分析、手性化合物拆分、和生物大分子分离。
1，图1是β-CD整体柱分离萘、苯甲酸乙酯和帕佐沙星混合物的液相谱图2，图2是HP-β-CD整体柱分离联苯、苯甲酸乙酯和联萘酚混合物的液相谱图。
3，图3是HP-β-CD整体柱分离安息香的液相谱图。
具体实施例方式实施例一聚合用混合物的配置及整体基质柱的制备合用混合物要现配现用，取GMA8g，EDMA12g，环己醇27g，十二醇3g和AIBN0.2g混合均匀，通氦气15min后使用。聚合用混合物灌入内径8mm、有效长度10cm的尼龙柱管中，两端封好，垂直放于57℃的水浴中反应12h。制好的整体基质柱装入柱套(Z-MODULETMRadial Compression SeparationSystem，购自Waters公司，Waters Corporation，MA 01757，USA)中，接到HPLC泵上，用乙醇以流速0.5mL/min，冲洗2-3h，完全除去未反应完的单体、交联剂和致孔剂。之后，用ACN为流动相，流速为1mL/min，254nm检测，用联苯、萘和苯甲酸乙酯作为小分子样品，对整体柱基质的柱效作初步的评价，选择柱效在400NTP/10cm以上的基体柱做进一步的衍生化实验。
β-CD整体柱的制备方法配制衍生化溶液(流动相)用无水Na2SO4处理24h的DMSO/ACN(体积比为1∶1)混合溶液100mL放置于250mL的烧杯中；边搅拌边加入BF3·Et2O(含量为46.8-47.8％)3.3mL；边搅拌边加入已干燥的β-CD6.17g(相当于5.4×10-3mol)，待其完全溶解。将衍生化溶液用HPLC泵注入整体基质柱中，室温下令流动相/衍生化试剂循环两天，流速0.3mL/min；然后用DMSO/ACN(体积比为1∶1)的流动相将柱子中的β-CD冲洗干净，最后，用ACN冲洗。
高效液相实验条件如下使用紫外254nm检测，室温，用ACN/H2O＝75/25((体积比)为流动相，流速为1mL/min。
样品为用流动相配制的萘、苯甲酸乙酯和帕佐沙星混合溶液。
β-CD整体柱分离萘、苯甲酸乙酯和帕佐沙星混合样品的液相谱图，如图1所示。
实施例二聚合用混合物的配置及整体基质柱的制备同实施例一。
HP-β-CD整体柱的制备方法在柱衍生化的方法与实施例一相似衍生化溶液为155mL的DMSO/ACN(体积比为1∶1)，含HP-β-CD 8.18g，BF3·Et2O(含量为46.8-47.8％)为5mL。室温下，令衍生化溶液循环两天；然后用DMSO/ACN(体积比为1∶1)的流动相将柱子中的HP-β-CD冲洗，最后用ACN冲洗干净，进行衍生化后柱评价。
高效液相实验条件如下
使用紫外254nm检测，室温，用ACN/H2O＝75/25(体积比)为流动相，流速为1.0mL/min。
样品为用流动相配制的联苯、苯甲酸乙酯和联萘酚混合溶液。
HP-β-CD整体柱分离联苯、苯甲酸乙酯和联萘酚混合物的液相谱图，如图2所示。
使用紫外254nm检测，室温，用ACN/H2O＝75/25(体积比)为流动相，流速为0.8mL/min。
样品为用流动相配制的安息香对映体溶液。
HP-β-CD整体柱分离安息香对映体的液相谱图，如图3所示。
权利要求
1.一种高效液相色谱有机相整体柱，其特征是该有机相整体柱上键合有环糊精或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱有机相整体柱，其特征是所述环糊精或其衍生物在被键合前有羟基存在，该羟基可以是未被取代的羟基或取代基团上的羟基，所述的取代基团为C1～C6的烷基、羟烷基。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱有机相整体柱，其特征是所述环糊精衍生物是羟丙基β-环糊精、2，6-二甲基β-CD、全甲基化β-CD、部分甲基化β-CD、羟乙基β-CD、2，3-二氧乙酰β-CD、1-(1-萘基)乙基氨甲酰β-CD、磺化β-CD、磺丁基β-CD、磺乙基β-CD、羧甲基β-CD、羧乙基β-CD、6A-甲胺基β-CD、6A，6D-二甲胺基β-CD、以及β-CD聚合物；所述的β-CD代表β-环糊精。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱有机相整体柱，其特征是所述环糊精衍生物是羟丙基β-环糊精或羟乙基β-环糊精。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱有机相整体柱，其特征在于所述的整体柱基质为多孔的体型的甲基丙烯酸缩水甘油酯-亚乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱有机相整体柱的制备方法，其特征在于将环糊精或其衍生物通过柱上衍生化的方式键合到整体柱基质上的。
7.根据权利要求6所述的高效液相色谱有机相整体柱的制备方法，其特征在于所述的环糊精或其衍生物在三氟化硼(BF3)的催化下与整体柱基质上的环氧基团反应。
8.根据权利要求6所述的高效液相色谱有机相整体柱的制备方法，其特征在于环糊精或其衍生物是溶解在体积比为2∶1-1∶3的二甲基亚砜(DMSO)/乙腈(ACN)的混合溶液中，在BF3的催化下以在柱衍生化的方式与整体柱基质上的环氧基团反应；BF3在DMSO/ACN的混合溶液中的含量在0.5-5％(质量百分比)。
9.根据权利要求6所述的高效液相色谱有机相整体柱的制备方法，其特征在于DMSO/ACN的混合溶液须经过除水处理。
10.根据权利要求6所述的高效液相色谱有机相整体柱的制备方法，其特征在于所述的整体柱基质是由甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)与亚乙基二甲基丙烯酸酯(EDMA)在致孔剂十二醇和环己醇的存在下，用偶氮二异丁腈(AIBN)引发聚合得到。
11.根据权利要求6或10所述的高效液相色谱有机相整体柱的制备方法，其特征在于聚合用混合物的组成及配比为GMA∶EDMA＝2∶3-3∶2(质量比)，十二醇∶环己醇＝9∶1-7∶3(质量比)，单体GMA和交联剂EDMA∶致孔剂＝1∶3-1∶1(质量比)，AIBN为单体和交联剂的0.5-2％(质量百分比)；聚合温度为55-60℃，反应时间为10-48h。
全文摘要
本发明涉及一种键合环糊精类化合物的高效液相色谱有机相整体柱及其制备方法。整体柱基质为多孔的体型的甲基丙烯酸缩水甘油酯－亚乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。本发明提供的液相色谱柱可用于小分子样品分离分析、手性化合物拆分、和生物大分子分离。
文档编号C08B37/00GK1603817SQ20041006814
公开日2005年4月6日 申请日期2004年11月12日 优先权日2004年11月12日
发明者许旭, 鲍笑岭 申请人:中国科学院上海有机化学研究所