专利名称：双模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球及其制备方法
技术领域：
本发明涉及聚合物微球，特别涉及双模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球及其制备方法。
背景技术：
海藻酸盐是一类天然多糖聚合物，在食品、化妆品、生物医药领域都得到了广泛的应用。海藻酸钠因其在多价阳离子存在时的凝胶化作用而倍受瞩目，但由于离子交联海藻酸盐在电解质环境中的不稳定性以及较差的机械强度，限制了其进一步的应用。为此很多研究者尝试将海藻酸盐与其它聚合物复合来提高应用性能。
将海藻酸钠与水性聚氨酯共混制膜，与阳离子聚合物，如壳聚糖和多聚赖氨酸等配合以及与明胶复合制备支架的研究都有报道L.Becheran-Maron。C.Peniche。W.Arguelles-Monal.Study of the interpolyelectrolyte reaction between chitosan andalginate influence of alginate composition and chitosan molecular weight.International journal of biological macromolecules 34(2004)127-133B.Thu。P.Bruheim。T.Espevik。et al.Alginate polycation microcapsules.Biomaterials17(1996)1031-1040Y.S.Choi。S.R.Hong。Y.M.Lee。et al.Study ongelatin-containing artificial skinPreparation and characteristics of novelgelatin-alginate sponge.Biomaterials。1999。20409-417。将聚乙烯醇(PVA)与海藻酸钙复合的研究也有报道S.Hertzberg。E.Moen。C.Vogelsang.Mixedphoto-cross-linked polyvinyl alcohol and calcium-alginate gels for cell entrapment.Appl Microbiol Biotechnol。1995。4310-17。李沁华等人通过对PVA和海藻酸钠两种聚合物的分步交联，获得了具有交联结构的PVA/海藻酸钙复合材料。但是上述几种改性方法中改性组分的用量都较多。海藻酸钠/明胶或海藻酸钠/壳聚糖、海藻酸钠/多聚赖氨酸复合体系在离子溶液环境中稳定性较差。而海藻酸钠/聚乙烯醇(PVA)体系中所用的改性组分PVA与海藻酸钠相容性较差。
发明内容
为了解决上述问题，本发明采用一种新的、简便而有效的方法改善海藻酸盐基材的机械强度和在离子环境中的稳定性。在此基础上引入乳液模板和大分子模板，制备具有特殊精细结构的聚合物微球。同时新的体系仍能像海藻酸钠那样在钙离子存在下快速凝胶化，能用反相悬浮交联法制得聚合物微球。
模板法是将具有特定空间结构和基团的物质一“模板”引入到基材中，随后将模板除去来制备具有“模板识别位”的基材的一种手段。用模板法以获得具有分离、识别、吸附等功能的材料的制备技术就是“模板技术”。根据所要获得的材料的结构和性质，模板物可以选择乳液、低分子化合物、低聚物、聚合物、分子聚集体、金属离子等。乳液模板法是为适应孔尺寸均一性的要求而产生的，该方法可以产生从几纳米至几微米的高度单分散性的介孔或大孔材料，已有的关于乳液模板法的报道多用于多孔无机材料和多孔合成聚合物材料的制备，关于乳液模板法制备多孔天然聚合物材料特别是软湿凝胶的研究很少。分子印迹是一种以分子为模板，制备对于特定分子具有特异性识别功能的聚合物模板合成技术。用低交联度聚合物凝胶作为印迹基材制备蛋白质印迹聚合物属于分子印迹技术研究的前沿领域。
本发明的目的是提供一种乳液模板法制取的羟乙基纤维素(HEC)改性海藻酸盐微球。
本发明的另一目的是提供一种大分子模板法制取的羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球。
本发明的另一目的是提供一种乳液模板法制取羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种大分子模板法制取羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备方法。
本发明提供了一种乳液模板法制取的羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球，其孔径为1-10um。可由下述方法制备将羟乙基纤维素溶液与海藻酸钠水溶液充分混合，静置脱泡；向混合溶液中加入液体石蜡和乳化剂，搅拌一定时间得到外观均一的乳液；将乳液在机械搅拌下分散在含有分散剂的的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；用去离子水冲洗钙离子初步交联所得微球之后，将其放在醛类交联剂溶液中进一步交联；最后用乙醚脱除微球中的石蜡后制得。
本发明提供了一种大分子模板法制取的羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球，可由下述方法制备将海藻酸钠溶解于牛血清白蛋白(BSA)水溶液中得到海藻酸钠/BSA复合物溶液，将羟乙基纤维素溶液与此复合物溶液充分混合；将混合液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；用去离子水冲洗钙离子初步交联所得微球之后，将其放在醛类交联剂溶液中进一步交联；然后用Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷一盐酸)缓冲液洗脱微球中的模板分子BSA，制得BSA印迹羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球。
本发明提供了一种乳液模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备方法，包括如下步骤将羟乙基纤维素溶液与海藻酸钠水溶液充分混合，静置脱泡；向混合溶液中加入液体石蜡和乳化剂搅拌一定时间得到外观均一的乳液；将乳液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；将得到的微球放在醛类交联剂溶液中进一步交联，然后用乙醚脱除微球中的石蜡，得到大孔(1-10μm)羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球。
所述液体石蜡的质量占海藻酸钠和羟乙基纤维素混合溶液质量的2.5％-12.5％，优选为5％-10％。乳化剂为非离子型，可使用单一种类，也可由两种复配而成，只要控制乳化剂的HLB值(亲水亲油平衡值)在10-13之间即可，优选Span85和Tween80复配，用量为其质量占液体石蜡质量的20％-200％，优选60％-120％。
本发明还提供了一种大分子模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备方法，包括如下步骤将海藻酸钠溶解于牛血清白蛋白(BSA)水溶液中得到海藻酸钠/BSA复合物溶液，将羟乙基纤维素溶液与此复合物溶液充分混合；将混合液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；用去离子水冲洗钙离子初步交联所得微球之后，将其放在醛类交联剂溶液中进一步交联；然后用Tris-HCl缓冲液洗脱微球中的模板分子BSA，制得BSA印迹羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球。
所述牛血清白蛋白(BSA)水溶液的浓度为10-50μmol/L。
以上乳液模板法和大分子模板法制取改性微球的方法中，所述羟乙基纤维素的质量占海藻酸钠质量的3-10％。优选5-10％，最优选5％。海藻酸钠水溶液的质量百分浓度为2-3.5％。微球制备过程中的搅拌速度为300-450r/min。油相和水相的体积比为2∶1-3∶1，优选2∶1-2.5∶1，最优选2∶1。有机油相选用三氯甲烷、正己烷、丙酮及氯仿，优选三氯甲烷和正己烷组合使用，因为其混合密度接近海藻酸钠水溶液的密度。分散剂优选由Span80、Span85复配而成。其含量为按所用分散剂的质量(g)占油相体积(ml)的百分数计为1.5％-4.5％，优选为3.0％-4.0％。氯化钙水溶液的质量百分浓度为2％-3％，其体积与海藻酸钠水溶液体积的比值为0.75-1.50。醛类交联剂一般为液体，使用时需加水稀释成一定浓度，按纯的醛的体积占稀释之后醛的水溶液的体积的百分数计，醛类交联剂水溶液的体积百分浓度为2％-15％，优选5％-8％。醛类交联剂选自戊二醛、甲醛、乙醛或甘油醛，优选为戊二醛。
以上乳液模板法和大分子模板法制取改性微球的方法中，在所述步骤混合液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相后，还可加入体积占海藻酸钠水溶液体积的25％，质量百分浓度为1％-3％的助表面活性剂PVP(聚乙烯吡喀烷酮)水溶液，目的是为了得到球形规整的粒子，有效避免微球制备过程中发生团聚。
在本发明中，海藻酸钠与羟乙基纤维素的配合基于海藻酸钠大分子链上的羟基和羧基与羟乙基纤维素分子链上的羟基之间的氢键相互作用。反应结构式如下所示 海藻酸钠单元羟乙基纤维素单元经研究表明，醛类交联剂的作用主要是与配合物中的羟乙基纤维素上的羟基发生共价键交联反应，而与海藻酸钠分子链上的羟基反应程度很低。
该发明采用的改性方法，由于形成了聚合物互穿网络并生成了共价交联键，可以明显地抑制微球在0.9％NaCl溶液中的溶胀，如附图1所示。
微球机械强度测试结果表明，改性微球经24h震摇后仍然保持完好的球形，而未用羟乙基纤维素改性的海藻酸钙微球则有一定程度破损，见附图2。
在乳液模板法制取微球的方法中，液体石蜡和海藻酸钠水溶液在表面活性剂的作用下可以制得粒径较为均一的乳液，从而制得孔径分布较窄的大孔海藻酸钙微球，乳液模板法同样适用于制备大孔羟乙基纤维素改性海藻酸盐聚合物微球。理论上讲，由乳液模板法制得的海藻酸盐微球中的孔径应与乳液的粒径相当，本发明的乳液形貌显微照片及粒径的统计分布见附图3。因为湿态凝胶微球的孔径目前无法测得，所以附图4给出了干燥之后大孔微球的扫描电镜照片。不过干燥之后由于微球的收缩，微球表面出现很多皱褶，微球中的孔也有一定程度的变形，但仍能证明得到了孔径较为均一的大孔微球。
乳液模板法所得改性微球的光学显微镜照片表明，乳液液滴在微球中均匀分布并可以被有效地脱除，得到大孔羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球，见附图5。
对BSA印迹海藻酸盐微球的吸附特性的研究表明，BSA大分子印迹海藻酸钙微球与未印迹海藻酸钙微球相比，在同等浓度的BSA水溶液中，印迹微球具有较高的蛋白质吸附量，表现出一定的模板印迹效果，见附图6。对BSA印迹羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的吸附特性的研究表明，改性微球比未改性的微球能更好地保持结构稳定性和印迹空穴的形状，从而更明显地体现出印迹效果，见附图7。
本发明采用羟乙基纤维素与海藻酸钠配合并用醛类交联剂二次交联，与其它已有的改性方法相比，本发明中所用的羟乙基纤维素是一种天然高分子衍生物，价格低廉易得，并且只用少量(羟乙基纤维素的质量占海藻酸钠质量的3-10％)就可以得到明显的改性效果。与海藻酸钠/明胶或海藻酸钠/壳聚糖、海藻酸钠/多聚赖氨酸复合体系相比，由于本发明的改性体系中有共价交联键生成，在离子溶液环境中更为稳定。与海藻酸钠/聚乙烯醇(PVA)体系相比，本发明中所采用的改性组分羟乙基纤维素与海藻酸钠具有良好的相容性，因而少量使用即可产生协同增效的作用。
本发明中的乳液模板法改性海藻酸盐微球和大分子模板法改性海藻酸盐微球都可用作细胞培养载体。越来越多的研究表明，不仅细胞载体的本体性能，载体的表面拓扑结构和电荷分布也会影响细胞的生物学行为。乳液模板法所得大孔微球和大分子模板法所得的具有大分子印迹空穴的微球用于细胞培养和研究细胞的生长行为，将具有重要意义。
另外由于海藻酸盐具有的独特的螯合重金属离子的特性，本发明中乳液模板法所得大孔改性微球也可以用于重金属离子富集。
大分子模板法海藻酸盐基改性微球的制备和研究结果对于蛋白质分子印迹技术的发展也具有重要的学术价值。以蛋白质为模板印迹的分子印迹聚合物可以作为抗体、酶或其它天然生物结构的替代物以及细胞支架材料，在生物技术和医学等领域显示出广阔的应用前景。传统的分子印迹基材多是高交联度的刚性聚合物，对于非刚性、体积庞大的模板蛋白质分子从分子印迹聚合物上洗脱和识别过程中模板蛋白质分子重新进入“印迹孔穴”显然是不利和困难的。而适度交联的聚合物凝胶微球因其可根据环境的变化改变其交联网络和凝胶孔穴的大小，有利于模板蛋白质的洗脱和吸附。
图1为未用羟乙基纤维素改性海藻酸钙微球(Ca-Alg)和改性微球(Alg/HEC)在0.9％NaCl溶液中的溶胀曲线。
图2为震摇后微球的显微镜照片(放大倍数40倍)。其中A为改性微球(Alg/HEC)，B为未用羟乙基纤维素改性海藻酸钙微球(Ca-Alg)。
图3为乳液显微形貌及粒径分布图，其中A为由液体石蜡、海藻酸钠/羟乙基纤维素水溶液以及表面活性剂所制得的乳液的光镜照片，B为照片A中乳液的粒径统计分布图。
图4为干态海藻酸钙微球的扫描电镜照片，孔径约3-4.5μm。
图5为乳液模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球模板脱除的显微镜照片。其中A为模板部分脱除时的微球形貌，B为模板完全脱除时的微球形貌。
图6为BSA印迹和未印迹海藻酸钙微球在20μmol/L BSA水溶液中的吸附量-时间曲线，其中■为未印迹海藻酸钙微球(Ca-Alg)，●为BSA大分子印迹海藻酸钙微球(BSA-Ca-Alg)。
图7为BSA印迹微球在20μmol/L BSA水溶液中的吸附量-时间曲线，其中■为未用羟基纤维素改性的微球(BSA-Ca-Alg)，▲为用羟基纤维素改性的微球(BSA-Ca-Alg/HEC)。
具体实施例方式
实施例1乳液模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球(Alg/HEC)的制备(1)海藻酸钠0.6g溶于20ml去离子水中配制成3％的海藻酸钠溶液，加入1ml 2％的HEC溶液，充分混合均匀，加入1g液体石蜡、0.1gSpan85、0.4gTw80，电磁搅拌1h，成为均一的乳白色乳液；(2)将乳液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 0.8g，span85 0.8g；(3)搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 2％PVP的水溶液(助表面活性剂)，继续搅拌15min；(4)加入20ml 3％CaCl2，搅拌30min；
(5)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗，然后置于5％戊二醛(pH＝6.00)交联液中交联48h；(6)将充分交联的微球从交联液中取出，用梯度乙醇置换微球中的水，将微球放入无水乙醚中48h脱除石蜡。用大量去离子水冲洗脱除石蜡的微球，保存在去离子水中备用。
对比例1未用羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球(Ca-Alg)的制备(1)海藻酸钠0.6g溶于20ml去离子水中配制成3％的海藻酸钠溶液，充分混合均匀，加入1g液体石蜡、0.1gSpan85、0.4gTw80，电磁搅拌1h，成为均一的乳白色乳液；(2)将乳液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 0.8g，span85 0.8g；(3)搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 2％PVP的水溶液(助表面活性剂)，继续搅拌15min；(4)加入20ml 3％CaCl2，搅拌30min；(5)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗，然后将微球保存在去离子水中备用。
取适量实施例1和对比例1中制得的微球在真空烘箱中40℃下干燥至恒重，得干态微球。将等量干态的Alg/HEC微球和Ca-Alg微球分别放入同样规格的烧杯中，向两只烧杯中分别加入50ml 0.9％NaCl溶液，用保鲜膜将烧杯口封好，每隔一定时间，从0.9％NaCl溶液中取出微球，用滤纸小心拭去微球表面的水，在高精度电子天平(型号FA 1104。中国上海)上称重。溶胀率以某一时刻所测微球的质量与微球起始质量的比值计。得溶胀曲线见附图1。
将实施例1和对比例1中所制微球进行机械强度测试。将等量湿态、完好无损的Alg/HEC微球和Ca-Alg微球放入两只同样规格的锥形瓶中，每只锥形瓶中都盛有30ml 0.9％的NaCl溶液。将装有样品的锥形瓶放入25℃恒温震荡箱中(型号HZQ-F。中国哈尔滨)震荡24小时后，从锥形瓶中取出微球，置于光学显微镜(型号BX51TF。厂家Olympus Company)下观察形貌。震摇后微球的显微镜照片(放大倍数40倍)见附图2。
用梯度乙醇(20％，40％，60％，80％，100％)置换实施例1中制得的充分交联的湿态微球中的水，将微球放在盛有一定体积的无水乙醚的锥形瓶中，将瓶口封好。隔一定时间从乙醚中取出样品，用大量去离子水冲洗并置于通风处以利于微球中的乙醚充分挥发掉，然后将微球放在连有数码相机的光学显微镜下(型号BX51TF。厂家Olympus Company)拍摄微球的形貌，得附图5.
实施例2大分子模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球(BSA-Ca-Alg/HEC)的制备(1)向20ml20μmol/LBSA水溶液中加入海藻酸钠0.6g，充分溶解后，加入1ml2％的HEC溶液，混合均匀；(2)将混合液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 0.8g，span85 0.8g；(3)搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 3％PVP的水溶液(助表面活性剂)，继续搅拌15min；(4)加入20ml 3％CaCl2，搅拌30min；(5)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗，然后置于5％戊二醛(pH＝6.00)交联液中交联48h；(6)将充分交联的微球从交联液中取出，置于pH为7.5的Tris-HCl缓冲液中洗脱蛋白质模板分子。然后将微球保存在去离子水中备用。
对比例2未印迹海藻酸钙微球(Ca-Alg)的制备(1)制20ml 3％海藻酸钠溶液；(2)将混合液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 0.8g，span85 0.8g；(3)搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 2％PVP的水溶液(助表面活性剂)，继续搅拌15min；(4)加入20ml 3％CaCl2，搅拌30min；(5)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗；(6)用洗脱BSA印迹微球的方法处理未印迹的海藻酸钙微球，即也将未印迹的海藻酸钙微球放在pH为7.5的Tris-HCl缓冲液中一定时间，以使后续的蛋白质吸附实验中印迹和未印迹的微球具有可比性。
对比例3BSA印迹海藻酸钙(BSA-Ca-Alg)微球的制备(1)向20ml20μmol/LBSA水溶液中加入海藻酸钠0.6g；(2)将混合液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 0.8g，span85 0.8g；(3)搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 2％PVP的水溶液(助表面活性剂)，继续搅拌15min；(4)加入20ml 3％CaCl2，搅拌30min；(5)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗，(6)将所得微球从交联液中取出，置于pH为7.5的Tris-HCl缓冲液中洗脱蛋白质模板分子。然后将微球保存在去离子水中备用。
准确称取同等质量的对比例2制得的未印迹海藻酸钙微球和对比例3制得的BSA印迹海藻酸钙微球，分别放入盛有15ml20μmol/L BSA水溶液的同样规格的小烧杯中，将烧杯口封好，置于25℃恒温振荡箱中(型号HZQ-F。中国哈尔滨)，每隔一定时间，用可见-紫外分光光度计(HitachiU-1800)测烧杯中BSA溶液的吸光度，再根据BSA溶液的标准曲线，将不同时间测得的吸光度转换为浓度，按公式Q＝(C0-Ct)V/W计算微球在BSA溶液中的吸附量。(公式中Q代表某一时刻微球的吸附量，Ct代表蛋白质的起始浓度，Ct是某一时刻蛋白质的浓度，V代表蛋白质的体积，W代表微球的质量)结果见附图6。将实施例2和对比例3制得的微球按上述条件进行对比实验，结果见附图7。
实施例3将20ml 3％的海藻酸钠溶液与1.5ml 2％的羟乙基纤维素充分混合，向混合液中加入0.8克液体石蜡，0.16克Span85，0.64克Tween 80，高速搅拌1小时，得到乳液。用胶头滴管取少量制得的乳液，滴于盖玻片上，迅速放在连有数码相机的光学显微镜下(型号BX51TF。厂家Olympus Company)拍摄乳液的形貌，得附图3A，用Photoshop软件对图3A中的乳液粒子作尺寸统计，得到附图3B。
实施例4向20ml 3％的海藻酸钠溶液中加入1.5克液体石蜡，0.2克Span85和0.8克Tween80。搅拌1小时得到乳液。将该乳液分散在40ml含有0.6克Span85和0.6克Span80的有机油相中，搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 2％PVP的水溶液，继续搅拌15min；加入20ml3％CaCl2，搅拌30min；将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗；用梯度乙醇置换微球中的水，将微球放在40℃真空烘箱中干燥。将干燥微球表面喷金，用扫描电镜(型号XL-30，厂家Philips)观察形貌。得附图4。
实施例5乳液模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备(羟乙基纤维素含量10％，孔径1um)(1)海藻酸钠0.6g溶于20ml去离子水中配制成3％的海藻酸钠溶液，加入3ml 2％的HEC溶液，充分混合均匀，加入0.5g液体石蜡、0.2gSpan85、0.8gTween80，电磁搅拌1h，成为均一的乳白色乳液；(2)将乳液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 0.8g，span85 0.8g；(3)搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 2％PVP的水溶液(助表面活性剂)，继续搅拌15min；(4)加入20mi 3％CaCl2，搅拌30min；(5)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗，然后置于5％戊二醛(pH＝6.00)交联液中交联48h；(6)将充分交联的微球从交联液中取出，用梯度乙醇置换微球中的水，将微球放入无水乙醚中48h脱除石蜡。用大量去离子水冲洗脱除石蜡的微球，保存在去离子水中备用。
实施例6乳液模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备(海藻酸钠浓度2％，孔径10um)1)海藻酸钠0.4g溶于20ml去离子水中配制成2％的海藻酸钠溶液，加入1ml2％的HEC溶液，充分混合均匀，加入1.5g液体石蜡、0.10gSpan85、0.40gTween80，电磁搅拌1h，成为均一的乳白色乳液；(2)将乳液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 0.8g，span85 0.8g；(3)搅拌5min钟后向悬浮体系中加入将5ml 1％PVP的水溶液(助表面活性剂)，继续搅拌15min；(4)加入20ml 3％CaCl2，搅拌30min；(5)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗，然后置于5％戊二醛(pH＝6.00)交联液中交联48h；(6)将充分交联的微球从交联液中取出，用梯度乙醇置换微球中的水，将微球放入无水乙醚中48h脱除石蜡。用大量去离子水冲洗脱除石蜡的微球，保存在去离子水中备用。
实施例7大分子模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备(1)向10ml50μmol/LBSA水溶液中加入海藻酸钠0.6g，充分溶解后，加入1ml2％的HEC溶液，混合均匀；10-50μmol/L(2)将混合液在恒速机械搅拌的条件下分散在有机油相中。油相的组成为三氯甲烷16ml，正己烷24ml；表面活性剂span80 1.6g；(3)加入20ml 3％CaCl2，搅拌30min；(4)将微球从悬浮液中分离出来，用大量去离子水冲洗，然后置于5％乙醛交联液中交联48h；(5)将充分交联的微球从交联液中取出，置于pH为7.5的Tris-HCl缓冲液中洗脱蛋白质模板分子。然后将微球保存在去离子水中备用。
权利要求
1.一种乳液模板法制取的羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球，孔径为1-10um，其特征是可由下述方法制备将羟乙基纤维素溶液与海藻酸钠水溶液充分混合，静置脱泡；向混合溶液中加入液体石蜡和乳化剂，搅拌一定时间得到外观均一的乳液；将乳液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；用去离子水冲洗钙离子初步交联所得微球之后，将其放在醛类交联剂溶液中进一步交联；最后用乙醚脱除微球中的石蜡后制得。
2.一种大分子模板法制取的羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球，其特征是可由下述方法制备将海藻酸钠溶解于牛血清白蛋白(BSA)水溶液中得到海藻酸钠/BSA复合物溶液，将羟乙基纤维素溶液与此复合物溶液充分混合；将混合液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；用去离子水冲洗钙离子初步交联所得微球之后，将其放在醛类交联剂溶液中进一步交联；然后用Tris-HCl缓冲液洗脱微球中的模板分子BSA，制得BSA印迹羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球。
3.一种乳液模板法制取羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备方法，其特征是包括如下步骤将羟乙基纤维素溶液与海藻酸钠水溶液充分混合，静置脱泡；向混合溶液中加入液体石蜡和乳化剂搅拌一定时间得到外观均一的乳液；将乳液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；将得到的微球放在醛类交联剂溶液中进一步交联，然后用乙醚脱除微球中的石蜡，得到大孔(1-10μm)羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球。
4.如权利要求3所述的改性微球的制备方法，其特征是所述液体石蜡的质量占海藻酸钠和羟乙基纤维素混合溶液质量的2.5％-12.5％，乳化剂为非离子型，其质量占液体石蜡质量的20％-200％。
5.如权利要求4所述的改性微球的制备方法，其特征是所述液体石蜡的质量占海藻酸钠和羟乙基纤维素混合溶液质量的5％-10％，乳化剂为Span85和Tween80复配而成，其质量占液体石蜡质量的60％-120％。
6.一种大分子模板法制取羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球的制备方法，其特征是包括如下步骤将海藻酸钠溶解于牛血清白蛋白水溶液中得到海藻酸钠/BSA复合物溶液，将羟乙基纤维素溶液与此复合物溶液充分混合；将混合液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球；用去离子水冲洗钙离子初步交联所得微球之后，将其放在醛类交联剂溶液中进一步交联；然后用Tris-HCl缓冲液洗脱微球中的模板分子BSA，制得BSA印迹羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球。
7.如权利要求6所述的改性微球的制备方法，其特征是所述牛血清白蛋白水溶液的浓度为10-50μmol/L。
8.如权利要求3至7中任一权利要求所述的改性微球的制备方法，其特征是所述羟乙基纤维素的质量占海藻酸钠质量的3-10％，海藻酸钠水溶液的质量百分浓度为2-3.5％，微球制备过程中的搅拌速度为300-450r/min，油相和水相的体积比为2∶1-3∶1，所用分散剂的质量(g)占油相体积(ml)的百分数计为1.5％-4.5％，氯化钙水溶液的质量百分浓度为2％-3％，其体积与海藻酸钠水溶液体积的比值为0.75-1.50，醛类交联剂水溶液的的体积百分浓度为2％-15％。
9.如权利要求8所述的改性微球的制备方法，其特征是所述羟乙基纤维素的质量占海藻酸钠质量的5-10％，油相和水相的体积比为2∶1-2.5∶1，所用分散剂的质量(g)占油相体积(ml)的百分数计3.0％-4.0％，分散剂为Span80和Span85复配而成，醛类交联剂为戊二醛，其水溶液的体积百分浓度为5％-8％，有机油相为三氯甲烷和正己烷组合。
10.如权利要求3或6所述的改性微球的制备方法，其特征是在所述步骤混合液在机械搅拌下分散在含有分散剂的有机油相后，加入质量百分浓度为1％-3％的助表面活性剂PVP水溶液，其体积占海藻酸钠水溶液体积的25％。
全文摘要
双模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球及制备方法。一种为乳液模板法改性微球，即将羟乙基纤维素溶液与海藻酸钠水溶液混合，加入液体石蜡和乳化剂，再将其分散在有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球，在醛类交联剂中进一步交联，最后脱除液体石蜡后制得。另一种为大分子模板法改性微球，即将海藻酸钠溶于牛血清白蛋白水溶液中，将羟乙基纤维素溶液与此溶液混合后分散在有机油相中，用氯化钙水溶液交联成球，在醛类交联剂中进一步交联，最后用缓冲液洗脱模板分子制得。用上两种方法制取的改性微球工艺简便，可得到孔径较为均一的大孔微球和具有大分子模板印迹效果的微球，并有效地改善了海藻酸钙微球的机械强度和在离子环境中的不稳定性。
文档编号C08K3/16GK1807464SQ20051001583
公开日2006年7月26日 申请日期2005年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者成国祥, 张凤菊, 英晓光 申请人:天津大学