聚合物改性剂和药物组合物的制作方法

专利名称：聚合物改性剂和药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型共聚物，包含所述共聚物的药物组合物，包含所述共聚物的蛋白改性剂，所述共聚物与蛋白的复合物(complex)，使用所述复合物预防或治疗疾病的方法，所述复合物在制造用于预防或治疗疾病的药剂中的用途以及合成所述共聚物和所述复合物的方法。
背景技术：
蛋白用其它作用剂比如聚合物改性的方法通常用于提供改进的药学性能，例如改进的稳定性和血中保留和减低的抗原性[例如，参见F.M.Veronese和J.M.Harris，“Peptide and Protein Pegylation”，Advanced Drug Delivery Reviews 54(4)，2002]。
当用聚合物改性蛋白时，在过去采用的一种技术包括用共价键将蛋白和聚合物改性剂结合(例如，参见WO-A-97/23614)。在蛋白的聚合物改性的其它实例中，比如在用聚合物改性药物中，药物已经用非共价键改性。在日本专利申请(Kokai)No.Hei 11-302199中提供了一种这样的实例，该申请公开了接枝共聚物，其包含非离子聚合物的接枝链和带负电的聚合物的主链，与能够在生理条件下带正电的物质，例如带正电荷的脂质体或聚-L-赖氨酸形成了包合复合物，从而改进了在血中的保留。在WO-A-99/02131中提出了另一选择方案，该专利公开了蛋白和水溶性聚合物可以在特定条件下在有机溶剂的存在下混合，从而提供了控释微粒。
遗憾的是，这些聚合物蛋白改性剂因为多种原因而很少是特别成功的。显示了一些改进性能的聚合物蛋白改性剂的一个最近的例子包括含有聚氧化亚烷基烷基醚化合物作为组成单元的聚马来酸化合物基共聚物[例如参见日本专利Nos.3035675和3271265]。这些聚合物改性剂的确显示了与目标蛋白的改进的结合。然而，这些共聚物仍然存在大量问题。其马来酸酐结构部分被发现非特异性结合于蛋白。这导致了所得共聚物和蛋白的复合物显示了非均匀性能，其取决于条件。尤其，发现这些聚合物改性剂往往很容易与蛋白形成无序交联结构，如此形成了引起蛋白结构过度改性和因此减低所需蛋白活性的庞大复合物。此外，已经发现这些聚合物蛋白改性剂和蛋白的复合物在给药之后显示了不令人满意的血中保留。
因此，对于能够提供具有均匀性能的复合物的聚合物改性剂存在着需求，尤其是与该蛋白的无序交联结构的形成减少，蛋白活性更好保留和在所述复合物给药之后蛋白在血液中优异保留的聚合物。
本发明的概述因此，本发明的目的是提供聚合物改性剂，其可以提供具有均匀性能，尤其与该蛋白的无序交联结构的形成减少，蛋白活性的更好保留和在所述复合物给药之后蛋白在血液中的优异保留的聚合物。
本发明人对各种蛋白改性剂做了大量研究，已经成功地获得了新型共聚物，其可以与蛋白形成具有均匀性能的复合物，并且显著改进了所述复合物的蛋白在血液中的保留，这样完成了本发明。
随着说明的进行，本发明的其它目的和优点将变得显而易见。
因此，本发明提供了共聚物或其药理学可接受的盐，作为组成单元，其含有(a)彼此相同或不同并且用以下通式(I)表示的一种或多种结构单元 式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，和R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基，该烷基可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基所取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基，和b)彼此相同或不同并且用以下通式(II)表示的一种或多种结构单元
式中R3表示羟基，具有1-6个碳原子的烷氧基，其可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基，具有6-14个碳原子的芳氧基，其可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代，或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5彼此相同或不同，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基，该烷基可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基所取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基；取代基A选自具有1-6个碳原子的烷基，具有1-6个碳原子的烷氧基，卤素原子，羟基，硝基和羧基。
本发明进一步提供了共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的一个或多个式(III)的羧酸酐结构部分进行选自下列之中的一种或多种反应来获得(i)水解，(ii)氨解(ammonolysis)，(iii)胺解(aminolysis)和(iv)醇解；该共聚物含有作为组成单元的(a)和(b)(a)彼此相同或不同并且用以下通式(I)表示的一种或多种结构单元
式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，和R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基，该烷基可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基所取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基，和(b)所述一个或多个式(III)的羧酸酐结构部分 取代基A选自具有1-6个碳原子的烷基，具有1-6个碳原子的烷氧基，卤素原子，羟基，硝基和羧基。
本发明还提供了包含如上所述的本发明的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的药物组合物，尤其还包含至少一种蛋白或其类似物或变体的这种组合物。
本发明还提供了能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，所述改性剂包含如上所述的本发明的共聚物或其药理学可接受的盐。
本发明还提供了复合物，其包含结合于如上所述的本发明的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的至少一种蛋白或其类似物或变体。
本发明还提供了包含有效量的药理学活性剂与载体或稀释剂的药物组合物，其中所述药理学活性剂是复合物，其包含结合于如上所述的本发明的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的至少一种蛋白或其类似物或变体。
本发明还提供了延长蛋白或其类似物或变体在给药于患者之后在血流中保留的时间的方法，该方法包括让所述蛋白或其类似物或变体与如上所述的本发明的至少一种共聚物或药理学可接受的盐复合。
本发明还提供了用于治疗或预防对蛋白或其类似物或变体敏感的患者的疾病的方法，该方法包括将有效量的包含与如上所述的本发明的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐结合的所述蛋白或其类似物或变体的复合物给药于所述患者。
本发明还提供了包含与如上所述的本发明的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐结合的所述蛋白或其类似物或变体的复合物在制备预防或治疗对所述蛋白或其类似物或变体敏感的疾病的药剂中的应用。
本发明还提供了用于制备含有以下(a)和(b)作为组成单元的共聚物或其药理学可接受的盐的方法，(a)彼此相同或不同并且用以下通式(I)表示的一种或多种结构单元 式中m，Alk，R1和R2是如以上所定义，和b)彼此相同或不同并且用以下通式(II)表示的一种或多种结构单元 式中R3如以上所定义；所述方法包括让共聚物中的一个或多个式(III)的羧酸酐结构部分进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应，所述共聚物含有作为组成单元的(c)和(d)(c)彼此相同或不同并且用如以上所定义的通式(I)表示的一种或多种结构单元，和(d)所述式(III)的一个或多个羧酸酐结构部分
本发明还提供了用于制备包含与如上所述的本发明的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐结合的所述蛋白或其类似物或变体的复合物的方法，所述方法包括让所述共聚物或其药理学可接受的盐与所述蛋白或其类似物或变体在有利于所述复合物形成的条件下反应。
附图简述

图1示出了本发明的复合物poly(PEG500-MA)a-OCIF在如以下试验实施例6中所进行的非还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(1)分子量标准(2)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶1(重量比)](3)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶2(重量比)](4)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶3(重量比)](5)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶4(重量比)](6)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶5(重量比)](7)非改性OCIF。
图2示出了本发明的复合物poly(PEG500-MA)a-OCIF在如以下试验实施例6中所进行的非还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的其它结果(1)分子量标准(2)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶1(重量比)，在孵化过程中的OCIF浓度3.5mg/ml](3)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶1(重量比)，在孵化过程中的OCIF浓度1.75mg/ml]
(4)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶1(重量比)，在孵化过程中的OCIF浓度0.875mg/ml](5)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶2(重量比)，在孵化过程中的OCIF浓度1.75mg/ml](6)poly(PEG500-MA)a-Na(化合物9)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶4(重量比)，在孵化过程中的OCIF浓度0.875mg/ml](7)非改性OCIF。
图3示出了现有技术复合物poly(PEG500-MA)-OCIF在如以下试验实施例6中所进行的非还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(1)分子量标准(2)poly(PEG500-MA)-(AM-0530K)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶10(重量比)](3)poly(PEG500-MA)-(AM-0530K)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶2.5(重量比)](4)poly(PEG500-MA)-(AM-0530K)-OCIF的复合物[OCIF∶聚合改性剂＝1∶1(重量比)](10)非改性OCIF。
本发明的详细说明(1)如上所述，本发明的一个方面提供了共聚物或其药理学可接受的盐，其含有作为组成单元的(a)和(b)(a)彼此相同或不同并且用下式(I)表示的一种或多种结构单元 式中m，Alk，R1和R2是如以上所定义，和b)彼此相同或不同并且用下式(II)表示的一种或多种结构单元
式中R3如以上所定义。在这些共聚物和其药理学可接受的盐中，优选的那些包括(2)根据(1)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元和用式(II)表示的结构单元以交替的头接头顺序，交替的头接尾顺序或交替的头接头和头接尾混合顺序排列；(3)根据(1)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元和用式(II)表示的结构单元以无规顺序排列；(4)根据(1)-(3)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基或三亚甲基；(5)根据(4)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基；(6)根据(1)-(5)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-50的整数；(7)根据(6)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-40的整数；(8)根据(7)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16或28-38的整数；(9)根据(8)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16的整数；(10)根据(1)-(9)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子或甲基；(11)根据(10)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子；(12)根据(1)-(11)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是氢原子或甲基；(13)根据(12)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是甲基；(14)根据(1)-(13)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是羟基，具有1-6个碳原子的烷氧基，或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基；(15)根据(14)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是羟基或具有1-6个碳原子的烷氧基；(16)根据(15)的共聚物或其药理学可接受的盐，其包括至少一个用其中R3是具有1-6个碳原子的烷氧基的式(II)表示的结构单元和任选的至少一个用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元，其中用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元与用其中R3是具有1-6个碳原子的烷氧基的式(II)表示的结构单元的比率是4∶6-0∶10；(17)根据(15)或(16)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是具有1-6个碳原子的烷氧基；(18)根据(15)-(17)的任一项的共聚物或药理学可接受的盐，其中所述具有1-6个碳原子的烷氧基是乙氧基；(19)根据(14)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是羟基或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基；(20)根据(19)的共聚物或其药理学可接受的盐，其包括至少一个用其中R3是用式-NR4R5表示的基团的式(II)表示的结构单元和任选的至少一个用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基，其中用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元与用其中R3是用式-NR4R5表示的基团的式(II)表示的结构单元的比率是5∶5-0∶10；(21)根据(20)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元与用其中R3是用式-NR4R5表示的基团的式(II)表示的结构单元的比率是4∶6-0∶10；(22)根据(19)-(21)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基；(23)根据(19)-(21)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式-NR4R5表示的基团是氨基，甲基氨基或二甲基氨基；(24)根据(23)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式-NR4R5表示的基团是氨基；
(25)根据(23)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式-NR4R5表示的基团是二甲基氨基；(26)根据(14)的共聚物或药理学可接受的盐，其中R3是羟基；(27)根据(14)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是1-氨基-2-丙醇基团；(28)根据(1)-(27)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是10∶1-1∶10；(29)根据(28)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是3∶1-1∶8；(30)根据(28)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是2∶1-1∶2或1∶2-1∶6；(31)根据(28)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是1∶1或在1∶2-1∶4的范围内；(32)根据(1)-(31)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-200；(33)根据(32)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-50；(34)根据(33)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-20；(35)根据(32)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是20-30；(36)根据(32)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是30-40；(37)根据(1)-(31)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径(stokes Radius)是≤9.3nm；(38)根据(37)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤7.3nm；(39)根据(38)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤6.2nm；
(40)根据(39)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤4.7nm；(41)根据(40)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤3.1nm；(42)根据(37)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是1.5-4.7nm；(43)根据(37)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是3.1-6.2nm；和(44)根据(1)的共聚物或其药理学可接受的盐，式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，和R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基，R3表示羟基，可以任选被一个羟基取代的具有1-6个碳原子的烷氧基，或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5彼此相同或不同，各自表示氢原子或者可以任选被一个羟基取代的具有1-6个碳原子的烷基；(45)根据(1)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk表示亚乙基，R1表示氢原子，R2表示甲基，以及m、R3、式(I)和(II)的结构单元比率(组成比)和如果相关的话其中R3表示羟基的式(II)的单元与其中R3表示非羟基的基团的式(II)的单元的比率(水解比)选自以下(i)m是6-16，R3是羟基，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(ii)m是28-38，R3是羟基，组成比是1∶1和平均聚合度是10-15；(iii)m是6-16，R3是氨基，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(iv)m是6-16，R3是二甲基氨基，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(v)m是6-16，R3是1-氨基-2-丙醇基团，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(vi)m是6-16，R3选自乙氧基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40和水解比是4∶6；(vii)m是28-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是10-15和水解比是4∶6；(viii)m是28-38，R3是二甲基氨基，组成比是1∶1和平均聚合度是10-15；(ix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40，水解比是3.1∶6.9和共聚物是钠盐；(x)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40和水解比是1.4∶8.6；(xi)m是6-16，R3选自二甲基氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40，水解比是2.9∶7.1和共聚物是钠盐；(xii)m是6-16，R3是氨基，组成比是1∶2.4和平均聚合度是20-30；(xiii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.4∶9.6；(xiv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是2.9∶7.1；(xv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.9∶9.1；(xvi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.5∶9.5；(xvii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.3∶8.7；(xviii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.9∶8.1；(xix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.0∶9.0；(xx)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.8∶9.2；(xxi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是4.6∶5.4；(xxii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.2∶8.8；(xxiii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是2.0∶8.0；(xxiv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.1∶8.9；(xxv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是2.4∶7.6；(xxvi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.9∶9.1；(xxvii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.5∶8.5；(xxviii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.7∶9.3；(xxix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是4.5∶5.5；(xxx)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.4∶8.6；(xxxi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.7∶9.3；(xxxii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.8∶9.2；(xxxiii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.4∶8.6；(xxxiv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶3.1，平均聚合度是20-30和水解比是0.7∶9.3；(xxxv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.9∶9.1；(xxxvi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.9∶8.1；(xxxvii)m是6-16，R3选自乙氧基和羟基，组成比是约1∶3，平均聚合度是20-30和水解比是3.1∶6.9；(xxxviii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤9.3nm；(xxxix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是3.1-6.2nm；(xl)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是1.5-4.7nm；(xli)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤3.1nm；(xlii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤7.8nm；(xliii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤6.2nm；(xliv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤4.7nm；(46)如上所述，本发明的另一个方面提供了共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的一个或多个式(III)的羧酸酐结构部分进行选自(i)水解，(ii)氨解(ammolysis)，(iii)胺解(aminolysis)和(iv)醇解之中的一种或多种反应来获得，该共聚物含有作为组成单元的(a)和(b)(a)彼此相同或不同并且用以下通式(I)表示的一种或多种结构单元 式中m，Alk，R1和R2如以上所定义，和(b)包括式(III)的羧酸酐结构部分的所述结构单元
在这些共聚物和其药理学可接受的盐中，优选的那些包括(47)根据(46)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中共聚物中的用式(I)表示的结构单元和用式(III)表示的结构单元以交替的头接头顺序，交替的头接尾顺序或交替的头接头和头接尾混合顺序排列；(48)根据(46)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中共聚物中的用式(I)表示的结构单元和用式(III)表示的结构单元以无规顺序排列；(49)根据(46)-(48)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基或三亚甲基；(50)根据(49)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基；(51)根据(46)-(50)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-50的整数；(52)根据(51)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-40的整数；(53)根据(52)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16或28-38的整数；(54)根据(53)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16的整数；(55)根据(46)-(54)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子或甲基；(56)根据(55)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子；(57)根据(46)-(56)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是氢原子或甲基；(58)根据(57)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是甲基；(59)根据(46)-(58)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是10∶1-1∶10；(60)根据(59)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是3∶1-1∶8；(61)根据(59)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是2∶1-1∶2或者1∶2-1∶6；(62)根据(59)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是1∶1或者在1∶2-1∶4的范围内；(63)根据(46)-(62)的任一项的共聚物或药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-200；(64)根据(63)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-50；(65)根据(64)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-20；(66)根据(63)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是20-30；(67)根据(63)的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是30-40；(68)根据(46)的共聚物或其药理学可接受的盐，式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，和R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基；(69)根据(46)-(68)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的式(III)的羧酸酐结构部分进行氨解来获得；(70)根据(69)的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过用氨水进行氨解来获得；(71)根据(46)-(68)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的式(III)的羧酸酐结构部分进行胺解来获得；(72)根据(71)的共聚物或其药理学可接受的盐，其通过使用二甲基胺水溶液进行胺解来获得；(73)根据(46)-(68)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的式(III)的羧酸酐结构部分进行醇解来获得；和(74)根据(73)的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过使用乙醇进行醇解来获得。
本发明还利用本发明的共聚物和其药理学可接受的盐来提供药物组合物，能够改性蛋白的改性剂，复合物，用于延长蛋白在血流中保留的时间的方法，用于治疗或预防疾病的方法和本发明的复合物在制备用于治疗或预防疾病的药剂的用途。本发明的这些方面的优选实例包括(75)药物组合物，包含药学可接受的稀释剂或载体和根据(1)-(74)的任一项的本发明的至少一种共聚物或药理学可接受的盐；(76)根据(75)的药物组合物，其中所述组合物进一步包括至少一种蛋白或其类似物或变体；(77)根据(76)的药物组合物，其中蛋白或其类似物或变体是碱性蛋白；(78)根据(77)的药物组合物，其中碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体；(79)根据(77)的药物组合物，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体；(80)根据(79)的药物组合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF；(81)根据(79)的药物组合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体；
(82)根据(79)的药物组合物，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，其中所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定；(83)根据(79)的药物组合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380；(84)根据(79)的药物组合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380；(85)能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，所述改性剂包括根据(1)-(74)的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐；(86)根据(85)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中蛋白是碱性蛋白；(87)根据(86)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体；(88)根据(86)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体；(89)根据(88)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF；(90)根据(88)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体；(91)根据(88)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定；(92)根据(88)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380；(93)根据(88)的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380；(94)复合物，其包含结合于根据(1)-(74)的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的至少一种蛋白或其类似物或变体；(95)根据(94)的复合物，其中该蛋白是碱性蛋白；(96)根据(95)的复合物，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体；(97)根据(95)的复合物，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体；(98)根据(97)的复合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF；(99)根据(97)的复合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体；(100)根据(97)的复合物，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定；(101)根据(97)的复合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380；(102)根据(97)的复合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380；(103)药物组合物，其包含有效量的药理学活性剂与载体或稀释剂，其中所述药理学活性剂以根据(94)-(102)的任一项的复合物的形式存在；(104)用于延长在对患者给药之后蛋白或其类似物或变体在血流中保留的时间的方法，该方法包括将所述蛋白或其类似物或变体与根据(1)-(74)的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐复合；(105)根据(104)的方法，其中该蛋白是碱性蛋白；(106)根据(105)的方法，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体；(107)根据(105)的方法，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体；(108)根据(107)的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF；(109)根据(107)的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体；(110)根据(107)的方法，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定；(111)根据(107)的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380；(112)根据(107)的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380；(113)用于治疗或预防对蛋白或其类似物或变体敏感(susceptible)的患者的疾病的方法，该方法包括将有效量的包含结合于根据(1)-(74)的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的所述蛋白或其类似物或变体的复合物给药于所述患者；(114)根据(113)的方法，其中蛋白是碱性蛋白；(115)根据(114)的方法，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体；(116)根据(114)的方法，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体；(117)根据(116)的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF；(118)根据(116)的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体；(119)根据(116)的方法，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定；(120)根据(116)的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380；(121)根据(116)的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380；(122)根据(116)-(121)的任一项的方法，其中所述疾病是骨代谢疾病；(123)包含结合于根据(1)-(74)的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的蛋白或其类似物或变体的复合物在制备用于预防或治疗对所述蛋白或其类似物或变体敏感的疾病的药剂中的应用；(124)根据(123)的应用，其中该蛋白是碱性蛋白；(125)根据(123)的应用，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体；(126)根据(123)的应用，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体；(127)根据(126)的应用，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF；(128)根据(126)的应用，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体；(129)根据(126)的应用，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定；(130)根据(126)的应用，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380；(131)根据(126)的应用，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380；和(132)根据(126)-(131)的应用，其中所述疾病是骨代谢疾病。
在以上式(I)中的取代基Alk的定义中的“具有1-6个碳原子的亚烷基”是具有1-6个碳原子的直链或支链亚烷基，比如亚甲基，甲基亚甲基，亚乙基，亚丙基，三亚甲基，四亚甲基，1-甲基三亚甲基，2-甲基三亚甲基，3-甲基三亚甲基，五亚甲基，或六亚甲基。在这些亚烷基中，具有1-4个碳原子的直链或支链亚烷基是优选的，亚乙基或三亚甲基是更优选的，亚乙基是最优选的。
在上式(I)和(II)中的取代基R1、R2、R4、R5和取代基A的定义中，在“可以任选被选自下列基团中的至少一个取代基取代的具有1-6个碳原子的烷基羟基、卤素原子和可以任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基”中的烷基是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，比如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，2-甲基丁基，新戊基，1-乙基丙基，正己基，异己基，4-甲基戊基，3-甲基戊基，2-甲基戊基，1-甲基戊基，3，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，或2-乙基丁基。在这些烷基中，具有1-4个碳原子的直链或支链烷基是优选的，甲基和乙基是更优选的，甲基是最优选的。
在上式(I)和(II)中的取代基R3和取代基A的定义中，在“可以任选被选自下列基团中的至少一个取代基取代的具有1-6个碳原子的烷氧基羟基、卤素原子和可以任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基”中的烷氧基是其中具有1-6个碳原子的上述烷基结合于氧原子的取代基。此类烷氧基的实例包括具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，比如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，异戊氧基，2-甲基丁氧基，新戊氧基，正己氧基，4-甲基戊氧基，3-甲基戊氧基，2-甲基戊氧基，3，3-二甲基丁氧基，2，2-二甲基丁氧基，1，1-二甲基丁氧基，1，2-二甲基丁氧基，1，3-二甲基丁氧基，和2，3-二甲基丁氧基。在这些烷氧基中，具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基是更优选的，乙氧基是最优选的。
“卤素原子”属于以上“取代基A”之一，是在以上式(I)和(II)的取代基R1、R2、R4和R5的定义中的“可以任选被选自下列基团中的至少一个取代基取代的具有1-6个碳原子的烷基羟基、卤素原子和可以任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基”上的任选取代基，也是在以上式(II)的取代基R3的定义中的“可以任选被选自下列基团中的至少一个取代基取代的具有1-6个碳原子的烷氧基羟基、卤素原子和可以任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基”上的任选取代基，是氟原子，氯原子，溴原子或碘原子；优选是氟原子或氯原子。
“具有6-14个碳原子的芳基”属于在取代基R1、R2、R4和R5的定义中的“可以任选被选自下列基团中的至少一个取代基取代的具有1-6个碳原子的烷基羟基、卤素原子和可以任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基”上的任选取代基，也属于在以上式(II)的取代基R3的定义中的“可以任选被选自下列基团中的至少一个取代基取代的具有1-6个碳原子的烷氧基羟基、卤素原子和可以任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基”上的任选取代基，是具有6-14个碳原子的芳烃基团，例如可以是苯基，茚基，萘基，菲基，或蒽基。优选它是苯基。
在以上式(II)的取代基R3的定义中的“可以任选被选自取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳氧基”是键接于氧原子的如以上定义的芳基，例如可以是苯氧基，茚氧基，萘氧基，菲氧基或蒽氧基。优选它是苯氧基。
在以上式(I)和(II)的取代基R1、R2、R4和R5的定义中的“任选被至少一个卤素原子取代的具有1-6个碳原子的烷基”是被如上所述的至少一个卤素原子取代的如上所述的具有1-6个碳原子的烷基，例如可以是三氟甲基，三氯甲基，二氟甲基，二氯甲基，二溴甲基，氟甲基，2，2，2-三氟乙基，2，2，2-三氯乙基，2-溴乙基，2-氯乙基，2-氟乙基，2-碘乙基，3-氯丙基，4-氟丁基，6-碘己基，2，2-二溴乙基或五氟乙基。优选它是三氟甲基，三氯甲基，二氟甲基或五氟乙基，最优选它是三氟甲基。
在上式(I)和(II)的取代基R1、R4和R5的定义中的“任选被至少一个羟基取代的具有1-6个碳原子的烷基”的实例包括羟甲基，1-羟乙基，1-羟丙基和2-羟丙基。
在上式(II)中的取代基R3的定义中的“任选被至少一个卤素原子取代的具有1-6个碳原子的烷氧基”是被如上所述的至少一个卤素原子取代的如上所述的具有1-6个碳原子的烷氧基，例如可以是三氟甲氧基，三氯甲氧基，二氟甲氧基，二氯甲氧基，二溴甲氧基，氟甲氧基，2，2，2-三氟乙氧基，2，2，2-三氯乙氧基，2-溴乙氧基，2-氯乙氧基，2-氟乙氧基，2-碘乙氧基，3-氯丙氧基，4-氟丁氧基，6-碘己氧基，2，2-二溴乙氧基，或五氟乙氧基；优选它是被氟或氯原子取代的C1-C4烷氧基，比如三氟甲氧基，三氯甲氧基，二氟甲氧基，或五氟乙氧基。更优选它是三氟甲氧基。
在上式(II)中的取代基R3的定义中的“任选被至少一个羟基取代的具有1-6个碳原子的烷氧基”的实例包括羟基甲氧基，1-羟基乙氧基，1-羟基丙氧基和2-羟基丙氧基。
在以上式(I)和(II)的取代基R1、R2、R4和R5的定义中的“任选被至少一个具有6-14个碳原子的芳基取代的具有1-6个碳原子的烷基，该芳基可任选被选自取代基A中的1-5个取代基取代”例如可以是苄基，1-萘甲基，2-萘甲基，茚基甲基，1-苯乙基，2-苯乙基，1-萘乙基，2-萘乙基，1-苯丙基，2-苯丙基，3-苯丙基，1-萘丙基，2-萘丙基，3-萘丙基，1-苯丁基，2-苯丁基，3-苯丁基，4-苯丁基，1-萘丁基，2-萘丁基，3-萘丁基，4-萘丁基，1-苯基戊基，2-苯基戊基，3-苯基戊基，4-苯基戊基，5-苯基戊基，1-苯基己基，2-苯基己基，3-苯基己基，4-苯基己基，5-苯基己基或6-苯基己基；优选它是被具有6-10个碳原子的芳基取代的烷基，比如苄基，1-萘甲基，2-萘甲基，1-苯乙基，2-苯乙基，1-萘乙基，2-萘乙基，1-苯丙基，2-苯丙基，3-苯丙基或1-萘丙基；更优选它是苄基。
在上式(II)中的取代基R3的定义中的“任选被至少一个具有6-14个碳原子的芳基取代，该芳基进一步可任选被选自取代基A中的1-5个取代基取代，具有1-6个碳原子的烷氧基”例如可以是苯甲酰氧基，1-萘基甲氧基，2-萘基甲氧基，茚基甲氧基，1-苯乙氧基，2-苯乙氧基，1-萘基乙氧基，2-萘基乙氧基，1-苯丙氧基，2-苯丙氧基，3-苯丙氧基，1-萘基丙氧基，2-萘基丙氧基，3-萘基丙氧基，1-苯基丁氧基，2-苯基丁氧基，3-苯基丁氧基，4-苯基丁氧基，1-萘基丁氧基，2-萘基丁氧基，3-萘基丁氧基，4-萘基丁氧基，1-苯基戊氧基，2-苯基戊氧基，3-苯基戊氧基，4-苯基戊氧基，5-苯基戊氧基，1-苯基己氧基，2-苯基己氧基，3-苯基己氧基，4-苯基己氧基，5-苯基己氧基或6-苯基己氧基；优选它是被具有6-10个碳原子的芳基取代的烷基，比如苯甲酰氧基，1-萘基甲氧基，2-萘基甲氧基，1-苯乙氧基，2-苯乙氧基，1-萘乙氧基，2-萘乙氧基，1-苯基丙氧基，2-苯基丙氧基，3-苯基丙氧基或1-萘基丙氧基；更优选它是苯甲酰氧基。
如果R3是“可以任选被选自取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳氧基”，它优选是任选被选自取代基A中的1-3个取代基取代的具有6-10个碳原子的芳氧基；更优选，它是任选被选自取代基A中的1-3个取代基取代的苯氧基；还更优选，它是任选被1-3个卤素原子、具有1-6个碳原子的烷基、羟基或硝基取代的苯氧基；最优选，它是苯氧基或对硝基苯氧基。
如果本发明的共聚物具有碱性基团，该化合物可以通过让这些碱性基团的一些或全部与酸反应而转化为它的药理学可接受的盐。此外，本发明的共聚物具有酸性羧基，该共聚物可以通过让这些羧基的一些或全部与碱反应而转化为它的药理学可接受的盐。
用存在于本发明的共聚物的碱性基团形成的药理学可接受的盐的优选实例包括无机酸盐比如氢卤酸盐(例如盐酸盐，氢溴酸盐和氢碘酸盐)，硝酸盐，高氯酸盐，硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐比如其中低级烷基结构部分如以上定义的低级链烷烃磺酸盐(例如甲磺酸盐，三氟甲磺酸盐和乙烷磺酸盐)，其中芳基结构部分如以上所定义的芳基磺酸盐(例如，苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐)，醋酸盐，苹果酸盐，富马酸盐，丁二酸盐，柠檬酸盐，抗坏血酸盐，酒石酸盐，草酸盐和马来酸盐；和氨基酸盐比如甘氨酸盐，赖氨酸盐，精氨酸盐，鸟氨酸盐，谷氨酸盐和天冬氨酸盐。氢卤酸盐是特别优选的。
用存在于本发明的共聚物的酸性羧基形成的药理学可接受的盐的优选实例包括金属盐比如碱金属盐(例如钠盐，钾盐和锂盐)，碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)，金属盐比如铝盐，铁盐，锌盐，铜盐，镍盐和钴盐；胺盐比如无机胺盐(例如铵盐)和有机胺盐(例如叔辛基胺盐，二苄基胺盐，吗啉盐，葡糖胺盐，苯基甘氨酸烷基酯盐，乙二胺盐，N-甲基葡糖胺盐，胍盐，二乙胺盐，三乙胺盐，二环己基胺盐，N，N’-二苄基乙二胺盐，氯普鲁卡因盐，普鲁卡因盐，二乙醇胺盐，N-苄基苯乙基胺盐，哌嗪盐，四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐；和氨基酸盐比如甘氨酸盐，赖氨酸盐，精氨酸盐，鸟氨酸盐，谷氨酸盐和天冬氨酸盐。碱金属盐和碱土金属盐是特别优选的。
在本发明中，“结构单元”被定义为本发明的共聚物的最小组成单元，并且在以上共聚物的定义中作为式(I)的单元或式(II)的单元进行了描述。“结构单元”不是在本发明的共聚物的合成中在聚合反应中采用的单体起始原料的结构；相反，它是由所述单体起始原料衍生的单元，并且存在于本发明的所述共聚物中。
在本发明中，短语“头接头顺序”是指用式(I)和(II)表示的结构单元如下式所示排列 在本发明中，短语“头接尾顺序”是指用式(I)和(II)表示的结构单元如下式所示排列 在本发明中，共聚物及其药理学可接受的盐可以是交替共聚物或无规共聚物。交替共聚物是其中式(I)的结构单元与式(II)的结构单元的比率是1∶1以及用式(I)表示的结构单元和用式(II)表示的结构单元以交替的头接头顺序、交替的头接尾顺序或交替的头接头和头接尾混合顺序排列的那些。无规共聚物是其中用式(I)的结构单元和用式(II)表示的结构单元以无规顺序排列的那些。
在本发明中，“组成比”是在本发明的共聚物中用式(I)表示的结构单元的数目与用式(II)表示的结构单元的数目的平均比率。当共聚物基本上是交替共聚物时，组成比可以是1∶1。然而，当共聚物是无规共聚物时，所述比率可以改变。在本发明的共聚物中，所述比率不是特别限制的，通常它可以是10∶1到1∶10，优选3∶1到1∶8，更优选2∶1到1∶2或1∶2到1∶6，最优选它是1∶1或1∶2到1∶4。应该指出的是，组成比值不可避免地根据起始原料、聚合条件等而稍微改变。结果，所给出的组成比是近似值；在以上给出的组成比值的基础上至多±30％的变化仍然被认为是在所述比率的范围内。
本发明的共聚物的组成比可以通过使用已知的分析技术来确定。通过用电导滴定由所述共聚物的各结构单元的化学式量的知识测定共聚物的羧基含量(mmol/g)[该测定要求通过水解所要分析的共聚物或通过单独合成相应水解共聚物来制备相应完全水解的共聚物(即，R3是OH)]，可以使用下式测定组成比Rii/Ri＝(C×FWi)/(2000-C×FWii)其中Ri是结构单元(I)的平均数，Rii是结构单元(II)的平均数，C是共聚物的羧基含量(mmol/g)，FWi是结构单元(I)的化学式量和FWii是结构单元(II)的化学式量。
一般，聚合物的分子量作为相对于标准化合物的相对分子量来测定，该标准化合物含有与所述聚合物类似的结构，并且具有已知的绝对分子量值。这种评价方法常常用于测定新型共聚物比如本发明的那些的分子量。
本发明的共聚物的平均分子量是通过凝胶过滤色谱法，采用具有已知绝对分子量的聚合物作为标准化合物所测定的值。凝胶的性质，洗脱条件和用作比较的已知绝对分子量的聚合物可以适当地由普通技术人员采用已知的技术和常识来选择，例如参见“ComprehensivePolymer Science”，pub.Pergamon Press(Oxford)1989。用于对比目的的标准化合物优选是具有类似结构和性能的聚合物。对于本发明的共聚物来说，侧链部分被认为是特性结构。因此，用于对比的标准化合物优选是含有与平均分子量待测的本发明的共聚物的侧链部分类似的结构的聚合物。更优选，所使用的标准化合物是聚(乙二醇)。
在本发明中，“平均聚合度”是在本发明的共聚物中的结构单元的聚合度的平均值，即，它是在所述共聚物中的结构单元的平均数目。它根据共聚物的平均分子量，所述共聚物的各结构单元的化学式量和所述共聚物的结构单元的组成比来测定。具有结构单元I和II的本发明的共聚物的“平均聚合度”可以使用下式来计算平均聚合度＝Mc/(FWi×Ri+FWii×Rii)其中Mc是共聚物的平均分子量，FWi和FWii分别是结构单元I和II各自的化学式量，Ri和Rii表示由组成比计算的共聚物中的结构单元I和II的比例(组成比＝Ri∶Rii；Ri+Rii＝1)。
在用于测定本发明的共聚物的平均聚合度的上式中，结构单元的组成比值，共聚物的平均分子量和结构单元的化学式量全部可以如上所述测定。为了这样做，有必要制备相应完全水解、氨解，胺解或醇解的共聚物(优选相应完全水解的共聚物)。另外，如果在本发明的共聚物的制备中使用的起始共聚物具有已知组成，这些值可以无需分析来测定。在本发明的共聚物中的平均聚合度不是特别限制的。通常，它是在5-200的范围内；优选它是5-50；更优选5-20或20-30或30-40。
在本发明的共聚物中，式(II)的结构单元可以包括至少一种其中R3是具有1-6个碳原子的任选取代的烷氧基，任选取代的芳氧基或用式-NR4R5表示的基团的式(II)的结构单元，以及任选的至少一种用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元。用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元和用其中R3是任选取代的烷氧基、任选取代的芳氧基或用式-NR4R5表示的基团的式(II)表示的结构单元之间的比率被称为水解比。通过用电导滴定由所述共聚物的各结构单元的化学式量和组成比(参见以上)测定共聚物的羧基含量(mmol/g)，可以采用下式测定水解比H∶A 其中H∶A是水解比，Ri∶Rii是组成比，C是共聚物的羧基含量(mmol/g)，FWi是结构单元(I)的化学式量，FWii是其中R3是OH的结构单元(II)的化学式量，以及FW(A)ii是其中R3是任选取代的烷氧基、任选取代的芳氧基或用式-NR4R5表示的基团的结构单元(II)的化学式量。
优选的水解比范围是5∶5到0∶10，4∶6到0∶10，3∶7到0∶10，2∶8到0∶10和1∶9到0∶10。应该指出的是，水解比率值不可避免地根据起始原料、反应条件等的轻微改变而一定程度改变。结果，在本申请中所述的水解比是近似值；在本申请中所述的水解比率值的至多±30％的变化仍然被认为是在所述比率的范围内。
本发明的共聚物的分子大小可以采用已知的分析技术比如尺寸排阻色谱法，用已知分子大小的蛋白作为标准来测定(以下实施例15和16提供了使用这种技术的实例)。采用尺寸排阻色谱法，共聚物的分子大小作为其斯托克斯半径来给出。在本发明中，共聚物的分子大小不是特别限制的。通常，本发明的共聚物的斯托克斯半径是≤9.3nm，优选它是≤7.3nm，更优选它是≤6.2nm，≤4.7nm或≤3.1nm，或者它是在3.1-6.2nm或1.5-4.7nm的范围内。
本发明的共聚物及其药理学可接受的盐可以采用以下式(IV)和(V)表示的起始单体通过本领域技术人员已知的适合共聚反应来获得[例如，参见由Pergamon Press(Oxford)在1989年出版的“Comprehensive Polymer Science”] (其中m，Alk以及R1、R2和R3如以上所定义)。为了获得具有特定的所需平均聚合度或分子量的共聚物，所得共聚物可以采用凝胶过滤色谱法分级。
单体在本领域中是已知的，或者可以容易地根据本领域技术人员公知的方法来获得[例如，参见J.M.Harris，“Laboratory synthesisof polyethylene glycol derivatives”，Rev.Macromol.Chem.Phys.C25，326-373(1985)和日本专利No.2621308]。用式(V)表示的单体可以容易地通过让马来酸酐进行选自(a)水解、(b)氨解，(c)胺解或(d)醇解中的一种或多种反应来获得。
或者，共聚物或其药理学可接受的盐可以通过让共聚物中的一个或多个式(III)的羧酸酐结构部分进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应来获得，该共聚物含有作为组成单元的(a)和(b)(a)彼此相同或不同并且用以下通式(I)表示的一种或多种结构单元 式中m，Alk，R1和R2如以上所定义，和(b)包括式(III)的羧酸酐结构部分的所述结构单元 具有式(I)和(III)的单元的起始共聚物要么在本领域中是公知的(例如诸如AM-0530K和AM-1510K之类的共聚物可以从NOFCorporation购买)，或者可以容易地根据本领域技术人员公知的方法来制备[例如参见Yoshimoto等人，“Polyethylene glycolderivative-modified cholesterol oxidase soluble and active inbenzene”，Biochem.Biophys.Res.Comm.148，876-882(1987)，日本专利No.2621308，日本专利申请公开No.2003-105040和日本专利申请公开No.2003-105003]。
为了获得具有所需平均聚合度或所需分子量的共聚物，所得共聚物可以通过凝胶过滤色谱法来分级。
在本发明中，本发明的共聚物可以通过让一种或多种式(III)的羧酸酐结构部分进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应来获得。
在本发明中，“水解”是指式(III)的羧酸酐结构部分与水的开环反应，获得其中R3是羟基的式(II)的结构单元。实际水解反应的性质不是特别限制的，只要它是本领域技术人员通常采用的方法。
适用于水解反应的溶剂的例子包括水；醚类比如二乙醚，二异丙基醚，四氢呋喃，二恶烷，二甲氧基乙烷和二甘醇二甲醚；和酰胺比如甲酰胺，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，N-甲基-2-吡咯烷酮，N-甲基吡咯烷二酮，和六甲基磷酰三胺。在这些溶剂中，水和二恶烷是优选的。
所使用的试剂适合是水。如果水用作溶剂，那么不需要添加额外的水。另外，为了加速反应可以添加碱。此类碱的实例包括无机碱比如碱金属碳酸盐(例如，碳酸钠，碳酸钾，和碳酸锂)，碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠，碳酸氢钾，和碳酸氢锂)，碱金属氢化物(例如氢化锂，氢化钠和氢化钾)，碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钡，和氢氧化锂)，碱金属氟化物(例如氟化钠和氟化钾)；和有机碱比如碱金属醇盐(例如甲醇钠，乙醇钠，甲醇钾，乙醇钾，叔丁醇钾和甲醇锂)，N-甲基吗啉，三乙胺，三丙胺，三丁基胺，二异丙基乙基胺，二环己基胺，N-甲基哌啶，吡啶，4-吡咯烷基吡啶，甲基吡啶，4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，2，6-二(叔丁基)-4-甲基吡啶，喹啉，N，N-二甲基苯胺，N，N-二乙基苯胺，1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)，1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。在这些碱当中，有机碱是优选的，吡啶是最优选的。在这方面，应该指出的是，如果水解反应在没有碱的情况下令人满意地进行，那么不必要添加碱。
反应温度根据起始化合物和试剂而改变，但通常是在0-100℃的范围内和优选在20-60℃的范围内。
反应时间随所用反应温度、起始化合物、试剂和溶剂类型而改变，但通常是在10分钟到3天的范围内，优选在6小时到24小时的范围内。
在反应结束之后，可以通过本领域技术人员已知的普通方法从反应混合物中分离出水解反应的所需化合物。例如，所得反应混合物可以采用超滤膜浓缩(condense)，然后冻干，获得目标反应化合物。另外，所需化合物可以不用分离而作为溶液用于改性蛋白。
如果需要，这样获得的所需化合物可以进一步通过普通技术比如凝胶过滤色谱法来提纯。为了获得具有特定的所需平均聚合度或所需分子量的化合物，提纯的化合物可以进一步采用凝胶过滤色谱法分级。
在本发明中，“氨解”是指式(III)的羧酸酐结构部分与氨进行的开环反应，获得了其中R3是氨基的式(II)的结构部分。实际氨解反应的性质不是特别限制的，只要它是本领域技术人员通常采用的方法。
适合使用的溶剂的例子包括水；醚比如二乙醚，二异丙基醚，四氢呋喃，二恶烷，二甲氧基乙烷和二甘醇二甲醚；和酰胺比如甲酰胺，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，N-甲基-2-吡咯烷酮，N-甲基吡咯烷二酮，和六甲基磷酰三胺。在这些溶剂中，水和二恶烷是优选的。应该指出的是，所用试剂还可以用作溶剂。
适合使用的试剂的实例包括氨气和氨水，以及氨是优选的。
反应温度随起始原料和试剂而改变，但通常是0-100℃，优选10-40℃。
反应时间根据所用反应温度、起始化合物、试剂和溶剂类型而改变，但通常是在10分钟到3天的范围内，优选是在6小时到24小时的范围内。
在反应结束之后，可以通过本领域技术人员已知的普通方法从反应混合物中分离出氨解反应的所需化合物。所得反应混合物例如可以如下后处理，以分离目标化合物(1)通过使用酸比如醋酸水溶液经半透膜渗析以除去过量氨(渗析在使得反应混合物溶液不变成酸性的这种条件下进行，如果必要添加水)，随后使用超滤膜浓缩，然后冻干这样获得的浓缩物；或(2)添加氢氧化钠水溶液和不混溶有机溶剂比如二乙醚，摇动所得混合物(摇动可以进行两次或多次，如果必要)，然后冻干分离的含有目标化合物的含水层，获得目标化合物。另外，所需化合物可以不用分离而作为溶液用于蛋白的改性。
如果必要，这样获得的所需化合物可以用普通技术比如凝胶过滤色谱法来进一步提纯。为了获得具有特定的所需平均聚合度或所需分子量的化合物，提纯的化合物可以进一步采用凝胶过滤色谱法分级。
应该指出的是，由于起始原料中的式(III)的一些单元被存在于溶剂或试剂中的水所水解，氨解反应的目标化合物可以含有其中R3是羟基的式(II)的结构单元。还应该指出的是，为了改进储存，可以将碱加入到目标化合物中。
在本发明中，“胺解”是指式(III)的羧酸酐结构部分与胺的开环反应，获得了其中R3是式-NR4R5的基团的式(II)的结构部分，其中R4和R5如以上所定义。实际胺解反应的性质不是特别限制的，只要它是本领域技术人员所通常采用的方法。
适合采用的溶剂的实例包括水；醚比如二乙醚，二异丙基醚，四氢呋喃，二恶烷，二甲氧基乙烷和二甘醇二甲醚；和酰胺比如甲酰胺，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，N-甲基-2-吡咯烷酮，N-甲基吡咯烷二酮，和六甲基磷酰三胺。在这些溶剂中，水和二恶烷是优选的。应该指出的是，所用试剂还可以用作溶剂。
所用试剂显然取决于式-NR4R5的目标基团的性质。通常采用的胺包括甲胺，二甲胺，乙胺，二乙胺，2-羟乙基胺，二-2-羟乙基胺，正丙基胺，二正丙基胺，异丙基胺，二异丙基胺，1-氨基-2-丙醇和2-羟基异丙基胺，以及它们的水溶液。在这些试剂中，优选的试剂包括二甲胺水溶液和1-氨基-2-丙醇；二甲胺水溶液是最优选的。
反应温度根据起始化合物和试剂而改变，但通常是0-100℃，优选是10-40℃。
反应时间根据反应温度、起始化合物、试剂和所用溶剂的类型而改变，但通常是在10分钟到3天的范围内，优选6小时到36小时的范围内。
在反应完成后，可以通过本领域技术人员已知的普通方法从反应混合物中分离出胺解反应的所需化合物。所得反应混合物例如可以如下后处理，以分离目标化合物(1)通过使用酸比如醋酸水溶液经半透膜渗析以除去过量氨(渗析在使得反应混合物溶液不变成酸性的这种条件下进行，如果必要添加水)，随后使用超滤膜浓缩，然后冻干这样获得的浓缩物；或(2)添加氢氧化钠水溶液和不混溶有机溶剂比如二乙醚，摇动所得混合物(摇动可以进行两次或多次，如果必要)，然后冻干分离的含有目标化合物的含水层，获得目标化合物。另外，所需化合物可以不用分离而作为溶液用于蛋白的改性。
如果必要，这样获得的所需化合物可以用普通技术比如凝胶过滤柱来进一步提纯。为了获得具有特定的所需平均聚合度或所需分子量的化合物，提纯的化合物可以进一步采用凝胶过滤色谱法分级。
应该指出的是，由于起始原料中的式(III)的一些单元被存在于溶剂或试剂中的水所水解，胺解反应的目标化合物可以含有其中R3是羟基的式(II)的结构单元。还应该指出的是，为了改进储存，可以将碱加入到目标化合物中。
在本发明中，“醇解”是指式(III)的羧酸酐结构部分与醇或芳醇的开环反应，获得其中R3是如以上定义的烷氧基或芳氧基的式(II)的结构部分。实际醇解反应的性质不是特别限制的，只要它式本领域技术人员通常采用的方法。
在醇解反应中采用的溶剂的例子包括水；以及酰胺比如甲酰胺，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，N-甲基-2-吡咯烷酮，N-甲基吡咯烷二酮和六甲基磷酰三胺。在这些溶剂中，水是优选的。应该指出的是，所用试剂也可以用作溶剂。
所用试剂显然取决于目标烷氧基或芳氧基的性质。用于获得所需烷氧基的醇的典型实例包括甲醇，乙醇，乙二醇，正丙醇，丙二醇，2-羟基-正丙醇和异丙醇，以及它们的水溶液，而用于获得所需芳氧基的醇的典型实例包括苯酚和对硝基苯酚。在这些试剂中，乙醇是优选的。
反应温度根据起始化合物和该试剂而改变，但通常是0-100℃，优选是10-40℃。
反应时间根据反应温度、起始化合物、试剂和所用溶剂的类型而改变，但通常是在10分钟到3天的范围内，优选6小时到36小时的范围内。
在反应结束之后，可以通过本领域技术人员已知的普通方法从反应混合物中分离出醇解反应的所需化合物。例如，该反应混合物可以采用超滤膜浓缩，添加水，然后该混合物进一步采用超滤膜浓缩另外两次或三次，以除去过量醇，然后冻干所得浓缩物，获得目标化合物。另外，所需化合物可以不用分离而作为溶液用于改性蛋白。
如果必要，这样获得的所需化合物可以用普通技术比如凝胶过滤柱来进一步提纯。为了获得具有特定的所需平均聚合度或所需分子量的化合物，提纯的化合物可以进一步采用凝胶过滤色谱法分级。
应该指出的是，由于起始原料中的式(III)的一些单元被存在于溶剂或试剂中的水所水解，醇解反应的目标化合物可以含有其中R3是羟基的式(II)的结构单元。还应该指出的是，为了改进储存，可以将碱加入到目标化合物中。
如果本发明的所需共聚物是药理学可接受的盐，制备所述盐的方法不是特别限制的，只要它是本领域通常采用的方法。药理学可接受的盐可以通过将本发明的共聚物溶于有机溶剂中，将碱加入到这样获得的溶液中，然后收集沉淀的所得盐来获得。
可以采用各种策略来控制本发明的共聚物的平均分子量，交替排列的程度和组成比。
众所周知，马来酸酐单体往往与包括聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚在内的共聚单体交替聚合[例如，参见Comprehensive Polymer ScenceVol.4，Chain polymerization Part II，由G.C.Eastmond等人所编写，第377-422页，Pergamon Press(1989)；T.Yoshimoto等人，Biochemical Biophysical Research Communication Vol.148，876-882(1987)]。聚合物的平均分子量和排列可以由本领域的技术人员来控制(例如，参见T.Ohtsu和M.Kinoshita，Koubunshi Gouseino Jikkenhou，第125-154页，Kagaku-Dojin 1972)。另外，虽然马来酸酐往往与共聚单体交替聚合，但在共聚物中超过50mol％的组成比由马来酸酐单元组成的可能性是本领域技术人员所公知的(日本专利No.2621308，No.2701295，No.2803265，No.3271265，No.3035675和No.3106265，以及日本专利申请公开No.2003-105003和No.2003-105040)。
一般，为了获得具有较高分子量和较高交替排列度的聚合物，聚合应该在温和的条件下，比如低温和低引发剂浓度下进行。减低了引发剂的相对浓度的较高单体浓度和较低溶剂浓度也导致了较高的分子量和较高的交替排列度。
另外，为了获得具有低分子量和低交替排列度的聚合物，高温、高引发剂浓度、低单体浓度和高溶剂浓度是有利的。还有，在这种相对严格的聚合条件下和/或在单体混合物中的总单体的50mol％以上是马来酸酐的情况下，在所得共聚物中的马来酸酐单元的组成比可以超过50mol％。
用于聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚和马来酸酐的聚合条件的一些例子描述在T.Yoshimoto等人，Biochemical Biophysical ResearchCommunication Vol.148，876-882(1987)中。根据该文件，将聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚、马来酸酐、甲苯和过氧化苯甲酰(引发剂)混合，通过在80℃下回流7小时来进行聚合。所得聚合物具有13kD的分子量，并且具有8条PEG链和8个马来酸酐单元。共聚物的交替排列由它具有1∶1的组成比和马来酸酐单体往往与共聚单体交替共聚的事实来表明。如果需要具有低分子量和低交替排列度的共聚物，那么应该应用高引发剂浓度，低单体浓度和/或高溶剂浓度。例如，当在聚合中采用甲苯作为溶剂和聚合在1个大气压下进行时，该聚合可以在高达它的110℃的沸点下进行。还有，在沸点高于甲苯的不同溶剂的情况下的更高温度是优选的。在这些情况下，引发剂的类型需要适当选择，因为各引发剂具有不同的特定分解速率常数和一些引发剂在这些高温下分解。具有不同分解速率的许多引发剂在本领域中是已知的[例如，参见Polymer Handbook，第三版，pp.II/1-II/65，由J.Brandrup和E.Immergut所编写，John Wiley & Sons(1989)]。
用于在聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚和马来酸酐的共聚反应中改变组成比、分子量和交替排列度的可供选择的溶剂、引发剂和反应条件也公开在其它现有技术文件比如日本专利申请公开No.2003-105003中。二甲苯例如在1个大气压下具有高于甲苯的沸点(140℃)。还已知的是，共聚反应在某些情况下可以不用任何溶剂来进行，这除去了溶剂沸点对聚合温度的限制。还公开了各种可供选择的引发剂比如过氧化苯甲酰，二叔丁基过氧化物和过氧异丁酸叔丁酯和偶氮引发剂比如偶氮双异丁腈。还可以通过使用链转移剂来降低共聚物的平均分子量。
如果需要高于50％的在共聚物中的马来酸酐单元与总单体单元的组成比，应该采用在有或没有这种相对严格的聚合条件下的马来酸酐单体在单体混合物中的增高百分率。
如果使用本发明的共聚物或其药理学可接受的盐和蛋白或其类似物或变体制备药物活性成分，共聚物与蛋白或其类似物或变体的比率不是特别限制的，只要所得复合物具有所需的药物活性。通常，本发明的共聚物或其药理学可接受的盐与蛋白或其类似物或变体的重量比是0.01-100∶1，优选它是0.1-50∶1，还更优选它是1-10∶1，最优选它是1-1.5∶1。
在实际应用中，包含本发明的共聚物或其药理学可接受的盐和蛋白或其类似物或变体的药物活性成分通常以含有共聚物的蛋白溶液的形式或以含有本发明的共聚物或其药理学可接受的盐和蛋白或其类似物或变体的冻干形式制备。在后一种情况下，活性成分的冻干形式刚好在其使用之前溶解。另外，药物活性成分可以试剂盒的形式制备。在这种情况下，本发明的共聚物或其药理学可接受的盐和蛋白或其类似物或变体在不同的容器中储存，然后刚好在使用前混合以制备所需的药物活性成分。在这些不同形式中，冻干形式是最优选的。
如果本发明的共聚物或其药理学可接受的盐用作蛋白改性剂，共聚物或其药理学可接受的盐与蛋白或其类似物或变体的比率不特定限于任何具体值，只要获得所需的蛋白改性。通常，本发明的共聚物或其药理学可接受的盐与蛋白或其类似物或变体的重量比是0.01-100∶1，优选它是0.1-50∶1，还更优选它是1-10∶1，最优选它是1-1.5∶1。
如果本发明的共聚物用作蛋白改性剂，改性蛋白的方法不是特别限制的，只要它是通常用于改性蛋白的方法。例如，蛋白或其类似物或变体可以如下改性。
用于改性方法的溶剂是含有电解质的水溶液，其通常用于溶解蛋白，它的pH不限于任何特定值，只要它是在由于在本发明的蛋白改性剂中的一些羧基的离解而能使蛋白改性剂带负电荷以及蛋白或其类似物或变体能够带正电荷的范围内。例如，可以将该pH设定在3到蛋白或其类似物或变体的等电点的值，在这方面，应该指出的是，蛋白或其类似物或变体的等电点可以通过电泳来确定。
将蛋白改性剂溶于上述溶剂中，然后将这样获得的溶液加入到所述蛋白或其类似物或变体的水溶液中。如果必要，摇动所得溶液，以促进反应。如果需要，通过添加酸和/或碱，可以调节所得混合物的pH。所使用的本发明的蛋白改性剂与所述蛋白或其类似物或变体的比率不限于任何特定值，只要它获得对蛋白的所需改性。通常，该比率是0.01-100(按重量计)；优选0.1-50，更优选1-10；最优选它是1-1.5∶1。
用于改性方法的反应温度根据所用化合物和试剂而改变，但通常是0-100℃，优选4-40℃，最优选30-40℃。
反应时间根据反应温度、所用化合物，试剂和所用溶剂类型而改变，但通常是在5分钟到14天，优选1小时到12天，更优选5天到10天的范围内。
有时，在蛋白改性过程中，所用条件应使得共聚物中式(II)的结构单元的一些被转化为具有不同特性的式(II)的单元。例如，如果式(II)的结构单元中的R3是非羟基基团，用于改性方法的条件应使得所述R3基团的一些被水解，获得其中R3是羟基的式(II)的结构单元。
如上所述，本发明的复合物包含结合于本发明的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的至少一种蛋白或其类似物或变体。在所述复合物中，该蛋白或其类似物或变体与共聚物或其药理学可接受的盐通过化学键比如共价键(例如，席夫碱形成，酰胺键形成和酯键形成)，离子键或配位键，或者通过非化学键比如疏水相互作用、氢键、静电相互作用或亲和结合而彼此结合。
优选地，当在非还原条件下进行尺寸排阻色谱或SDS-PAGE时，本发明的复合物不以任何明显的程度以离解形式被检测到。更优选，当在非还原条件下进行尺寸排阻色谱和SDS-PAGE时，本发明的复合物不以任何明显的程度以离解形式被检测到。还更优选，另外，由于蛋白结构被共聚物及其药理学可接受的盐所改性，本发明的复合物的复合物的蛋白被ELISA检测的失败率是非常低的(优选，该失败率是≤20％，更优选≤15％，最优选≤10％)。
在本发明中，蛋白类似物被定义为通过在严格条件下(60-70℃，6×SSC)使用蛋白的cDNA杂交由动物细胞、体液或组织获得的cDNA文库克隆的cDNA所编码的蛋白。
在本发明中，蛋白变体被定义为通过在原始蛋白中取代、删除、增加或插入一个或多个氨基酸所获得并在可检测水平下具有原始蛋白的至少一部分活性的蛋白。
优选地，蛋白或其类似物或变体是碱性蛋白。更优选，该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成(osteoclastogenesis)抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体。最优选，该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体；在本发明中使用的OCIF、其类似物或其变体可以是天然型的，或者它可以是重组型的，它的来源不是特别限制的。天然型OCIF是指从人或非人动物得到的器官、体液、细胞培养液或培养基中提取、提纯和/或分离的天然形成的蛋白。重组型OCIF、其类似物或其变体是通过从在这些技术中常用的宿主比如原核宿主细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞比如人或非人细胞系中提取、提纯和/或分离所述蛋白得到的重组蛋白，所述细胞系已用包括编码OCIF、其类似物或其变体的多核苷酸的载体转化[例如，参见在EP-A-0816380(WO-A-96/26217)和WO-A-97/23614中公开的重组方法]。
在本发明中采用的OCIF、其类似物和其变体的来源不是特别限制的，它们可以来源于人或非人动物。优选地，它们可以来源于哺乳动物比如人，大鼠，小鼠，兔，狗，猫，牛，猪，绵羊或山羊；或者鸟类，比如家禽(fowl)，鹅，小鸡或火鸡。更优选地，它们来源于哺乳动物和最优选它们来源于人。
在本发明中采用的OCIF或其类似物可以是单体型OCIF(例如，在人体中，具有大约60000的分子量的单体，在非还原条件下通过SDS-PAGE测定)或二聚体型(例如，在人体中，具有大约120,000的分子量的二聚体，在非还原条件下通过SDS-PAGE测定)[参见EP-A-081630(WO-A-96/26217)]。它优选是具有约60,000的分子量的人OCIF的单体或者具有约120,000的分子量的人OCIF的二聚体，更优选是具有约120,000的分子量的人OCIF的二聚体，其中分子量在非还原条件下通过SDS-PAGE来测定。
已知的是，OCIF在细胞中作为在其氨基末端含有信号肽的多肽翻译，然后通过包括除去所述信号肽的加工来成熟[例如，参见在EP-A-0816380(WO-A-96/26217)和WO-A-97/23614中公开的重组方法]。用于本发明的OCIF、其类似物或其变体包括含有信号肽的多肽和其成熟形式。优选的实例包括具有序列表的SEQ.ID.No.1的氨基酸-21到+380的含信号肽的人OCIF和具有序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380的不含信号肽的成熟人OCIF。在这些当中，成熟人OCIF是特别优选的。
还已知的是，当其在宿主细胞中，尤其在原核宿主细胞比如大肠杆菌中作为重组蛋白表达时，可以将甲硫氨酸加入到OCIF的这种成熟形式、其类似物或其变体上。这通过将具有序列ATG(AUG)的核苷酸三联体加入到编码OCIF的成熟形式、其类似物或其变体的多核苷酸的5’端，再将所得多核苷酸插入到适合的表达载体中来获得。在氨基末端具有甲硫氨酸的所需成熟蛋白然后可以通过用所述重组表达载体转化的适合宿主细胞来表达。另外，通过将其它核苷酸三联体连接于在编码OCIF的成熟形式、其类似物或其变体的多核苷酸的5’端添加的ATG三联体旁边，一个或一个以上的氨基酸可以在邻接氨基末端甲硫氨酸的位置加入到所述蛋白中。可以根据普通方法从转化宿主细胞的培养基中提纯和分离在氨基末端具有甲硫氨酸的OCIF的目标成熟形式、其类似物或其变体。另外，可以在邻接甲硫氨酸并相较于甲硫氨酸更接近羧基末端的位置上，将一个或多个氨基酸插入在氨基末端具有甲硫氨酸的OCIF的成熟形式、其类似物或其变体中。
在本发明中，OCIF类似物是指天然存在于人或非人动物比如以上列举的那些的细胞、体液和/或器官中的多核苷酸编码的蛋白。这些类似物的具体优选实例包括OCIF2，OCIF3，OCIF4和OCIF5[参见EP-A-0816380(WO 96/26127)]。这种OCIF类似物或其活性片段可以通过诸如以下的方法来获得从人或非人动物的细胞、器官、组织或体液中提取RNA；使用逆转录酶合成与所述RNA互补的cDNA的第一条链，然后使用第一条链作为模板用DNA聚合酶合成所述cDNA的第二条链；将这样获得的双链cDNA插入到适合的常用表达载体中；然后用这样获得的载体转化适合的常用宿主细胞；然后使用杂交技术比如在严格条件下使用OCIF cDNA或其片段作为探针的噬菌斑杂交或噬菌体杂交筛选生产所需肽的宿主[参见EP-A-0816380(WO-A-96/26217)]；最后用这样获得的宿主细胞通过普通技术表达所需OCIF类似物。
在本发明中，OCIF变体是指蛋白，其具有在OCIF或其类似物的氨基酸序列中已经替代、删除、增加或插入一个或一个以上的氨基酸残基的氨基酸序列，并且仍然具有至少某些OCIF活性。这种OCIF变体可以例如通过下列方法来获得采用聚合酶链式反应方法(下文称为PCR)，基因重组方法或者用核酸外切酶或核酸内切酶比如限制性内切酶的核酸酶消化方法在编码OCIF或其类似物的核苷酸序列中替换、删除、添加和/或插入一个核苷酸或一个以上的核苷酸；用其中已经插入了编码所需OCIF变体的所得核苷酸的表达载体转化真核宿主细胞比如动物细胞或原核宿主细胞比如大肠杆菌；然后根据本领域技术人员公知的方法从由所述被转化宿主的细胞培养物形成的含蛋白的级分中提取、提纯和/或分离所需肽。
其中从OCIF多肽的羧基末端删除相当一部分的氨基酸序列的OCIF的截短形式也已知保持了至少一些OCIF活性[例如，参见EP-A-0816380(WO-A-96/26217)和WO-A-97/23614]。保持了完全OCIF多肽的至少一些活性的这种截短类型的OCIF也包括在本发明的OCIF变体中。
此外，与免疫球蛋白结构域比如Fc结构域融合(例如，其中人IgG的Fc结构域连接于OCIF的羧基末端的融合多肽)并且保持了完全OCIF多肽的至少一些活性的OCIF或其截短形式是已知的(参见WO-A-97/23614)，这种融合蛋白也包括在本发明的OCIF变体中。
任何天然形成的OCIF或其类似物或重组OCIF或其类似物或变体可以含有翻译后连接于OCIF或其类似物或变体的糖。含有糖链的天然形成的OCIF或其类似物可以由使用普通技术从人或非人动物中得到的细胞培养物、组织、器官、体液或细胞系获得。含有糖链的重组OCIF或其类似物或变体可以由使用包括编码任何OCIF或其类似物或变体比如以上描述和举例的那些的核苷酸序列的载体转化的真核宿主细胞的培养物中获得。能够翻译后修饰OCIF或其类似物或变体以便连接糖链的可以使用的适合宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢细胞和COS细胞[Yasuda，H.等人，Endocrinology，139，1329-1337(1998)]。含有这种糖链的OCIF或其类似物或变体适用于形成本发明的复合物。在含有糖链的OCIF或其类似物或变体中的糖链可以用聚合物、多糖或改性多糖人工改性(尤其是通过酶促反应)。
含有本发明的共聚物或其药理学可接受的盐和蛋白或其类似物的本发明的药物组合物可以是根据上述方法制备的溶液或者通过冻干该溶液获得的产品。另外，这种药物组合物可以根据可供选择的方法来配制，或者它可以是试剂盒的形式。在后一种情况下，本发明的共聚物或其药理学可接受的盐和蛋白或其类似物或变体在不同容器中储存，然后恰好在使用前混合以制备所需的药物组合物。
本发明的药物组合物可以任选进一步包含碱。碱不限于任何特定碱，只要它是在药物组合物中常用的碱。这种碱的例子包括无机碱比如碱金属碳酸盐(例如碳酸钠，碳酸钾和碳酸锂)，碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠，碳酸氢钾，和碳酸氢锂)，碱金属氢化物(例如氢化锂，氢化钠和氢化钾)，碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钡，和氢氧化锂)，碱金属氟化物(例如氟化钠和氟化钾)；和有机碱比如碱金属醇盐(例如甲醇钠，乙醇钠，甲醇钾，乙醇钾，叔丁醇钾和甲醇锂)，碱金属硫醇(例如甲基硫醇钠和乙基硫醇钠)，N-甲基吗啉，三乙胺，三丙胺，三丁基胺，二异丙基乙基胺，二环己基胺，N-甲基哌啶，吡啶，4-吡咯烷基吡啶，甲基吡啶，4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，2，6-二(叔丁基)-4-甲基吡啶，喹啉，N，N-二甲基苯胺，N，N-二乙基苯胺，1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)，1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。在这些碱当中，碱金属氢氧化物是优选的，氢氧化钠是特别优选的。在这方面，应该指出的是，碱的一部分或全部可以与本发明的共聚物形成盐。
根据本发明的药物组合物的实例包括选自本发明的共聚物或其药理学可接受的盐中的至少一种物质和选自下列之中的蛋白或其类似物或变体的复合物bFGF(用于治疗或预防缺血性动脉疾病和顽固性皮肤溃疡)，EGF(用于治疗或预防溃疡性疾病比如溃疡性结肠炎和长期角膜上皮疾病)，PGDF(用于治疗伤口)，BDNF和NGF(用于治疗或预防中枢神经系统疾病比如帕金森氏症和阿尔茨海默病)，HGH(用于治疗或预防生长激素缺乏，生长激素分泌过少综合症，特纳氏综合症和软骨发育不全)，HGF(用于治疗或预防糖尿病，动脉硬化症比如脑梗塞和肝炎纤维化)和VEGF(缺血性动脉疾病和外周动脉阻塞性疾病)。
根据本发明的药物组合物的一个特别优选的例子包括选自OCIF、其类似物和变体中的至少一种物质和选自本发明的共聚物或其药理学可接受的盐中的至少一种物质的复合物。这种药物组合物特别适合于预防或治疗骨代谢疾病。在本发明中，这种骨代谢疾病包括特征在于患者骨质大量减少和其中有必要抑制骨再吸收或骨再吸收速率以预防或治疗所述疾病的任何疾病。
可以采用本发明的药物组合物治疗或预防的骨代谢疾病包括原发性骨质疏松症(老年性骨质疏松，绝经期后骨质疏松，和特发性少年骨质疏松症)，内分泌性骨质疏松(甲状腺功能亢进症，甲状旁腺机能亢进，库欣综合症和肢端肥大症)；性腺机能减退伴发的骨质疏松症(垂体机能减退，克兰费尔特氏综合症(Klinefelter syndrome)，和先天性卵巢发育不全(Turner syndrome))；遗传和先天性骨质疏松症(洛布斯坦氏病(osteogenesis imperfecta)，高胱氨酸尿，Menkes综合征，和家族性植物神经失调综合征(Riley-Day Syndrome))；四肢的由于重量载荷减轻或固定和制动所导致的骨质减少；佩吉特病(Paget’s disease)；骨髓炎；由于骨损失导致的感染灶；由实体癌(乳腺癌，肺癌，肾癌，和前列腺癌)造成的血钙过高；血液恶性病(多发性骨髓瘤，淋巴瘤和白血病)；特发性高钙血症；甲状腺机能亢进或肾功能障碍并发的高钙血症；由类固醇治疗所导致的骨质减少；由于给予其它药物所导致的骨质减少(例如免疫抑制剂比如甲氨喋呤和环孢霉素A，肝素，和抗癫痫药)；肾功能障碍并发的骨质减少；外科手术或消化器官疾病并发的骨质减少(例如小肠梗阻，大肠梗阻，慢性肝炎，胃切除术，原发性胆汁性肝硬化，和肝硬化)；由于各种类型的风湿病比如类风湿性关节炎导致的骨质减少，由于各种风湿病比如类风湿性关节炎导致的骨关节炎(osteoclasis)和关节破坏；Mutilans型类风湿性关节炎；骨关节炎；牙周骨损失；癌的骨转移(溶骨转移)；外伤性损伤、高雪氏病(Gaucher’s disease)、镰状细胞性贫血、系统性红斑狼疮或非外伤性损伤并发的骨坏死或骨细胞死亡；骨质营养不良比如肾性骨营养不良；低磷酸酯酶症或糖尿病并发的骨质减少；营养失调或饮食障碍所并发的骨质减少；和其它骨质减少。此外，在本发明中，由于上述实体癌、癌的骨转移(溶骨转移)或血液恶性病导致的恶病质也包括在骨代谢疾病中(参见日本专利申请(Kokai)No.2000-178200)。
如上所述的根据本发明的药物组合物可以安全地以口服或非口服方式给药于人或除了人以外的动物。药物组合物的剂量形式可以适当地根据疾病的类型、疾病的程度以及患者的状态、年龄、性别和体重来选择。例如，该药物组合物可以以片剂、胶囊、粉末、颗粒或糖浆的形式口服；以静脉内注射的形式单独或与普通助剂比如葡萄糖、氨基酸等结合注射，或者单独肌内、皮下、皮内或腹膜内注射；以糊剂的形式透皮给药；以滴鼻剂的形式经鼻给药；以透粘膜制品的形式经粘膜给药或给药于口腔；或者以栓剂的形式直肠内给药。这些制剂可以采用在医药领域中常用的公知的助剂比如赋型剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、香味剂、增溶剂、悬浮剂、着色剂、pH调节剂、防腐剂、胶化剂、表面活性剂和涂层剂以通常方式配制。
如果药物组合物以片剂的形式制备，可以采用本领域已知的各种载体。此类载体的实例包括赋型剂比如乳糖，蔗糖，氯化钠，葡萄糖，尿素，淀粉，碳酸钙，高岭土，结晶纤维素和硅酸；粘结剂比如水，乙醇，丙醇，简单糖浆，葡萄糖溶液，淀粉溶液，明胶溶液，羧甲基纤维素，虫胶，甲基纤维素，磷酸钾和聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂比如干燥淀粉，海藻酸钠，琼脂粉，昆布多糖粉，碳酸氢钠，碳酸钙，聚氧化乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，月桂基硫酸钠，硬脂酸甘油一酯，淀粉和乳糖；崩解抑制剂比如蔗糖，硬脂酸甘油酯，可可脂和氢化油；吸收加速剂比如季铵碱和月桂基硫酸钠；增湿剂比如甘油和淀粉；吸收剂比如淀粉，乳糖，高岭土，膨润土和胶体硅酸；和润滑剂比如纯化滑石，硬脂酸酯，硼酸粉末和聚乙二醇。另外，这种片剂可以用普通涂料包覆，如果必要。这种涂层片剂的实例包括糖衣片剂，明胶包衣片剂，肠溶片，薄膜衣片剂，双层片剂和多层片剂。
如果药物组合物以药丸的形式制备，可以采用本领域已知的各种载体。此类载体的实例包括赋型剂比如葡萄糖，乳糖，可可脂，淀粉，氢化植物油，高岭土和滑石；粘结剂比如阿拉伯树胶粉，黄芪胶粉，明胶和乙醇；和崩解剂比如昆布多糖琼脂。
如果药物组合物以栓剂的形式制备，可以采用本领域已知的各种载体。此类载体的实例包括聚乙二醇，可可脂，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成甘油酯。
如果药物组合物以注射剂的形式制备，优选的是，将溶液或悬浮液形式的组合物灭菌，并制成与血液等渗。当制备溶液、乳液、悬浮液或基本上均匀的水溶液形式的这种组合物时，可以使用本领域已知的各种稀释剂。此类稀释剂的实例包括水，乙醇，丙二醇，乙氧基化异硬脂醇，丙氧基化(polyoxylated)异硬脂醇和聚氧化乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯。在这种情况下，该药物组合物可以进一步含有足以保持与血液等渗的量的普通盐，葡萄糖或甘油。此外，该药物组合物还可以含有普通增溶剂，缓冲剂，增滑剂，pH调节剂，稳定剂或溶解剂。这种注射剂可以冻干。
另外，如果需要，本发明的药物组合物还可以含有着色剂，防腐剂，香料，香味剂，甜味剂或其它药物。
在本发明的药物组合物中含有的OCIF或其类似物或变体和共聚物或其药理学可接受的盐的复合物的量不限于任何特定值，但它通常是在0.1-70wt％，优选1-30wt％的范围内。
在本发明中，在本发明的药物组合物中含有的OCIF或其类似物或变体和共聚物或其药理学可接受的盐的复合物的剂量取决于各种因素，包括患者的状况和年龄，给药途径和药物形式。一般，每次给药于成人的量是在1-50mg/kg的上限和0.001-0.1mg/kg的下限的范围内，其中0.01-1mg/kg的范围是优选的，0.1-1mg/kg的范围是更优选的。
根据本发明的药物组合物应该每几个月给药一次，每个月给药一次，每几天给药一次，每天给药一次或每天给药几次，取决于在药物组合物中含有的成分的类型，给药途径和药物形式。当该组合物包括根据本发明用作治疗或预防骨代谢疾病的药剂的OCIF或其类似物或变体和共聚物或其药理学可接受的盐的复合物时，它应该每几个月给药一次，每个月给药一次，每几天给药一次，每天给药一次或每天给药几次，取决于在治疗或预防骨代谢疾病的药剂中含有的活性成分的类型，给药途径和药物形式。
本发明的共聚物和其药理学可接受的盐可用作聚合物改性.剂，其能提供具有均匀性能，尤其减少与蛋白的无序交联结构的形成，更好地保持蛋白活性和在所述复合物给药之后优异的蛋白在血液中的保留的复合物。这使得它特别有效作为改性具有有用的药物活性的蛋白的药物性能的改性剂。
以下实施例、参考实施例和试验实施例用来进一步说明本发明，但决不用来限制本发明的范围。在以下实施例中，m和R3如以上对于式(I)和(II)所定义，“comp.Ratio”是组成比[即，结构单元(I)和(II)的比率]，“av.deg.pol.”是所制备的共聚物的平均聚合度和“hyd.Ratio”是所制备的共聚物的水解比[即，其中R3是-OH的结构单元与其中R3不是-OH的结构单元的平均比率]。
实施例1其中m＝6-16，R3＝OH，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约10∶0的聚(PEG500-MA)水解产物[聚(PEG500-MA)h](化合物1)的制备使用其中聚氧化乙烯侧链具有约500的平均分子量和主链的平均聚合度是30-40的聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝6-16，alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的共聚物[AM-0530K，由NOFCorporation生产(下文称为“聚(PEG500-MA)”)]作为起始原料。将50ml的蒸馏水加入到3g的聚(PEG500-MA)中，以溶解所述起始原料，这样获得的溶液在40℃下搅拌15小时。所得溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，所得浓缩物冻干，获得1.3g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG500-MA)h(化合物1)。
聚(PEG500-MA)h(化合物1)用凝胶过滤如下所示提纯。将100mg的聚(PEG500-MA)h(化合物1)溶于4ml的0.001N氢氧化钠溶液。将该溶液分为四批，将每批1ml施加于凝胶过滤柱(PD-10，由Amersham-Pharmacia制造)。丢弃前1ml的洗脱液。然后将1.5ml的0.001N氢氧化钠溶液施加于各柱，从柱中洗脱另外1.5ml，并丢弃。然后将2.5ml的0.001N氢氧化钠溶液施加于各柱，从柱中洗脱另外2.5ml，它是含有提纯聚(PEG500-MA)h(化合物1)的级分。将来自四根柱子的提纯级分合并，获得10ml的标题化合物的提纯溶液。在提纯步骤之后测定的收率(通过分光光度法在提纯之前和之后在210nm下测量聚(PEG500-MA)h的吸收率来测定)是80％(80mg的聚合物)，在提纯溶液中的浓度测得为8mg/ml。
标题化合物的羧基含量通过电导滴定如下所示来测定。将7.5ml的以上获得的提纯标题化合物的溶液(含有60mg的标题化合物)用蒸馏水配制成50ml的体积，这样获得的溶液用1M氢氧化钠水溶液调至pH12。以0.1ml的增量将0.1M的盐酸加入到该溶液中，在各次添加盐酸之后测定溶液的pH和电导率。然后由在电导率缓冲区(即，其中标题化合物的共聚物的羧基起缓冲剂的作用的电导率与盐酸的添加量的关系曲线的区域；所述区域对应于大约10.5-3的pH)添加的0.1M盐酸的量计算共聚物的羧基含量；在电导率缓冲区中使用的盐酸的摩尔量等于在标题化合物的共聚物上的羧基的摩尔量。结果，羧基含量/1g的标题化合物测得是3.22mmol。由此计算出该组成比是1∶1.07。该数字应用于其中使用相同起始原料的以下实施例。
实施例2其中m＝28-38，R3＝OH，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝10-15和hyd.ratio＝约10∶0的聚(PEG1500-MA)水解产物[聚(PEG1500-MA)h](化合物2)的制备使用其中聚氧化乙烯具有约1500的平均分子量和主链的平均聚合度是10-15的聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝28-38，Alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的共聚物[AM-1510K，由NOFCorporation生产(下文称为“聚(PEG1500-MA)”)]作为起始原料。将25ml的蒸馏水加入到1.5g的聚(PEG1500-MA)中，以溶解所述起始原料，这样获得的溶液在室温下搅拌20小时。在该时间结束时，该溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜按照与以上实施例1所述相同方式浓缩，冻干所得浓缩物，获得0.8g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG1500-MA)h(化合物2)。
标题化合物聚(PEG1500-MA)h(化合物2)的羧基含量按照与以上实施例1所述相同方式测定，结果，测得羧基含量/1g的标题化合物是1.63mmol。由此计算出组成比是1∶1.4。该数字应用于其中使用相同起始原料的以下实施例。
实施例3其中m＝6-16，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约0∶10的聚(PEG500-MA)的氨解产物[聚(PEG500-MA)a](化合物3)的制备将9.5g的氨水(氨浓度28wt％)加入到1g的聚(PEG500-MA)(AM-0530K，由NOF Corporation生产)中，以溶解所述起始原料，这样获得的溶液在室温下搅拌16小时。在该时间结束时，将这样获得的溶液通过再生纤维素膜(具有12,000-14,000的分子量截止，由Sanko Junyaku Co.，Ltd.生产，型号UC36-32-100)用1L的0.1wt％醋酸水溶液渗析1天，然后进一步用1L的水渗析1天。在更新1L水之后，它进一步渗析另外1天。通过进行这种渗析，从产物中清除过量的氨。这样获得的溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，冻干所得浓缩物，获得0.99g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG500-MA)a(化合物3)。
通过电导滴定按照与以上实施例1所述相同方式测定在1g聚(PEG500-MA)a(化合物3)中的羧基含量，结果，测得羧基含量/1g的标题化合物是1.55mmol。
在所用反应条件下，可能的是，马来酸酐残基不仅经历了由于氨解导致的开环反应，而且被存在于反应体系中的水所水解。经历了氨解的马来酸酐残基与经历了水解的马来酸酐残基的比率如下计算。
在实施例1中，测定在1g的聚(PEG500-MA)h(化合物1)中的羧基含量。这获得了羧基含量的数值，当所有马来酸残基被完全水解时(3.22mmol/1g的聚合物)。由该结果，通过计算测定聚(PEG500-MA)h(化合物1)的重量/mol的羧基(1/3.22×10-3g)和聚(PEG500-MA)h(化合物1)的重量/mol的开环马来酸残基[2×聚(PEG500-MA)h(化合物1)的重量/mol的开环马来酸残基，因为具有2个羧基/完全水解的马来酸残基]，分别地获得了311g和621g的结果。由这些值测定聚(PEG500-MA)的重量(即，在水解之前的共聚物的重量)/g官能团，以及通过将氨加入到聚(PEG500-MA)中所获得的聚(PEG500-MA)a(化合物3)的重量/g官能团。具体地说，通过由完全水解的共聚物的重量减去水分子的分子量(18g)获得了聚(PEG500-MA)的重量(即，在水解之前的共聚物的重量)/mol的马来酸酐残基，获得了603g的数值。通过将氨分子的分子量(17g)与聚(PEG500-MA)的重量相加而获得了聚(PEG500-MA)a(化合物3)的重量/mol的羧基，获得了620g的数值。通过计算(1g/620)，由该值测定其中所有马来酸酐残基经历了氨解(即，无水解)的理论羧基含量/1g的聚(PEG500-MA)a(化合物3)，结果是1.61mmol。由羧基含量/1g的其中所有马来酸酐残基被水解的聚(PEG500-MA)h(化合物1)，理论羧基含量/1g的其中所有马来酸酐残基被氨解的聚(PEG500-MA)a(化合物3)，以及以上测定的实际羧基含量/1g的聚(PEG500-MA)a(化合物3)(即1.55mmol)计算在标题化合物中被氨解的马来酸酐残基与在起始原料中的马来酸酐残基的总数的比率，测得是1.0。因此，证实了基本上所有马来酸酐残基已经氨解，基本上没有发生水解。
实施例4其中m＝6-16，R3＝NMe2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约0∶10的二甲胺和聚(PEG500-MA)的反应产物[聚(PEG500-MA)dma](化合物4)的制备将71g的二甲胺水溶液(二甲胺浓度50wt％)加入到10g的聚(PEG500-MA)(AM-0530K，由NOF Corporation生产)中以溶解它，这样获得的溶液在室温下搅拌20小时。在该时间结束时，将这样获得的溶液通过再生纤维素膜(具有12,000-14,000的分子量截止，由SankoJunyaku Co.，Ltd.生产，型号UC36-32-100)用10L的0.1wt％醋酸水溶液渗析1天，然后进一步用10L的水渗析1天。在更新10L水之后，它进一步渗析另外1天。通过进行这种渗析，从产物中清除过量的二甲胺。这样获得的溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，冻干所得浓缩物，获得6.3g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG500-MA)dma(化合物4)。
按照与以上实施例1所述相同方式测定在1g聚(PEG500-MA)dma(化合物4)中的羧基含量，结果是1.53mmol。采用类似于用于氨解产物的实施例3中的计算法，通过计算测定其中所有马来酸酐残基已经胺解的在1g的聚(PEG500-MA)dma(化合物4)中的理论羧基含量，结果是1.54mmol。由这些结果计算在标题化合物中经历胺解的马来酸酐残基与在起始原料中的马来酸酐残基的总数的比率，测得是1.0。因此，证明了基本上所有的马来酸酐残基已经被二甲胺所胺解，基本上没有发生水解。
实施例5其中m＝6-16，R3＝NH(CH2CH(OH)CH3)，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约0∶10的1-氨基-2-丙醇和聚(PEG500-MA)的反应产物[聚(PEG500-MA)ipa](化合物5)的制备将14g的1-氨基-2-丙醇加入到1.5g的聚(PEG500-MA)(AM-0530K，由NOF Corporation生产)中以溶解它，这样获得的溶液在室温下搅拌16小时。在该时间结束时，将300ml的蒸馏水加入到该溶液中，进一步添加冰醋酸，以中和该溶液。这样获得的溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，从而获得50ml的浓缩物。将300ml的蒸馏水加入到该浓缩物中，所得溶液以相同方式再次浓缩。用蒸馏水稀释该浓缩物，随后再浓缩的该循环重复5次，以清除过量的1-氨基-2-丙醇。冻干所得浓缩物，获得1.3g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG500-MA)ipa(化合物5)。
按照与以上实施例1所述相同方式测定在1g聚(PEG500-MA)ipa(化合物5)中的羧基含量，结果是1.55mmol。采用类似于用于氨解产物的实施例3中的计算法，通过计算测定其中所有马来酸酐残基已经胺解的在1g的聚(PEG500-MA)ipa(化合物5)中的理论羧基含量，结果是1.47mmol。由这些结果计算在标题化合物中经历胺解的马来酸酐残基与在起始原料中的马来酸酐残基的总数的比率，测得是1.0。因此，证明了起始原料中基本上所有的马来酸酐残基已经被1-氨基-2-丙醇所胺解，基本上没有发生水解。
实施例6其中m＝6-16，R3＝OCH2CH3，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约4∶6的乙醇和聚(PEG500-MA)的醇解反应产物[聚(PEG500-MA)ea](化合物6)将25g的无水乙醇加入到1.5g的聚(PEG500-MA)(AM-0530K，由NOF Corporation生产)中以溶解它，这样获得的溶液在室温下搅拌16小时。在该时间结束时，将300ml的水加入到该溶液中，所得溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，从而获得50ml的浓缩物。将300ml的蒸馏水加入到该浓缩物中，所得溶液以相同方式再次浓缩。用蒸馏水稀释该浓缩物，随后再浓缩的该循环重复5次，以清除过量乙醇。冻干所得浓缩物，获得0.8g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG500-MA)ea(化合物6)。
按照与以上实施例1所述相同方式测定在1g聚(PEG500-MA)ea(化合物6)中的羧基含量，结果是2.16mmol。采用类似于用于氨解产物的实施例3中的计算法，通过计算测定其中所有马来酸酐残基已经醇解的在1g的聚(PEG500-MA)ea(化合物6)中的理论羧基含量，结果是1.47mmol。由该结果计算在标题化合物中经历醇解的马来酸酐残基与在起始原料中的马来酸酐残基的总数的比率，测得是0.6。因此，可以看出起始原料中的60％马来酸酐残基已经被醇解，剩余40％的马来酸酐残基经历了水解。
实施例7其中m＝28-38，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝10-15和hyd.ratio＝约4∶6的聚(PEG1500-MA)的氨解产物[聚(PEG1500-MA)a](化合物7)的制备将14.5g的氨水(氨浓度28wt％)加入到1.5g的聚(PEG1500-MA)(AM-1510K，由NOF Corporation生产)中以溶解它，这样获得的溶液在室温下搅拌20小时。在该时间结束时，将300ml的蒸馏水加入到该溶液中，进一步添加冰醋酸以中和所述溶液。所得溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，从而获得50ml的浓缩物。将300ml的蒸馏水加入到该浓缩物中，所得溶液以相同方式再次浓缩。用蒸馏水稀释该浓缩物，随后再浓缩的该循环重复5次，以清除过量氨。冻干所得浓缩物，获得0.7g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG1500-MA)a(化合物7)。
按照与以上实施例1相同方式测定在1g聚(PEG1500-MA)a中的羧基含量，结果是1.12mmol。与实施例3的聚(PEG500-MA)a的氨解一样，具有在聚(PEG1500-MA)起始原料中的马来酸酐残基同时经历了氨解和水解的可能性。因此，经历了氨解的马来酸酐残基与经历了水解的马来酸酐残基的比率如下计算。
在实施例2中，测定了在1g的聚(PEG1500-MA)h(化合物2)中的羧基含量。这获得了当所有马来酸残基被完全水解时的羧基含量的数值(1.63mmol/1g的聚合物)。由该结果测定聚(PEG1500-MA)h(化合物2)的重量/mol的羧基(1/1.63×10-3g)和聚(PEG1500-MA)h(化合物2)的重量/mol的开环马来酸残基[2×聚(PEG1500-MA)h(化合物2)的重量/mol的开环马来酸残基，因为具有2个羧基/完全水解的马来酸残基]，分别地获得了613g和1,227g的结果。由这样获得的聚(PEG1500-MA)h的重量，并且采用与以上实施例3类似的方法，计算其中所有马来酸酐残基经历了氨解的理论羧基含量/1g的聚(PEG1500-MA)a(化合物7)，结果是0.82mmol。由这些值以及以上测定的聚(PEG1500-MA)a(化合物7)的实际羧基含量(即1.12mmol)通过计算测定在标题化合物中经历了氨解的马来酸酐残基与在起始原料中的马来酸酐残基的总数的比率，测得是0.6。因此，证明了聚(PEG1500-MA)起始原料中的60％马来酸酐残基已经氨解，剩余40％的马来酸酐残基经历了水解。
实施例8其中m＝28-38，R3＝NMe2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝10-15和hyd.ratio＝约0∶10的二甲胺和聚(PEG1500-MA)的反应产物[聚(PEG1500-MA)dma](化合物8)的制备将11g的二甲胺水溶液(具有50wt％的二甲胺浓度)加入到1g的聚(PEG1500-MA)(AM-1510K，由NOF Corporation生产)中以溶解它，这样获得的溶液在室温下搅拌20小时。在该时间结束时，将300ml的蒸馏水加入到该溶液中，进一步添加冰醋酸以中和所述溶液。所得溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由MilliporeCorporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，从而获得50ml的浓缩物。将300ml的蒸馏水加入到该浓缩物中，所得溶液以相同方式再次浓缩。用蒸馏水稀释该浓缩物，随后再浓缩的该循环重复5次，以清除过量二甲胺。冻干所得浓缩物，获得呈油状化合物的标题化合物聚(PEG1500-MA)dma(化合物8)。
按照与以上实施例1相同方式测定在1g聚(PEG1500-MA)dma(化合物8)中的羧基含量，计算结果是0.82mmol。采用与实施例3所用方法类似的方法，通过计算测得其中所有马来酸酐残基已经胺解的在1g的聚(PEG1500-MA)dma中的理论羧基含量是0.80mmol。由这些结果通过计算测定在标题化合物中经历胺解的马来酸酐残基与在起始原料中的马来酸酐残基的总数的比率，测得是1.0。因此，证明了基本上所有的马来酸酐残基已经被二甲胺所胺解。
实施例9实施例1-8的聚合物改性剂与OCIF的复合物的制备将在实施例1-8中制备的各聚合物改性剂溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH6.0(它是通过将含有10mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠的溶液与含有10mM磷酸二氢钠和150mM氯化钠的溶液以获得具有6.0的pH的缓冲液的适当比率混合所获得的溶液)，从而制备具有1-20mg/ml的改性剂浓度的溶液。进而对于各改性剂的各溶液，将0.625ml的所制备的聚合物改性剂溶液和0.625ml的含有提纯的人成熟OCIF的溶液(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)[蛋白浓度2mg/ml，介质PBS(pH6.0)]混合，这样获得的混合物在4-37℃下静置至少1小时，从而获得含有用实施例1-8的聚合物改性剂改性的OCIF的系列溶液[介质PBS(pH6.0)]，其中在各溶液中改性剂与OCIF的比率由所添加的改性剂溶液的浓度和反应条件来决定。在以下试验实施例2中，在表6中示出了用于所制备的一些复合物的改性剂/OCIF的重量比(和制备它们的条件)。如在以下实施例11中所说明测定各所得复合物的分子大小。如在以下试验实施例3中所述，测定复合物中的OCIF用ELISA的检出率。
另外，对于各聚合物改性剂，用聚合物改性剂改性的OCIF的溶液按照相同的方式制备，只是使用具有7.4的pH的PBS作为介质。
实施例10其中m＝6-16，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约3.1∶6.9的聚(PEG500-MA)氨解产物的钠盐[聚(PEG500-MA)a-Na](化合物9)的制备使用其中聚氧化乙烯侧链具有约500的平均分子量和主链的平均聚合度是30-40的聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝6-16，alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的共聚物(AM-0530K，由NOFCorporation生产，批号M34529)[下文称为“聚(PEG500-MA)”]作为起始原料。将61ml的0.5M氨/1，4-二恶烷溶液加入到10.1g的所述聚(PEG500-MA)起始原料中，所得溶液在25℃下搅拌20小时。在该时间结束时，将200ml的二乙醚和100ml的0.2M氢氧化钠水溶液加入到该溶液中，再将混合物强烈振荡大约3分钟。在使有机层和含水层相分离之后，收集下层。将200ml的二乙醚和60ml的1，4-二恶烷加入到收集的层中，这样获得的溶液再次强烈振荡。在相分离之后，收集所形成的下层，然后冻干，获得10.1g的呈黄色固体的标题化合物聚(PEG500-MA)a钠盐(化合物9)。
标题聚合物的羧基含量和水解比如以下在试验实施例1中所述测定。
实施例11其中m＝6-16，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约1.4∶8.6的聚(PEG500-MA)氨解产物[聚(PEG500-MA)a](化合物10)的制备将9.5g的28w/w％氨水加入到1g的聚(PEG500-MA)(AM-0530K，由NOF Corporation生产，批号M34529)中以溶解它，这样获得的溶液在25℃下搅拌4小时。在该时间结束时，将250ml的0.28％氨水加入到该溶液中，所得溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩，冻干这样得到的浓缩物，获得0.8g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG500-MA)a(化合物10)。
标题聚合物的羧基含量和水解比如以下在试验实施例1中所述测定。
实施例12其中m＝6-16，R3＝NMe2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约2.9∶7.1的二甲胺和聚(PEG500-MA)的反应产物[聚(PEG500-MA)dma-Na盐](化合物11)的制备将35g的50w/w％二甲胺水溶液加入到5g的聚(PEG500-MA)(AM-0530K，批号M34529，由NOF Corporation生产)中以溶解它，所得溶液在25℃下搅拌3小时，然后进一步在4℃下搅拌16小时。在该时间结束时，添加100ml的0.1M氢氧化钠水溶液，冻干这样获得的溶液，获得5.4g的呈黄色固体的标题化合物聚(PEG500-MA)dma-钠盐(化合物11)。
标题聚合物的羧基含量和水解比如以下在试验实施例1中所述测定。
实施例13其中m＝6-16，R3＝OH，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝30-40和hyd.ratio＝约10∶0的聚(PEG500-MA)水解产物[聚(PEG500-MA)h](化合物12)的制备将17ml的蒸馏水加入到1g的聚(PEG500-MA)(AM-0530K，由NOFCorporation生产，批号M34529)中以溶解它，所得溶液在40℃下搅拌4小时。在该时间结束时，将250ml的0.28w/w％氨水加入到其中，这样获得的溶液采用由聚醚砜(具有10,000的分子量截止，由Millipore Corporation生产，型号PBGC07610)制备的超滤膜浓缩。冻干这样得到的浓缩物，获得0.7g的呈油状化合物的标题化合物聚(PEG500-MA)h(化合物12)。
标题聚合物的羧基含量和水解比如以下在试验实施例1中所述测定。
实施例14实施例10-13的聚合物改性剂与OCIF的复合物的制备将在实施例10-13中制备的各聚合物改性剂溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.0(它是通过将含有10mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠的溶液与含有10mM磷酸二氢钠和150mM氯化钠的溶液以获得具有7.0的pH的缓冲液的适当比率混合所获得的溶液)，从而制备具有1.25-105mg/ml的改性剂浓度的溶液。进而对于各聚合物改性剂，将这样获得的聚合物改性剂溶液和含有提纯的人成熟OCIF的溶液(如在WO96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)[蛋白浓度0.25-14mg/ml，介质PBS(pH6.0)]以1∶1体积比混合，获得了具有不同的改性剂与OCIF的重量比的溶液。采用1M盐酸溶液或1M氢氧化钠水溶液将这样获得的溶液调至pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0或7.4。将这样获得的各溶液在25℃下静置12小时到1周，以获得本发明的聚合物改性剂和OCIF的复合物的溶液。所制备的溶液在4℃下储存。所得复合物的分子大小如在以下试验实施例6和11中所说明的那样测定。如在以下试验实施例8中所述，测定复合物中的OCIF用ELISA的检出率。
实施例15其中m＝6-16，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.如以下所示和hyd.ratio＝约1.4∶8.6的具有可控分子大小的聚(PEG500-MA)的氨解产物的钠盐[聚(PEG500-MA)a-钠盐](化合物13-19)的制备将100mg的在实施例10中获得的聚(PEG500-MA)a的钠盐(化合物9)溶于1ml的磷酸盐缓冲盐水溶液(通过以适当比率将含有10mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠的水溶液与含有10mM磷酸二氢钠和150mM氯化钠的水溶液混合所获得的具有7.4的pH的PBS)。这样获得的溶液通过凝胶过滤色谱法分级。如下所示采用两种不同的凝胶过滤条件
(1)采用Superose 6的分级方法(下文称为SRF方法)柱子Superose 6HR 10/30Amersham Bioscience柱子温度8℃流动相PBS(7.4)检测波长280nm流速0.3ml/min注射到柱子中的量100μl(2)采用Superdex 200的分级方法(下文称为SDF方法)柱子Superdex 200HR 16/60Amersham Bioscience柱子温度室温流动相PBS(7.4)检测波长280nm流速2ml/min注射到柱子中的量5ml用x到y分钟的洗脱时间通过这两种分级方法洗脱的聚合物改性剂分别被定义为聚(PEG500-MA)a-Na(SRFx-y)和聚(PEG500-MA)a-Na(SDFx-y)。
在各级分(水溶液)中的聚合物改性剂的浓度通过高效液相色谱法测定。在高效液相色谱法中采用的条件如下所示柱子Shodex OHpak SB-806M HQ(购自SHOWA DENKO K.K.)保护柱Shodex OHpak SB-G(购自SHOWA DENKO K.K.)柱温度40℃流动相用1M盐酸调至pH7.0的50mM磷酸氢二钠的水溶液检测波长210nm流速0.5ml/min注射到柱子中的量50μl采用以上关于根据SRF方法的第一分级所述的相同洗脱条件，对分别通过按照SRF方法和SDF方法分级所获得的聚(PEG500-MA)a-Na(SRFx-y)和聚(PEG500-MA)a-Na(SDFx-y)进行进一步凝胶过滤色谱法(SRF方法)，以评价在分级之后的各样品的分子大小。使用各自具有已知分子大小的蛋白(购自Amersham Bioscience)作为标准样品。在这方面，在购买它们的相关目录中示出了各蛋白的分子量和分子大小。
在以下表1中示出了通过分级获得的聚合物改性剂的计算分子大小。
表1

*一定跨度的保留时间的存在表示该样品具有分子量分布。
**这是由采用各标准蛋白的分子大小和保留时间形成的校准曲线计算的值。在其中下限未示出，即，其中斯托克斯半径作为“≤XX”示出的那些情况下，可以说该样品含有不能在本实施例的条件下用凝胶过滤色谱法评价的低分子量组分。
采用该方法，制备了具有不同分子大小的各种聚(PEG500-MA)a-Na聚合物(化合物13-19)。化合物13、14、15、16、17、18和19的平均聚合度如在前面的实施例中计算，结果分别是＜30，＜＜30，＜＜＜30，＜30，＜＜30，＜＜＜30和＜＜＜30。
实施例16其中m＝28-38，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.在以下给出的具有可控分子大小的聚(PEG1500-MA)的氨解产物[聚(PEG1500-MA)a](化合物20-22)的制备用在以上实施例7中制备的[聚(PEG1500-MA)a](化合物7)作为起始原料开始和采用与以上实施例15所用相同方法，以与实施例15相同方式制备聚(PEG1500-MA)a(SRFx-y)。用于SRF洗脱的洗脱条件与实施例15相同。在以下表2中示出了通过分级获得的聚合物改性剂的收率。
表2

采用该方法，制备具有不同分子大小的各种聚(PEG1500-MA)a聚合物(化合物20-22)。如前面的实施例那样计算化合物20、21和22的平均聚合度，结果分别是＜10，＜＜10，和＜＜＜10。
实施例17实施例15和16的聚合物改性剂与OCIF的复合物的制备采用在以上实施例15和16中制备的化合物13-22的水溶液(介质具有7.4的pH的PBS)和含有提纯的人成熟OCIF的水溶液(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)[介质具有6.0的pH的PBS]作为起始原料，用基本与以上实施例14相同的制备方法，作为水溶液制备本发明的聚合物-OCIF复合物。更具体地说，对于各改性剂，将0.5mg/ml的它在PBS中的溶液(pH7.4)(如在以上实施例9中所述制备)与0.5mg/ml OCIF在PBS中的溶液(pH6.0)以1∶1的体积比混合。将所得反应混合物在25℃下静置7天。所得复合物的分子大小如在以下试验实施例11中所说明的那样测定。
实施例18其中(a)m＝6-16，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶2和av.deg.pol.＝20-30(化合物27)和(b)m＝6-16，R3＝NH2，comp.ratio＝约1∶1和av.deg.pol.＝约15的具有可控分子大小的聚(PEG500-MA)的氨解产物[聚(PEG500-MA)a-钠盐](化合物28)的制备如下制备本发明的两种聚合物聚(PEG500-MA)a(化合物27)和聚(PEG500-MA)a(化合物28)。前者的起始原料是聚(PEG500-MA)(采用类似于在日本专利No.2621308和日本专利申请公开Nos.2003-105040和2003-104003中公开的方法类似的工序制备的AM-0510K)，聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝6-16，alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的共聚物，其中聚氧化乙烯侧链具有约500的平均分子量和主链的平均聚合度是20-30，聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚单元与马来酸酐单元的比率是1∶2和平均分子量是约6,000[数均分子量是约6,000和分子量分布指数(Mw/Mn)是约1.25]。后者的起始原料是聚(PEG500-MA)(采用类似于在日本专利No.2621308和日本专利申请公开Nos.2003-105040和2003-104003中公开的方法类似的工序制备的AM-0515K)，聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝6-16，alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的共聚物，其中聚氧化乙烯侧链具有约500的平均分子量，主链的平均聚合度是约15和平均分子量是约10,000。这些起始原料采用与在实施例10中所用那些基本相同的条件进行氨解，获得了标题化合物聚(PEG500-MA)a-钠盐(化合物27)和聚(PEG500-MA)a-钠盐(化合物28)。标题聚合物的羧基含量如在以下试验实施例1中所述测定，化合物27的结果是2.73mmol/g，化合物28的结果是2.05mmol/g。
实施例19实施例18的聚合物改性剂与OCIF的复合物的制备使用在以上实施例18中制备的化合物27和28的水溶液作为起始原料，采用基本与以上实施例14相同的制备方法，作为水溶液制备本发明的聚合物-OCIF复合物。更具体地说，对于各改性剂，将5mg/ml的它在PBS中的溶液(pH7.4)与5mg/ml人成熟OCIF在PBS中的溶液(pH6.0)以1∶1的体积比混合。用1M盐酸将所得混合物的pH调至5.5，然后将反应混合物在25℃下静置7天。所得复合物的分子大小如在以下试验实施例11中所说明的那样测定。
实施例20聚(PEG500-MA)的组合物的制备以及聚(PEG500-MA)a(化合物29-53)在各种条件下的制备和评价20(1)聚(PEG500-MA)的组成比的测定测试不同组成的聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚和马来酸酐的许多共聚物-聚(PEG500-MA)，以测定其中的PEG烯丙基甲基二醚和马来酸酐单元的比率(组成比)(采用类似于在日本专利No.2621308和日本专利申请公开Nos.2003-105040和2003-104003中公开的方法类似的工序制备的不同批次的AM-0510K)，聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝6-16，alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的无规共聚物，其中聚氧化乙烯侧链具有约500的平均分子量和主链的平均聚合度是20-30。以下示出了所测试的各批共聚物的数均分子量(Mn)和分子量分布(Mw/Mn，其中Mw是重均分子量)。各批聚(PEG500-MA)的分子量(MW)采用具有预定MW的聚(乙二醇)作为标准通过凝胶过滤色谱法来测定。因此，以下示出的聚(PEG500-MA)的MW不是绝对MW，而是采用PEG作为标准测定的相对MW。
M30538Mn＝6431；Mw/Mn＝1.27M3N549Mn＝6360；Mw/Mn＝1.23M3N550Mn＝5891；Mw/Mn＝1.28M3N569Mn＝5897；Mw/Mn＝1.25为了测定各共聚物的组成比，有必要将它们转化为水解共聚物的相应钠盐，即聚(PEG500-MA)h钠盐。所用水解条件如下所示。
将25ml的1，4-二恶烷，100ml的醚(ether)和42ml的0.1N NaOH水溶液加入到1g的聚(PEG500-MA)(批号M30538)中。然后强烈地振荡所得混合物，在使其沉降之后，收集这样获得的含水层。在用滤纸(从Nihon Rikagaku-kiki Corporation获得的704×40m/m)过滤之后，这样获得的含水层在40℃下搅拌2小时。在该时间结束时，冻干所得溶液。起始原料的水解产物的钠盐，即聚(PEG500-MA)h(批号M30538)钠盐，作为黄色固体获得(100％收率)。
将12ml的1，4-二恶烷和9ml的1N NaOH水溶液加入到1g的聚(PEG500-MA)(批号M3N549)中。然后将所得混合物在室温下搅拌24小时。在该时间结束时，添加1ml的1N NaOH水溶液，冻干所得混合物。起始原料的水解产物的钠盐，即聚(PEG500-MA)h(批号M3N549)钠盐，作为黄色固体获得(100％收率)。
将5ml的1，4-二恶烷和9ml的1N NaOH水溶液加入到2g的聚(PEG500-MA)(批号M3N550)中。然后将所得混合物在40℃下搅拌23小时。在该时间结束时，冻干该反应混合物。起始原料的水解产物的钠盐，即聚(PEG500-MA)h(批号M3N550)钠盐，作为黄色固体获得(100％收率)。
将5ml的1，4-二恶烷和9ml的1N NaOH水溶液加入到2g的聚(PEG500-MA)(批号M3N569)中。然后将所得混合物在40℃下搅拌23小时。在该时间结束时，冻干该反应混合物。起始原料的水解产物(即聚(PEG500-MA)h)的钠盐作为黄色固体获得(100％收率)。
通过如上所述的电导滴定测定这样制备的各聚(PEG500-MA)h钠盐的羧基含量。结果在以下表3中示出。
聚(PEG500-MA)h钠盐包括下列两种单体单元FW(PEG)＝500 FW(PEG烯丙基甲基二醚)＝541FW(马来酸酐钠盐)＝160如果每1单元的PEG烯丙基甲基二醚的马来酸钠盐单体单元的数目被定义为“a”，以及理论最小重复单元包括1单元的PEG烯丙基甲基二醚和“a”单元的马来酸钠，那么最小重复单元的化学式量(FW)用等式1给出
FW[(PEG烯丙基甲基二醚)1+(马来酸钠盐)a]＝FW(PEG烯丙基甲基二醚)+a[FW(马来酸钠盐)]＝541+160a (等式1)在聚(PEG500-MA)h钠盐的最小重复单元上的羧基数目是2a。因此，在聚(PEG500-MA)h钠盐的最小重复单元上的羧基含量(C，mmol/g)用等式2给出C＝2a/(541+160a)×1000 (等式2)在实际聚(PEG500-MA)h钠盐中的马来酸钠单元的数目与PEG烯丙基甲基二醚单元的比率与在最小重复单元中的该比率相同。因此，C的值在最小重复单元中和在实际聚(PEG500-MA)h钠盐中也是相同的，其羧基含量通过电导滴定来测定(参见上文)。因此，通过测定羧基含量和采用等式2，可以获得组成比“a”的值，即马来酸钠盐的数目/1单元的PEG烯丙基甲基二醚[它是聚(PEG500-MA)的单体组成]。结果在以下表3中示出。
表3

聚(PEG500-MA)h钠盐的组成比是在1∶2到1∶3.3的范围内。显然，该组成比在聚(PEG500-MA)和聚(PEG500-MA)h钠盐中是相同的，使得不同起始共聚物聚(PEG500-MA)的单体组成比被证明是在1∶2到1∶3.3的范围内。
20(2)获得聚(PEG500-MA)a(化合物29-53)的在不同条件下的聚(PEG500-MA)的氨解和所述化合物的水解比的测定通过使用聚(PEG500-MA)h钠盐的组成比(a)和羧基含量，可以如下计算水解比(即，被氨解的起始聚合物中的马来酸酐单元与被水解的那些单元的比率)。以下示出了酰胺化马来酸(马来酰胺酸，钠盐)的钠盐的化学式 FW(马来酰胺酸钠盐)＝137按照与以上聚(PEG500-MA)h钠盐的情况相同的方式，可以假定聚(PEG500-MA)a钠盐的最小单元包括一个PEG烯丙基甲基二醚单元，ax单元的马来酰胺酸钠盐和a(1-x)单元的马来酸钠盐。聚(PEG500-MA)a钠盐的最小单元的化学式量用以下等式3给出FW[(PEG烯丙基甲基二醚)1+(马来酰胺酸钠盐)ax+(马来酸钠盐)a(1-x)]＝FW(PEG烯丙基甲基二醚)+ax[FW(马来酰胺酸钠盐)]+a(1-x)[FW(马来酸钠盐)]＝541+137ax+160a(1-x)＝541+160a-23ax (等式3)因为在聚(PEG500-MA)a钠盐的最小单元中的羧基含量是ax+2a(1-x)＝2a-ax，所以在聚(PEG500-MA)a钠盐的最小单元中的羧基含量(C，mmol/g)可以由等式4得出C＝1000×(2a-ax)/(541+160a-23ax)(等式4)水解比(1-x)∶x因此可以通过采用能够通过聚(PEG500-MA)a钠盐的电导滴定获得的羧基含量(C，mmol/g)和以上获得的“a”值而由等式4确定。
以下示出了制备聚(PEG500-MA)a的几个实例和产物聚(PEG500-MA)a中的计算水解比。
(a)将0.5M氨/1，4-二恶烷溶液(在以下表4中给出的量)加入到100mg的聚(PEG500-MA)中，所得溶液用以下表4给出的温度和时间进行搅拌。在反应时间结束时，将大约0.4ml(0.3-0.5ml)的1N NaOH水溶液加入到反应混合物中。冻干所得溶液，获得了作为固体材料的聚(PEG500-MA)a的钠盐。
以下表4示出了在这些不同反应条件下制备的各聚(PEG500-MA)a钠盐的“胺组分的反应率”[被氨解的起始聚合物中的马来酸酐单元的百分率(100*x)]。
表4

*DMFN，N-二甲基甲酰胺#8-19，25和27-37是标题聚合物聚(PEG500-MA)a(化合物29-52)。这些聚合物各自是无规的，m＝6-16，R3＝NH2，组成比＝1∶2.4和平均聚合度＝20-30。
如表4所示，反应产物聚(PEG500-MA)a(化合物29-52)全部具有非常高的“胺组分的反应率”，表明使用上述各种反应条件下获得了非常接近100％的氨基转化率。
以下描述了聚(PEG500-MA)a的备选制备方法的几个其它实例(b)将0.44g的聚(PEG500-MA)溶于9ml的二甲基甲酰胺。然后在-50℃下将氨气鼓泡到该溶液中。反应混合物中的最终氨量是0.67g。这样获得的反应混合物在氮气氛围下在玻璃安瓿内密封，然后在室温下搅拌24小时。在该时间结束时，在打开玻璃安瓿之后，氨气在减压下蒸发出来。然后将反应混合物滴加到90ml的二乙醚中。收集这样获得的沉淀物，在减压下干燥。获得了呈黄色粉末的0.28g的聚(PEG500-MA)a铵盐(化合物53)(在以上表4中称为#41)。该聚合物是无规的，m＝6-16，R3＝NH2，组成比＝1∶3.10和平均聚合度＝20-30。
(c)采用甲苯代替二甲基甲酰胺，按照与(b)相同的方式获得聚(PEG500-MA)a铵盐。
(4)采用1，4-二恶烷代替二甲基甲酰胺，按照与(b)相同的方式获得聚(PEG500-MA)a铵盐。
实施例21其中m＝6-16，R3＝OCH2CH3，comp.ratio＝约1∶1，av.deg.pol.＝20-30和hyd.ratio＝约3.1∶6.9的乙醇和聚(PEG500-MA)的醇解反应产物[聚(PEG500-MA)ea-Na](化合物54)的制备采用聚(PEG500-MA)(采用类似于在日本专利No.2621308和日本专利申请公开Nos.2003-105040和2003-104003中公开的方法类似的工序制备的AM-0510K，批号M3N550)作为起始原料，它是聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝6-16，alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的共聚物，其中聚氧化乙烯侧链具有约500的平均分子量，主链的平均聚合度是20-30，聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚单元与马来酸酐单元的比率是约1∶3，数均分子量(Mn)是5891和分子量分布指数(Mw/Mn)是1.28(参见以上实施例20)。将1ml的乙醇加入到100mg的所述起始化合物中，再让所得反应混合物在40℃下静置16小时。在该时间结束时，添加52μl的氢氧化钠在乙醇中的2.5N溶液。这样获得的混合物在35℃下通过蒸发浓缩，然后在真空下干燥，获得呈油状材料的聚(PEG500-MA)ea钠盐(化合物54)。采用在以上实施例3和6中所述的方法计算水解比。也就是说，通过测定聚(PEG500-MA)ea钠盐(化合物54)和相应的聚(PEG500-MA)h钠盐的羧基含量，计算被醇解的标题化合物中的马来酸酐残基与起始原料中的马来酸酐残基的总数的比率，测得是0.69。因此，可以看出，起始原料中的马来酸酐残基的69％被醇解，剩余31％的马来酸酐残基被水解。
实施例22实施例21的聚合物改性剂与OCIF的复合物的制备采用在以上实施例21中制备的化合物54的水溶液[化合物54的浓度，17.2mg/ml；介质，PBS pH7.4(它是通过将含有10mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠的水溶液与含有10mM磷酸二氢钠和150mM氯化钠的水溶液以获得具有7.4的pH的缓冲液的适当比率混合所获得的溶液)]和提纯的人成熟OCIF的水溶液(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)(OCIF浓度4mg/ml；介质含有10mM磷酸根离子和150mM NaCl的缓冲液，pH6.0)，用基本上与以上实施例14相同的制备方法，作为水溶液制备本发明的聚合物-OCIF复合物。更具体地说，将0.472ml的17.2mg/ml化合物54的溶液加入到1.328ml的所述4mg/ml OCIF溶液中，获得了含有4.5mg/ml的化合物54和3mg/ml OCIF的溶液。将所得反应混合物在4℃、10℃或25℃下静置3天，获得了本发明的所需复合物的水溶液。该复合物大小在以下试验实施例13中测定。
实施例23其中m＝6-16，R3＝OCH2CH3，comp.ratio＝约1∶3，av.deg.pol.＝20-30的乙醇和聚(PEG500-MA)的醇解反应产物[聚(PEG500-MA)ea](化合物55)的制备采用聚(PEG500-MA)(采用类似于在日本专利No.2621308和日本专利申请公开No s.2003-105040和2003-104003中公开的方法类似的工序制备的AM-0510K，批号M3N550)作为起始原料，它是聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚(m＝6-16，alk＝亚乙基，R1＝氢和R2＝甲基)和马来酸酐的无规共聚物，其中聚氧化乙烯侧链具有约500的平均分子量，主链的平均聚合度是20-30，聚氧化乙烯烯丙基甲基二醚单元与马来酸酐单元的比率是约1∶3，数均分子量(Mn)是5891和分子量分布指数Mn/Mw是1.28(参见以上实施例20)。将0.5ml的无水乙醇加入到50mg的所述起始化合物中，再让所得反应混合物在37℃下静置24小时。标题化合物聚(PEG500-MA)ea(化合物55)作为乙醇溶液获得[聚(PEG500-MA)ea浓度100mg/ml]。
实施例24实施例23的聚合物改性剂与OCIF的复合物的制备采用在以上实施例23中制备的化合物55的乙醇溶液和提纯的人成熟OCIF的水溶液(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)(OCIF浓度5mg/ml；介质含有10mM磷酸根离子和150mM NaCl的缓冲液，pH6.0)，用基本上与以上实施例14相同的制备方法，作为水溶液制备本发明的聚合物-OCIF复合物。更具体地说，将37.5μl的化合物55的乙醇溶液加入到0.5ml的所述5mg/ml OCIF溶液中，将所得反应混合物在25℃下静置3天，获得了本发明的所需复合物的溶液。该复合物大小在以下试验实施例13中测定。
对比实施例1单甲氧基聚乙二醇-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物(PEG-PMVMA)的制备根据在日本专利申请(Kokai)No.Hei11-302199的实施例2中公开的方法制备接枝共聚物单甲氧基聚乙二醇-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物(PEG-PMVMA)。
对比实施例2包含单甲氧基聚乙二醇-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物(PEG-PMVMA)和OCIF蛋白的复合物的制备按照与实施例9基本相同的方式，作为溶液[介质PBS(pH6.0)]制备用如在以上对比实施例1中所述制备的PEG-PMVMA改性的提纯人OCIF(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)。更具体地说，将1ml的OCIF溶液[OCIF浓度2mg/ml；介质PBS(pH6.0)]和1ml的PEG-PMVA溶液[PEG-PMVA浓度2或20mg/ml；介质PBS(pH6.0)]混合，将混合物在25下静置24小时，获得了标题复合物。
对比实施例3采用聚(PEG500-MA)作为聚合物改性剂的包含聚合物改性剂和OCIF蛋白的复合物的制备将2.2μl的含有聚(PEG500-MA)[AM-0530K，由NOF Corporation生产(下文称为“聚(PEG500-MA)”)]的二甲亚砜溶液(聚合物浓度35-350mg/ml)加入到28.4μl的提纯的人OCIF的水溶液(如在WO96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)(蛋白浓度3.5mg/ml；介质0.5M NaH2PO4水溶液，其pH用5M NaOH水溶液调至7.6)中，这样获得的溶液(OCIF浓度3.2mg/ml，聚(PEG500-MA)浓度2.5mg/ml或6.3mg/ml)在25℃下振荡40小时。在该时间结束时，溶液用PBS(pH7.0)稀释，获得了具有0.25mg/ml的OCIF浓度的用聚合物改性剂改性剂的OCIF的溶液。这样制备的溶液在4℃下储存。
试验实施例1通过电导滴定测定实施例10-13的聚合物的羧基含量通过如下所示的电导滴定法测定在实施例10-13中制备的各聚合物[聚(PEG500-MA)a(化合物9和10)，聚(PEG500-MA)dma(化合物11)和聚(PEG500-MA)h(化合物12)]的羧基含量。
首先，如下所示采用凝胶过滤提纯各聚合物。对于各聚合物，将100mg的聚合物溶于4ml的0.001N氢氧化钠溶液。将溶液分为四批，将每批1ml施加于凝胶过滤柱(PD-10，由Amersham-Pharmacie制造)。丢弃前1ml的洗脱液。然后将1.5ml的0.001N氢氧化钠溶液施加于各柱，从柱中洗脱另外1.5ml，并丢弃。然后将2.5ml的0.001N氢氧化钠溶液施加于各柱，从柱中洗脱另外2.5ml，它是含有提纯化合物的这种级分。将来自四根柱子的提纯级分合并，获得标题化合物的提纯溶液。在提纯步骤之后测定的收率(通过分光光度法在提纯之前和之后在210nm下测量聚(PEG500-MA)h的吸收率来测定)是80％，在提纯溶液中的浓度测得为8mg/ml。
对于提纯聚合物的各溶液，等份试样(2.5-7.5ml)用蒸馏水或0.001M氢氧化钠水溶液补充至50ml，然后将1M氢氧化钠水溶液加入到所得溶液中，以便将pH调至12。然后以0.1ml的增量或连续以0.1ml/min的速率将0.1M盐酸加入到溶液中。在前一种方法中，在各次添加之后测定pH和电导率，而在后一种方法中，它们每15秒测定一次。然后由在电导率缓冲区中添加的0.1M盐酸的量计算聚合物的羧基含量(对应于大约10-5.5的pH范围)。结果在以下表5中示出。
表5

对于实施例10-12的聚合物，如下所示通过计算确定各自的被氨解或胺解的起始原料中的马来酸酐残基与被水解的马来酸酐残基的比率。如以上表5所示，羧基含量/1g的聚(PEG500-MA)h(化合物12)是3.21mmol。由这些值测定聚(PEG500-MA)的重量(即，水解前的共聚物的重量)/g官能团，以及通过将氨加入到聚(PEG500-MA)中获得的聚(PEG500-MA)a(化合物9和10)的重量/g官能团。具体地说，通过从完全水解的共聚物的重量中减去水分子的分子量(18g)获得聚(PEG500-MA)的重量(即，水解之前的共聚物的重量)/mol的马来酸酐残基，得到了605g的值。通过将氨分子的分子量(17g)与聚(PEG500-MA)的重量相加而获得了聚(PEG500-MA)a(化合物9和10)的重量/mol的羧基，获得了622g的数值。通过计算(1g/622)，由该值测定其中所有马来酸酐残基被氨解(即，无水解)的理论羧基含量/1g的聚(PEG500-MA)a(化合物9和10)，结果是1.61mmol。以相同的方式，通过将二甲胺分子的分子量与聚(PEG500-MA)的重量相加来测定通过将二甲胺加入到聚(PEG500-MA)中所获得的聚(PEG500-MA)dma(化合物11)的重量/mol羧基，获得了650g的值。通过计算，由该值测定其中所有马来酸酐残基被胺解的理论羧基含量/1g的聚(PEG500-MA)dma，结果是1.54mmol。
对于实施例10-12的各聚合物，由羧基含量/1g的其中所有马来酸酐残基被水解的聚(PEG500-MA)h(化合物11)，理论羧基含量/1g的其中所有马来酸酐残基被氨解的聚(PEG500-MA)a(化合物9和10)，理论羧基含量/1g的其中所有马来酸酐残基被二甲胺胺解的聚(PEG500-MA)dma(化合物11)，以及以上通过电导滴定测定的实际测得的羧基含量/1g的实施例10-12的各聚合物测定水解比(相对于氨解或胺解的被水解的起始原料的百分率)和氨解或胺解反应率(％)。结果如在以上表5中所示。
试验实施例2采用大鼠的OCIF-改性剂复合物在血液中的保留的评价如实施例9、对比实施例2所述制备的各样品和非改性提纯人OCIF(如WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)用PBS(pH6.0)适当稀释，使得OCIF浓度是0.25mg/ml。这样获得的各稀释样品经静脉给药于5周Wistar雌性大鼠的尾部(具有约100g的体重和禁食1天)，使得OCIF剂量是0.5mg/kg(2ml/kg体积)。在给药之后6小时，从大鼠心脏取200μl的血液，然后通过ELISA方法测定血清OCIF浓度，所用条件如在以下试验实施例3中所述。
以下表6示出了在各样品给药之后测定的在血清中的OCIF浓度。
表6在各OCIF样品静脉内给药之后的血清OCIF浓度

*基本混合条件是1mg/ml的OCIF浓度，pH6.0，16小时，和25℃。在表6中仅给出了与这些不同的条件。
从以上表6很容易看出，本发明的各聚合物改性剂和蛋白的复合物显著改进了蛋白在血液中的保留，当与单独给药的蛋白的保留比较时。通过比较PEG-PMVMA和蛋白的现有技术复合物(公开在日本专利公开No.Hei 11-302199中，在以上对比实施例2中制备)与具有改性剂和蛋白的相同重量比(1或10)的本发明的复合物，还可以看出，本发明的改性剂和蛋白的复合物提供了比现有技术PEG-PMVMA和蛋白的复合物明显改进的蛋白在血液中的保留。
试验实施例3OCIF的ELISA检出率的评价现有技术蛋白改性剂所遇到的问题之一是由于形成了庞大复合物，改性剂与蛋白的结合引起了蛋白结构的改变和/或蛋白的屏蔽。为了测试本发明的OCIF-改性剂复合物，通过ELISA基于未改性提纯的人OCIF(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)来测定如在实施例9和对比实施例2中所述制备的各复合物的检出率。ELISA如下进行。
将抗人OCIF-单克隆抗体OI-19(根据在EP0974671中公开的方法制备)溶于0.1M碳酸氢钠溶液(pH9.6)，获得具有10μg/ml的OI-19浓度的溶液。将100μl的这样制备的OI-19溶液加到96孔免疫板(immunoplate)(由Nunc制造)的各孔中，将板在4℃下静置过夜。在该时间结束时，将50％Block Ace(从Snow Brand Milk ProductsCo.，Ltd.购买)加到各孔中以封闭，然后板用含有0.1％Tween20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤三次。将提纯的人OCIF(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)溶于初级反应缓冲液(即，含有40％Block Ace，0.1％Tween 20和10μg/ml小鼠IgG的0.2M tris盐酸缓冲液(pH7.4))，以制备具有各种OCIF浓度的标准溶液。将100μl的各种具有不同OCIF浓度的这样制备的溶液加入到各孔中，将板在室温下振荡2小时，然后各孔用洗涤缓冲液洗涤6次。POD-OI-4(即，用过氧化物酶标记并且识别OCIF的抗体，如在EP 0974671中所述制备)然后用二级反应缓冲液(即，含有25％Block Ace，0.1％Tween 20和10μg/ml小鼠IgG的0.1M tris盐酸缓冲液(pH7.4))稀释10,000倍，将100μl的所得溶液加入到各孔中，板在室温下振荡2小时，然后各孔洗涤6次。一旦完成这，将100μl的底物溶液(TMB可溶性试剂，购自Scytek)加入到各孔中，各板在室温下振荡10-15分钟。此后，将100μl的反应终止剂(TMB终止缓冲液，购自Scytek)加入到各孔中，轻轻振荡各板。在该时间结束时，通过微量培养板读出器(MEML 001，由Molecular Device Corporation制造)测定各孔在450nm的波长下的吸收率。由这些结果可以得到OCIF浓度与吸收率的校准曲线。在产生了该校准曲线之后，对各试验OCIF和改性剂的复合物重复该工序，将100μl的含有试验复合物的各溶液加入到各孔中，与以上相同的方式与POD-OI-4反应，然后用微量培养板读出器测定各孔的在450nm的波长下的吸收率。用校准曲线获得的吸收率的比较使得可以测定在各复合物中能被ELISA检出的OCIF浓度。
对于各样品，计算用ELISA检测OCIF的失败率，结果如在以下表7中所示。用ELISA检测OCIF的失败率通过以下等式来定义失败率＝[1-(用ELISA测定的OCIF浓度)/(用Lowry法测定的OCIF浓度)]×100在以上等式中，测定复合物中的OCIF浓度的Lowry法如在日本专利申请No.2002-190407中所述测定。这获得了复合物中的总OCIF浓度的测量值。在复合物中用ELISA检测OCIF的失败率是通过与改性剂复合所引起的OCIF的构象改变的衡量标准。低失败率是复合物中的OCIF可容易地被OI-19和OI-4抗OCIF抗体结合的证据，因此显示复合物中的OCIF结构改变很小或无改变。
表7用ELISA检测OCIF样品的失败率

从以上表7所示结果可以看出，对于本发明的聚合物改性剂和蛋白的复合物，由于蛋白结构改变，用ELISA检测OCIF的失败率比在以上试验实施例2制备的PEG-PMVMA和蛋白的现有技术复合物的情况下获得高失败率显著下降。
因此，从试验实施例2和3的结果可以证明，本发明的聚合物改性剂和蛋白的复合物的由蛋白的过度改性引起的蛋白检测灵敏度的下降是非常低的，此外，所述复合物中的蛋白在血液中的保留显著优于用现有技术复合物获得的保留。
试验实施例4血OCIF浓度的测定如实施例9所述制备的各样品和提纯的人OCIF(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)用PBS适当稀释(具有6.0-7.4的pH)，使得OCIF浓度是0.1-1mg/ml。这样制备的各稀释样品然后经由隐静脉或背侧皮下给药于6岁或7岁雌性猕猴(具有2-4kg的体重和已禁食1天)，给予0.1-1mg/kg(1ml/kg体积)的OCIF剂量。在给药后5分钟到1个月的预定时间，从大腿血管取500μl血液，再通过如在以上试验实施例3中所述的ELISA方法测定血清OCIF浓度。
试验实施例5骨密度测定将如实施例9所述制备的各样品和提纯的人OCIF(如在WO96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)用PBS适当稀释(具有6.O-7.4的pH)，使得OCIF浓度是0.7-3.5mg/ml。然后采用乳酪分枝杆菌(Mycobacterium butyricum)的杀死细胞和液体石蜡制备佐剂，在5-10周雌性Lewis大鼠的尾根皮肤中注射，在所述大鼠中产生关节炎。在注射佐剂后2周，经由尾静脉或背侧皮下将各制备样品给药于大鼠，使得OCIF剂量是1.4-7mg/kg(2ml/kg，体积)。在注射佐剂后3周，解剖大鼠，提取左右大腿骨，以及测定其骨密度。
试验实施例6在非还原条件下用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳评价分子大小如下所示在非还原条件下通过SDS-PAGE评价如在实施例14和对比实施例3中所述制备的各聚合物改性剂和OCIF的复合物和提纯的人OCIF(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)的分子大小。
将5μl的NuPAGE(商标)LDS样品缓冲液(4X)(从InvitrogenLife Technology获得)和5μl的净化水加入到10μl的各测试样品中[如果必要，用磷酸盐缓冲盐水(PBS(pH7.0)稀释，它是通过将含有10mM磷酸氢二钠和150mM氯化钠的溶液与含有10mM磷酸二氢钠和150mM氯化钠的溶液以获得具有7.0的pH的缓冲液的适当比率混合所获得的缓冲溶液)，使得蛋白浓度是250μg/ml]，再将所得溶液在95℃下加热7分钟。在该时间结束时，将全量的反应混合物加入到SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶(具有1mm的厚度3-8％Tris-Acetate凝胶，由NOVEX制造)中，使用电源设备(PhoreStar Pro，由Anatech制造)将150V的电压施加于凝胶。在电泳结束后，凝胶上的蛋白根据本领域技术人员公知的方法用考马斯蓝染色。
从图1和2可以看出，在所有混合比下，用本发明的聚合物改性剂改性的OCIF稳定地作为分子量高于未改性OCIF(120kD)的物质被检测(根据分子量标记，130-150kD的主带和180-200kD的副带被检测)，而且没有检测到分子量超过210kD的复合物。属于胺解和醇解产物的本发明的其它聚合物改性剂也获得了类似的结果(没有示出)。另一方面，从图3可以看出，在对比实施例3中制备的用普通聚合物改性剂聚(PEG500-MA)改性的OCIF的情况下，随着改性剂的比率的增高，所得庞大复合物的量显著增加。
该结果表明，与现有技术的结构十分相似的聚合物改性剂聚(PEG500-MA)比较，通过使用本发明的聚合物改性剂，可以显著地抑制药理学不优选的庞大复合物的形成，并且可以不论混合比如何均可制备具有稳定性能的聚合物改性剂和蛋白的复合物。
试验实施例7聚(PEG500-MA)a的共价键形成活性的评价如下所示，测定各聚合物改性剂聚(PEG500-MA)a(化合物9)和聚(PEG500-MA)h(化合物12)与具有氨基和514.62的分子量(购自Molecular Probes，Inc.)的荧光物质的四甲基若丹明尸胺(下文称为“Rho-NH2”)的反应性，再如下文所述通过比较两种聚合物改性剂的反应性来评价改性剂的共价键形成活性。
将3.8μl的聚(PEG500-MA)h(化合物12)(如以上实施例13所述制备)和聚(PEG500-MA)a(化合物9)[聚合物浓度21mg/ml，介质PBS(pH用1M NaOH调至9.5)](如以上实施例10所述制备)的各自溶液加入到18.9μl的含有1.08mg/ml Rho-NH2的PBS(pH6.0)中。将这样获得的溶液在25℃下静置3天。在该时间结束时，通过凝胶过滤色谱法如下所示分级反应混合物(柱子PD-10，由Amersham Biotech制造，流动相净化水)。将0.5ml的反应混合物施加于凝胶过滤柱，从柱中流出0.5ml，丢弃。将2ml的蒸馏水加入到柱内，洗脱另外2ml，并丢弃。将另外2ml的蒸馏水加入到柱子中，洗脱另外2ml，该级分含有聚合物级分。在聚合物级分中含有的Rho-NH2通过荧光光谱法定量(激发波长544nm，荧光波长571nm，介质调至pH3的净化水)，以计算出在各聚合物和Rho-NH2复合物中的Rho-NH2的量与在反应混合物中的Rho-NH2的总量的比率，即，Rho-NH2与聚合物的结合比。
结果如在以下表8中所示。
表8聚合物改性剂的反应性

*本试验进行2次。
从以上表8可以容易地看出，对于聚合物改性剂聚(PEG500-MA)a(化合物9)与Rho-NH2的反应混合物，在聚合物级分中检测到了极高的Rho-NH2水平。这与聚合物改性剂聚(PEG500-MA)h(化合物12)与Rho-NH2的反应混合物相反，在后者的聚合物级分中仅检测到了低的Rho-NH2水平。当将单独的Rho-NH2施加于柱子中时，在“聚合物级分”中没有洗脱Rho-NH2。这些结果表明，本发明的聚合物改性剂聚(PEG500-MA)a(化合物9)牢固地结合于Rho-NH2的氨基。另一方面，本发明的聚合物改性剂聚(PEG500-MA)h(化合物12)的结合比是低的，表明该聚合物改性剂不牢固地结合于Rho-NH2的氨基。
试验实施例8OCIF的ELISA检出率的评价通过ELISA基于未改性提纯的人OCIF(如在WO 96/26217和EP816380中所述制备的OCIF)来测定如在实施例14和对比实施例3中所述制备的各OCIF和聚合物改性剂的复合物的检出率。ELISA如下进行。
将抗人OCIF-单克隆抗体OI-19(根据在EP 0974671中公开的方法制备)溶于0.1M碳酸氢钠溶液(pH9.6)，获得具有10μg/ml的OI-19浓度的溶液。将100μl的这样制备的OI-19溶液加到96孔免疫板(immunoplate)(由Nunc制造)的各孔中，将板在4℃下静置过夜。在该时间结束时，将50％Block Ace(从Snow Brand Milk ProductsCo.，Ltd.购买)加到各孔中以封闭，然后板用含有0.1％Tween20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤三次。将提纯的人OCIF(如在WO 96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)溶于初级反应缓冲液(即，含有40％Block Ace，0.1％Tween 20和10μg/ml小鼠IgG的0.2M tris盐酸缓冲液(pH7.4))，以制备具有各种OCIF浓度的标准溶液。将100μl的各种具有不同OCIF浓度的这样制备的溶液加入到各孔中，将板在室温下振荡2小时，然后各孔用洗涤缓冲液洗涤6次。POD-OI-4(即，用过氧化物酶标记并且识别OCIF的抗体，如在EP O974671中所述制备)然后用二级反应缓冲液(即，含有25％Block Ace，0.1％Tween 20和10μg/ml小鼠IgG的0.1M tris盐酸缓冲液(pH7.4))稀释10,000倍，将100μl的所得溶液加入到各孔中，板在室温下振荡2小时，然后各孔洗涤6次。一旦完成这，将100μl的底物溶液(TMB可溶性试剂，购自Scytek)加入到各孔中，各板在室温下振荡10-15分钟。此后，将100μl的反应终止剂(TMB终止缓冲液，购自Scytek)加入到各孔中，轻轻振荡各板。在该时间结束时，通过微量培养板读出器(MEML 001，由Molecular Device Corporation制造)测定各孔在450nm的波长下的吸收率。根据使用具有已知浓度的OCIF溶液产生的校准曲线来计算各标准OCIF样品的OCIF浓度。
对于测试复合物的各样品，测定吸收率，由标准曲线计算OCIF浓度，如在以上试验实施例3中所说明的那样计算用ELISA检测OCIF的失败率。所得结果如在以下表9中所示。
表9用ELISA检测OCIF样品的失败率

从以上表9可以容易看出，对于在实施例14中制备的本发明的各聚合物改性剂和蛋白的复合物，与在对比实施例3中制备的聚合物和蛋白的现有技术复合物(其用ELISA检测OCIF的失败率是非常高的)相比，由于蛋白改性引起的用ELISA检测OCIF的失败率显著降低。
从这些结果可以明显看出，本发明的聚合物改性剂和蛋白的复合物的可由蛋白的过度改性和/或庞大复合物的形成所导致的ELISA检测灵敏度降低是非常小的。
试验实施例9使用大鼠的血液保留评价在实施例14中制备的各样品和非改性提纯人OCIF (如WO96/26217和EP 816380中所述制备的OCIF)用PBS(pH7.0)适当稀释，使得OCIF浓度是0.25或0.025mg/ml。这样获得的各稀释样品经股静脉给药于5周Wistar雌性大鼠(具有约100g的体重和禁食1天)，使得OCIF剂量是0.5或0.05mg/kg(2ml/kg体积)。在给药之后6小时，从大鼠的颈静脉取200μl的血液，然后通过如上所述的ELISA方法测定血清OCIF浓度。
以下表10示出了在各样品给药之后测定的在血清中的OCIF浓度。
表10在各OCIF样品静脉内给药之后的血清OCIF浓度

从以上表10可以看出，与蛋白单独给药相比，本发明的聚合物改性剂和蛋白的复合物显著地改进了所述蛋白在血液中的保留。
从以上结果可以看出，本发明的聚合物改性剂和蛋白的复合物可以在宽范围的条件下稳定地生产，所述复合物显著地改进了给药后复合物的蛋白的血液保留。该复合物因此极其适用于药物和生物化学领域。
试验实施例10采用大鼠的血液保留评价按照与试验实施例9相同的方式评价在实施例17和19中制备的各种样品。以下表11示出了在各样品给药之后测定的血清OCIF浓度。
表11在各OCIF样品的静脉内给药之后的血清OCIF浓度

从以上表11可以容易看出，与蛋白单独给药比较，所有本发明的具有不同分子大小的测试聚合物改性剂显著提高了蛋白的血液保留。
试验实施例11用尺寸排阻色谱法评价分子大小通过尺寸排阻色谱法评价在实施例9、实施例14、实施例17和实施例19中制备的聚合物改性剂和OCIF的各复合物的分子大小。以下表12示出了试验条件。
表12尺寸排阻色谱法的条件

以下表13示出了以下标准蛋白在上述条件下的保留时间。
表13各标准蛋白的保留时间

根据尺寸排阻色谱法的结果，非复合的OCIF的斯托克斯半径测得是5.63nm，以及如下所示测定本发明的各聚合物改性剂-OCIF复合物的斯托克斯半径在实施例9中制备的复合物聚(PEG500-MA)h(化合物1)-OCIF复合物(斯托克斯半径6.13nm-7.32nm)，聚(PEG500-MA)a(化合物3)-OCIF复合物(6.12nm-6.54nm)，聚(PEG500-MA)dma(化合物4)-OCIF复合物(6.39nm)，聚(PEG500-MA)ipa(化合物5)-OCIF复合物(6.26nm)，聚(PEG500-MA)ea(化合物6)-OCIF复合物(6.44nm)，聚(PEG1500-MA)h(化合物2)-OCIF复合物(6.44nm-6.71nm)，聚(PEG1500-MA)a(化合物7)-OCIF复合物(6.40nm-6.47nm)，聚(PEG1500-MA)dma(化合物8)-OCIF复合物(6.55nm)。
从这些结果可以看出，本发明的各复合物在用作流动相的磷酸盐缓冲盐水中具有比未复合的OCIF大大约1nm的斯托克斯半径。此外，对于各样品，未检测到由未改性OCIF产生的峰，表明了复合物的稳定性。
在类似于上述那些的条件下测定其它复合物的斯托克斯半径。结果如下所示实施例14制备的复合物在OCIF浓度5mg/mL；聚合物改性剂浓度1.25mg/ml到5mg/ml；pH7.4；25℃；36h；介质磷酸盐缓冲盐水(磷酸盐浓度，10mM；NaCl浓度，150mM)的条件下制备的复合物具有6.2-6.5nm的斯托克斯半径。此外，对于各样品，未检测到由未改性OCIF产生的峰，表明了复合物的稳定性。
实施例17制备的复合物在OCIF浓度0.5mg/mL；聚合物改性剂浓度0.5mg/ml；pH6.0；25℃；168h；介质磷酸盐缓冲盐水(磷酸盐浓度，10mM；NaCl浓度，150mM)的温育条件下制备的复合物具有6.1-6.7nm的斯托克斯半径。此外，对于各样品，未检测到由未改性OCIF产生的峰，表明了复合物的稳定性。
实施例19制备的复合物在OCIF浓度5mg/mL；聚合物改性剂浓度5mg/ml；pH5.5；25℃；168h；介质磷酸盐缓冲盐水(磷酸盐浓度，10mM；NaCl浓度，150mM)的孵化条件下制备的复合物具有6.3-6.8nm的斯托克斯半径。此外，对于各样品，未检测到由未改性OCIF产生的峰，表明了复合物的稳定性。
与未改性的OCIF相比，本发明的聚合物改性剂-OCIF复合物的斯托克斯半径的增加可以归因于OCIF用本发明的聚合物改性剂的改性。
试验实施例12采用大鼠的血液保留评价和OCIF的ELISA检出率的评价按照与试验实施例2和3相同方式测试在实施例22中制备的复合物(化合物54和OCIF的复合物)(温育温度25℃)的血液保留和OCIF的ELISA检出率。将OCIF等效剂量设定于0.1mg/kg。在静脉注射复合物之后6小时，OCIF的血清浓度是189ng/ml。因此，证明了在以上实施例22中用聚(PEG500-MA)ea钠盐(化合物54)制备的复合物显示了优异的血液保留水平。此外，由于复合物中的蛋白被改性剂过度改性所造成的OCIF的ELISA检测灵敏度的降低是极低的。
试验实施例13复合物大小的评价通过如以上试验实施例11所述的凝胶过滤色谱法评价在实施例22(化合物54和OCIF的复合物)和24(化合物55和OCIF的复合物)中制备的复合物的分子大小。结果发现，这些复合物的分子大小显示了高度的均一性。对于在4℃、10℃和25℃下复合的化合物54和OCIF的复合物，斯托克斯半径是6.0nm，6.0nm和6.0nm。对于化合物55和OCIF的复合物，斯托克斯半径是6.4nm。在实施例22和24中制备的各复合物因此具有大于未改性、提纯的人OCIF(斯托克斯半径5.63nm)的斯托克斯半径。
制剂实施例将按照如以上实施例14所述相同的方式在无菌条件下获得的复合物的溶液冻干，获得冻干制剂。
序列表<110>Sankyo Company，Limited<120>聚合物改性剂和药物组合物<130>sankyoFP0406<150>JP2003-80389<151>2003-03-24<150>JP2003-355835<151>2003-10-16<150>JP2003-426598<151>2003-12-24<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>PRT213>智人<220>
<223>InventorKasuya，YujiInventorHnoma，Masahi<220>
<221>信号<222>(-21)..(-1)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(+1)..(+380)<223>
<400>1Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile-20 -15 -10Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp-5 -1 1 5 10Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr15 20 25Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro30 35 40Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys45 50 55Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu60 65 70 75Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr80 85 90Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe95 100 105Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg110 115 120
Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys125 130 135Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys140 145 150 155Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr160 165 170Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg175 180 185Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val190 195 200Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser ValGlu Arg Ile205 210 215Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu220 225 230 235Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln240 245 250Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala255 260 265Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly270 275 280Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys285 290 295
Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn300 305 310 315Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser320 325 330Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr335 340 345Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu350 355 360Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys365 370 375Leu380
权利要求
1.共聚物或其药理学可接受的盐，其含有作为组成单元的(a)和(b)(a)彼此相同或不同并且用下式(I)表示的一种或多种结构单元 式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，和R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基，该烷基可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基所取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基，和b)彼此相同或不同并且用下式(II)表示的一种或多种结构单元 式中R3表示羟基，具有1-6个碳原子的烷氧基，其可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基，具有6-14个碳原子的芳氧基，其可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代，或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5彼此相同或不同，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基，该烷基可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基所取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基；取代基A选自具有1-6个碳原子的烷基，具有1-6个碳原子的烷氧基，卤素原子，羟基，硝基和羧基。
2.根据权利要求1的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元和用式(II)表示的结构单元以交替的头接头顺序，交替的头接尾顺序或交替的头接头和头接尾混合顺序排列。
3.根据权利要求1的共聚物或其药理学可按受的盐，其中用式(I)表示的结构单元和用式(II)表示的结构单元以无规顺序排列。
4.根据权利要求1-3的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基或三亚甲基。
5.根据权利要求4的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基。
6.根据权利要求1-5的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-50的整数。
7.根据权利要求6的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-40的整数。
8.根据权利要求7的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16或28-38的整数。
9.根据权利要求8的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16的整数。
10.根据权利要求1-9的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子或甲基。
11.根据权利要求10的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子。
12.根据权利要求1-11的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是氢原子或甲基。
13.根据权利要求12的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是甲基。
14.根据权利要求1-13的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是羟基，具有1-6个碳原子的烷氧基，或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基。
15.根据权利要求14的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是羟基或具有1-6个碳原子的烷氧基。
16.根据权利要求15的共聚物或其药理学可接受的盐，其包括至少一种用其中R3是具有1-6个碳原子的烷氧基的式(II)表示的结构单元和任选的至少一种用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元，其中用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元与用其中R3是具有1-6个碳原子的烷氧基的式(II)表示的结构单元的比率是4∶6-0∶10。
17.根据权利要求15或16的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是具有1-6个碳原子的烷氧基。
18.根据权利要求15-17的任一项的共聚物或药理学可按受的盐，其中所述具有1-6个碳原子的烷氧基是乙氧基。
19.根据权利要求14的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是羟基或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基。
20.根据权利要求19的共聚物或其药理学可接受的盐，其包括至少一种用其中R3是用式-NR4R5表示的基团的式(II)表示的结构单元和任选的至少一种用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基，其中用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元与用其中R3是用式-NR4R5表示的基团的式(II)表示的结构单元的比率是5∶5-0∶10。
21.根据权利要求20的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用其中R3是羟基的式(II)表示的结构单元与用其中R3是用式-NR4R5表示的基团的式(II)表示的结构单元的比率是4∶6-0∶10。
22.根据权利要求19-21的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5是相同或不同的，各自表示氢原子或者具有1-6个碳原子的烷基。
23.根据权利要求19-22的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式-NR4R5表示的基团是氨基，甲基氨基或二甲基氨基。
24.根据权利要求23的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式-NR4R5表示的基团是氨基。
25.根据权利要求23的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式-NR4R5表示的基团是二甲基氨基。
26.根据权利要求14的共聚物或药理学可接受的盐，其中R3是羟基。
27.根据权利要求14的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R3是1-氨基-2-丙醇基团。
28.根据权利要求1-27的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是10∶1-1∶10。
29.根据权利要求28的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是3∶1-1∶8。
30.根据权利要求28的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是2∶1-1∶2或1∶2-1∶6。
31.根据权利要求28的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与用式(II)表示的结构单元的比率是1∶1或在1∶2-1∶4的范围内。
32.根据权利要求1-31的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-200。
33.根据权利要求32的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-50。
34.根据权利要求33的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-20。
35.根据权利要求32的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是20-30。
36.根据权利要求32的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是30-40。
37.根据权利要求1-31的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤9.3nm。
38.根据权利要求37的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤7.3nm。
39.根据权利要求38的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤6.2nm。
40.根据权利要求39的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤4.7nm。
41.根据权利要求40的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是≤3.1nm。
42.根据权利要求37的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是1.5-4.7nm。
43.根据权利要求37的共聚物或其药理学可接受的盐，其中它的斯托克斯半径是3.1-6.2nm。
44.根据权利要求1的共聚物或其药理学可接受的盐，式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基，和R3表示羟基，可以任选被一个羟基取代的具有1-6个碳原子的烷氧基，或用式-NR4R5表示的基团，其中R4和R5彼此相同或不同，各自表示氢原子或者可以任选被一个羟基取代的具有1-6个碳原子的烷基。
45.根据权利要求1的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk表示亚乙基，R1表示氢原子，R2表示甲基，以及m、R3、式(I)和(II)的结构单元比率(组成比)和如果相关的其中R3表示羟基的式(II)的单元与其中R3表示非羟基的基团的式(II)的单元的比率(水解比)选自以下(i)m是6-16，R3是羟基，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(ii)m是28-38，R3是羟基，组成比是1∶1和平均聚合度是10-15；(iii)m是6-16，R3是氨基，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(iv)m是6-16，R3是二甲基氨基，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(v)m是6-16，R3是1-氨基-2-丙醇基团，组成比是1∶1和平均聚合度是30-40；(vi)m是6-16，R3选自乙氧基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40和水解比是4∶6；(vii)m是28-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是10-15和水解比是4∶6；(viii)m是28-38，R3是二甲基氨基，组成比是1∶1和平均聚合度是10-15；(ix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40，水解比是3.1∶6.9和共聚物是钠盐；(x)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40和水解比是1.4∶8.6；(xi)m是6-16，R3选自二甲基氨基和羟基，组成比是1∶1，平均聚合度是30-40，水解比是2.9∶7.1和共聚物是钠盐；(xii)m是6-16，R3是氨基，组成比是1∶2.4和平均聚合度是20-30；(xiii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.4∶9.6；(xiv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是2.9∶7.1；(xv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.9∶9.1；(xvi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.5∶9.5；(xvii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.3∶8.7；(xviii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.9∶8.1；(xix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.0∶9.0；(xx)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.8∶9.2；(xxi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是4.6∶5.4；(xxii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.2∶8.8；(xxiii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是2.0∶8.0；(xxiv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.1∶8.9；(xxv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是2.4∶7.6；(xxvi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.9∶9.1；(xxvii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.5∶8.5；(xxviii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.7∶9.3；(xxix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是4.5∶5.5；(xxx)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.4∶8.6；(xxxi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.7∶9.3；(xxxii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.8∶9.2；(xxxiii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.4∶8.6；(xxxiv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶3.1，平均聚合度是20-30和水解比是0.7∶9.3；(xxxv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是0.9∶9.1；(xxxvi)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶2.4，平均聚合度是20-30和水解比是1.9∶8.1；(xxxvii)m是6-16，R3选自乙氧基和羟基，组成比是约1∶3，平均聚合度是20-30和水解比是3.1∶6.9；(xxxviii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤9.3nm；(xxxix)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是3.1-6.2nm；(xl)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是1.5-4.7nm；(xli)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤3.1nm；(xlii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤7.8nm；(xliii)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤6.2nm；和(xliv)m是6-16，R3选自氨基和羟基，组成比是1∶1，水解比是1.4∶8.6和斯托克斯半径是≤4.7nm。
46.共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的一个或多个式(III)的羧酸酐结构部分进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应来获得，该共聚物含有作为组成单元的(a)和(b)(a)彼此相同或不同并且用以下通式(I)表示的一种或多种结构单元 式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，和R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基，该烷基可以任选被选自以下基团中的至少一个取代基所取代羟基，卤素原子和可任选被选自以下定义的取代基A中的1-5个取代基取代的具有6-14个碳原子的芳基，和(b)包括式(III)的羧酸酐结构部分的所述结构单元 取代基A选自具有1-6个碳原子的烷基，具有1-6个碳原子的烷氧基，卤素原子，羟基，硝基和羧基。
47.根据权利要求46的共聚物或其药理学可接受的盐，其中共聚物中的用式(I)表示的结构单元和用式(III)表示的结构单元以交替的头接头顺序，交替的头接尾顺序或交替的头接头和头接尾混合顺序排列。
48.根据权利要求46的共聚物或其药理学可接受的盐，其中共聚物中的用式(I)表示的结构单元和用式(III)表示的结构单元以无规顺序排列。
49.根据权利要求46-48的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基或三亚甲基。
50.根据权利要求49的共聚物或其药理学可接受的盐，其中Alk是亚乙基。
51.根据权利要求46-50的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-50的整数。
52.根据权利要求51的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是3-40的整数。
53.根据权利要求52的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16或28-38的整数。
54.根据权利要求53的共聚物或其药理学可接受的盐，其中m是6-16的整数。
55.根据权利要求46-54的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子或甲基。
56.根据权利要求55的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R1是氢原子。
57.根据权利要求46-56的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是氢原子或甲基。
58.根据权利要求57的共聚物或其药理学可接受的盐，其中R2是甲基。
59.根据权利要求46-58的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是10∶1-1∶10。
60.根据权利要求59的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是3∶1-1∶8。
61.根据权利要求59的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是2∶1-1∶2或者1∶2-1∶6。
62.根据权利要求59的共聚物或其药理学可接受的盐，其中用式(I)表示的结构单元与通过让式(III)的一个或多个结构单元进行选自(i)水解，(ii)氨解，(iii)胺解和(iv)醇解之中的一种或多种反应所获得的结构单元的比率是1∶1或者在1∶2-1∶4的范围内。
63.根据权利要求46-62的任一项的共聚物或药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-200。
64.根据权利要求63的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-50。
65.根据权利要求64的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是5-20。
66.根据权利要求63的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是20-30。
67.根据权利要求63的共聚物或其药理学可接受的盐，其中平均聚合度是30-40。
68.根据权利要求46的共聚物或其药理学可接受的盐，式中m是3-100的整数，Alk表示具有1-6个碳原子的亚烷基，和R1和R2是相同或不同的，各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基。
69.根据权利要求46-68的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的式(III)的羧酸酐结构部分进行氨解来获得。
70.根据权利要求69的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过用氨水进行氨解来获得。
71.根据权利要求46-68的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的式(III)的羧酸酐结构部分进行胺解来获得。
72.根据权利要求71的共聚物或其药理学可接受的盐，其通过使用二甲基胺水溶液进行胺解来获得。
73.根据权利要求46-68的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过让共聚物中的式(III)的羧酸酐结构部分进行醇解来获得。
74.根据权利要求73的共聚物或其药理学可接受的盐，其可通过使用乙醇进行醇解来获得。
75.药物组合物，其包含药学可接受的稀释剂或载体和根据权利要求1-74的任一项的至少一种本发明的共聚物或药理学可接受的盐。
76.根据权利要求75的药物组合物，其中所述组合物进一步包括至少一种蛋白或其类似物或变体。
77.根据权利要求76的药物组合物，其中蛋白或其类似物或变体是碱性蛋白。
78.根据权利要求77的药物组合物，其中碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体。
79.根据权利要求77的药物组合物，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体。
80.根据权利要求79的药物组合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF。
81.根据权利要求79的药物组合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体。
82.根据权利要求79的药物组合物，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，其中所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定。
83.根据权利要求79的药物组合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380。
84.根据权利要求79的药物组合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380。
85.能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，所述改性剂包括根据权利要求1-74的任一项的共聚物或其药理学可接受的盐。
86.根据权利要求85的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中该蛋白是碱性蛋白。
87.根据权利要求86的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体。
88.根据权利要求86的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体。
89.根据权利要求88的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF。
90.根据权利要求88的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体。
91.根据权利要求88的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定。
92.根据权利要求88的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380。
93.根据权利要求88的能够改性蛋白或其类似物或变体的改性剂，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380。
94.复合物，其包含结合于根据权利要求1-74的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的至少一种蛋白或其类似物或变体。
95.根据权利要求94的复合物，其中该蛋白是碱性蛋白。
96.根据权利要求95的复合物，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体。
97.根据权利要求95的复合物，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体。
98.根据权利要求97的复合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF。
99.根据权利要求97的复合物，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体。
100.根据权利要求97的复合物，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定。
101.根据权利要求97的复合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380。
102.根据权利要求97的复合物，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380。
103.药物组合物，其包含有效量的药理学活性剂与载体或稀释剂，其中所述药理学活性剂以根据权利要求94-102的任一项的复合物的形式存在。
104.用于延长在给药于患者之后蛋白或其类似物或变体在血流中保留的时间的方法，该方法包括将所述蛋白或其类似物或变体与根据权利要求1-74的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐复合。
105.根据权利要求104的方法，其中该蛋白是碱性蛋白。
106.根据权利要求105的方法，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体。
107.根据权利要求105的方法，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体。
108.根据权利要求107的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF。
109.根据权利要求107的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体。
110.根据权利要求107的方法，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定。
111.根据权利要求107的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380。
112.根据权利要求107的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380。
113.用于治疗或预防对蛋白或其类似物或变体敏感的患者的疾病的方法，该方法包括将有效量的包含结合于根据权利要求1-74的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的所述蛋白或其类似物或变体的复合物给药于所述患者。
114.根据权利要求113的方法，其中该蛋白是碱性蛋白。
115.根据权利要求114的方法，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体。
116.根据权利要求114的方法，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体。
117.根据权利要求116的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF。
118.根据权利要求116的方法，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体。
119.根据权利要求116的方法，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定。
120.根据权利要求116的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380。
121.根据权利要求116的方法，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380。
122.根据权利要求116-121的任一项的方法，其中所述疾病是骨代谢疾病。
123.包含结合于根据权利要求1-74的任一项的至少一种共聚物或其药理学可接受的盐的蛋白或其类似物或变体的复合物在制备用于预防或治疗对所述蛋白或其类似物或变体敏感的疾病的药剂中的应用。
124.根据权利要求122的应用，其中该蛋白是碱性蛋白。
125.根据权利要求123的应用，其中该碱性蛋白是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，破骨细胞形成抑制因子(OCIF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，脑衍生神经营养性因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，人生长激素(HGH)，肝细胞生长因子(HGF)，或者血管内皮生长因子(VEGF)，或者它们的类似物或变体。
126.根据权利要求123的应用，其中该碱性蛋白是破骨细胞形成抑制因子(OCIF)或其类似物或变体。
127.根据权利要求126的应用，其中所述OCIF或其类似物或变体是天然型或重组型OCIF。
128.根据权利要求126的应用，其中所述OCIF或其类似物或变体是单体或二聚体。
129.根据权利要求126的应用，其中所述OCIF是具有大约60000的分子量的人OCIF的单体，或者具有大约120000的分子量的人OCIF的二聚体，所述分子量通过SDS-PAGE在非还原条件下测定。
130.根据权利要求116的应用，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21到+380。
131.根据权利要求116的应用，其中所述OCIF包括序列表的SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1到+380。
132.根据权利要求126-131的应用，其中所述疾病是骨代谢疾病。
全文摘要
本发明提供了共聚物或其药理学可接受的盐，其含有作为组成单元的(a)和(b)(a)一种或多种式(Ⅰ)的结构单元(Ⅰ)式中m是3－100的整数，Alk表示亚烷基，R
文档编号C08F8/12GK1795214SQ200480014328
公开日2006年6月28日 申请日期2004年3月24日 优先权日2003年3月24日
发明者粕谷裕司, 本间雅 申请人:三共株式会社