醛结合的类黄酮制剂的制作方法

专利名称：：醛结合的类黄酮制剂的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及类黄酮的制剂，并且特别涉及递送试剂结合的类黄酮和/或递送试剂结合的类黄酮寡聚体。
背景技术：
：类黄酮是植物多酚的最多的和研究最充分的类别之一。类黄酮由一大类天然存在于水果和蔬菜中的低分子量多酚物质组成，并且是人饮食的组成部分。干燥的绿茶叶可以含有多达30重量％的类黄酮，包括高百分比的被称为儿茶素(黄烷-3-醇衍生物或儿茶素基的类黄酮)的类黄酮，包括(-)-表儿茶素、(-)-表焙儿茶素(epigallocatechin)、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素掊酸酯(epicatechingallate)和(-)-表焙儿茶素掊酸酯(epicatechingallate)。近年来，这些绿茶儿茶素吸引了许多注意，因为已经认识到它们具有生物学和药理学性质，包括抗菌的、抗肿瘤的、抗血栓形成的、血管扩张的、抗氧化的、抗诱变的、抗致癌的、高胆固醇血症的(hypercholesterolemic)、抗病毒的和抗炎的性质，所述性质已经在许多的人、动物和体外研究中证明(JankunJ.,等.Nature387,561(1997);BodoniA.等.J.Nutr.Biochem.13,103-111(2002);NakagawaK.etal.J.Agric.FoodChem.47，3967-3973(1999))。这些生物学和药理学性质在预防疾病和保护基因组稳定性中是潜在有益的。认为儿茶素的许多有益效果与所述儿茶素的抗氧化作用有关系(TeraoJ.,等.Arch.Biochem.Biophys.308,278-284(1994))。在儿茶素之中，作为绿茶主要组分的(-)-表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)被认为具有最高的活性，可能由于C3位的三羟基B环和掊酸酯部分(IsemuraM.,等.Biofactors13,81-85(2000);IkedaI,等.J.Nutr.135,155(2005);LillG"等.FEBSLetters546,265-270(2003);SakanakaS.和OkadaY.J.Agric.FoodChem.52,1688-1692(2004);YokozawaT"等，J.Agric.FoodChem.48,5068-5073(2000))。通常，类黄酮的活性半衰期在身体内部限于数小时；这些化合物的代谢还没有确定。尽管包括EGCG的儿茶素的有利的抗氧化和抗癌性质，由于固有的体积限制，通过直接摄取大量绿茶在体内实现该化合物的治疗水平是不切实际的。目卩，为了单独通过饮食获得来自类黄酮的治疗的或药理学的益处，将需要摄取大于实际消耗的食品和饮料的量。而且，对于包括EGCG的数种类黄酮已经报道了助氧化剂活性，使直接摄取天然绿茶成为不太有效的递送EGCG的方法(YenG.C，等.J.Agric.FoodChem.45,30-34(1997);YamanakaN,等.FEBSLett.401,230-234(1997);Roedig-Pe腿anA.禾卩GordonM.H.J.Agric.FoodChem.1997,45,4267-4270)。另一方面，已经报道了相对高分子级分的萃取植物多酚(矢车菊苷配基)和合成寡聚的(+)-儿茶素和芸香苷与低分子量类黄酮相比显示增强的生理学性质诸如抗氧化剂和抗致癌活性，(ZhaoJ.,等.Carcinogenesis,1999,20，1737-1745;ArigaT.禾卩HamanoM.Agric.Biol.Chem.54，2499-2504(1990);ChungJ.E.,等.Biomacromolecules5,113-118(2004);KurisawaM.，等.Biomacromolecules4,1394-1399(2003);HagermanA.E.,等.J.Agric.FoodChem.46，1887(1998))并且无助氧化剂作用(HagermanA.E.,等.J.Agric.FoodChem.46，1887(1998);LiC.和XieB.J.Agric.FoodChem.48，6362(2000))。然而，预期天然产生的和合成的高分子量类黄酮都不能在摄取以后吸收并输送至其它组织，因为这些化合物一般是大的，与蛋白质形成强络合物并且是耐降解的(ZhaoJ.,等.Carcinogenesis,1999.20,1737-1745)。在经由口服摄入食物和饮料消耗类黄酮的情况下，类黄酮可以作为抗氧化剂起作用而在消化期间保护消化道免受氧化性损伤。然而，可以预期类黄酮仅保持在消化道中，并且因而它们的有益生理活性不可能利用至其它组织。而且，它们的强疏水性以及它们与蛋白质形成络合物的趋势使得这些化合物递送困难。提供这些化合物的有益属性，合乎需要的是发现将允许消耗更大量的递送方法，或者将在上下文中提供儿茶素基类黄酮的用途，其中通常没有发现它们，潜在提供增加的消耗和/或对于儿茶素基类黄酮的暴露，因此增加得到这些化合物药理学益处的潜力。发明概述在一个方面中，提供含有游离醛递送剂和类黄酮的结合物，所述递送剂结合在类黄酮A环的C6和/或C8位。在另一个方面中，提供包含描述于此的结合物的递送载体。[OOll]在另外的方面中，提供将具有游离醛基的递送剂在酸存在下结合至类黄酮的方法，所述方法包含将递送剂与类黄酮在酸催化剂存在下反应。在更另外的方面中，将儿茶素基类黄酮递送至受试者的方法包含将描述于此的结合物或递送载体施用至所述受试者。在阅读本发明具体实施方案的下列描述，结合附图的基础上，本发明的其它方面和特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。附图简述在图中，仅经由实施例说明本发明的实施方案，图1A是(-)-表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)的寡聚反应以产生寡聚(-)-表焙儿茶素掊酸酯(OEGCG)的示意性描述；图1B是聚(乙二醇)(PEG)和EGCG的结合以产生PEG-表焙儿茶素掊酸酯结合物(PEG-EGCG)的示意性描述；图1C是PEG和OEGCG的结合以产生聚(乙二醇)-寡聚表焙儿茶素掊酸酯结合物(PEG-OEGCG)的示意性描述；图2A是包含由PEG-EGCG围绕的自组装OEGCG蛋白质络合物的胶束纳米络合物体系的示意性描述；图2B是PEG-OEGCG/蛋白质络合物的胶束纳米络合物的示意性描述；图3是水溶液中的EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG的紫外-可见光谱；图4是EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、PEG-OEGCG、禾卩PEG的DSC热图；图5是磷酸盐缓冲液(PBS)中的PEG、EGCG、PEG-EGCG、OEGCG、和PEG-OEGCG的；-电势的图；图6是在519nm测量的用EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG处理的DPPH溶液的紫外-可见光谱；图7是描述EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、PEG-OEGCG、和别嘌呤醇(11=8)的XO抑制活性的曲线图；图8是描述EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG(n=8)的UPA抑制活性的曲线图；图9是显示OEGCG和蛋白质浓度对于胶束纳米络合物尺寸的影响的曲线图；图10是显示在不同浓度PEG加入PEG-EGCG时对于胶束纳米络合物尺寸的影响的图；图ll显示PBS中多种组分的；-电势；图12是表示存在或没有OEGCG中形成的胶束纳米络合物尺寸的曲线图[a:BSA;b:BSA+PEG;c:BSA+PEG-EGCG;d:(BSA+PEG-EGCG)+BSA;e:PEG-EGCG;f:PEG-EGCG+BSA;g:DMSO中的PEG-EGCG;h:(BSA+OEGCG)+PEG-EGCG;i:((BSA+OEGCG)+PEG-EGCG)+BSA];图BA是OEGCG/蛋白质、PEG-EGCG胶束纳米络合物的TEM图像；图13B显示用光散射测量的OEGCG/蛋白质、PEG-EGCG胶束纳米络合物的尺寸分布；图14是表示用DNA形成的络合物的尺寸的图[o:OEGCG+DNA;EGCG+DNA];图15是显示多种样品中形成的络合物尺寸的曲线图[a:(BSA+OEGCG)+PEG-EGCG;b:OEGCG+PEG-EGCG;c:(OEGCG+PEG-EGCG)+BSA;d:OEGCG+PEG;e:(OEGCG+PEG)+BSA];图16是显示多种样品中形成的络合物尺寸的图[a:BSA;b:BSA+PEG-OEGCG;c:在超声破碎以后的b;d:BSA+OEGCG;e:(BSA+OEGCG)+PEG-OEGCG;f:在超声破碎以后的e];图17是显示pH对于PEG-OEGCG络合作用的影响的图；图18是显示多种样品中形成的络合物尺寸的曲线图[a:蒸馏水中的PEG-OEGCG;b:蒸馏水中的EGCG+PEG-OEGCG;c:蒸馏水中的OEGCG+PEG-OEGCG;d:蒸馏水中的BSA+PEG-OEGCG;e:蒸馏水中的(BSA+EGCG)+PEG-OEGCG;f:蒸馏水中的(BSA+OEGCG)+PEG-OEGCG;g:在PBS中取代以后的f];图19是透明质酸-氨基乙酰基醛二乙基缩醛结合物的合成法的表述；图20是透明质酸-EGCG结合物的合成法的表述；图21是透明质酸-酪胺-EGCG(HA-Tyr-EGCG)水凝胶合成的示意性描述；图22A是显示从多种HA-Tyr-EGCG水凝胶释放的FITC-BSA量的曲线图；图22B是显示从多种HA-Tyr-儿茶素水凝胶释放的FITC-BSA的量的曲线图；图23A是显示多种透明质酸-EGCG(HA-EGCG)结合物的超氧化物清除活性的曲线图；图23B是显示多种HA-EGCG结合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性的曲线图；禾口图24是显示HA-EGCG结合物的尿激酶抑制活性的曲线图。详细说明—般合乎需要的是寻找在体内容易增加类黄酮浓度并且改善这种类黄酮有效递送至体内的多种组织的方法。为了增加有益的类黄酮化合物的可用性，发明人发现通过递送剂上的游离醛基到类黄酮A环而将类黄酮结合至多种递送剂，容许在不破坏类黄酮多酚结构的情况下修饰类黄酮的物理性质，而增加类黄酮的生物学和药理学性质。即，醛介导的递送剂对于类黄酮的结合导致所述递送剂附在类黄酮A环的C6和/或C8位，并且不破坏或影响类黄酮的B和C环或者类黄酮上的多种羟基。递送剂对于类黄酮的结合可以提供通过将类黄酮结合到用递送剂形成的特定载体中而适于施用至受试者的组合物，并且可以允许施用比通过饮食获得的更高浓度的类黄酮。所述递送剂可以对于组合物提供稳定性，产生代谢或降解更慢的组合物，并且因而可以在体内具有比单独的未结合类黄酮更长的半衰期。例如，所述递送剂可以具有类黄酮结合到组合物中这样一种属性以便增强类黄酮的水溶解度，其可以避免由网状内皮系统摄取以及随后被肾清除，在体内产生更长的半衰期。其它递送剂的结合可以保护类黄酮免受酶降解。因而，目前提供将递送剂结合至类黄酮的方法，所述方法包含将递送剂与类黄酮在酸催化剂存在下反应，所述递送剂具有游离醛基，或在酸存在下能转化成游离醛基的基团。所述类黄酮可以是来自从核心苯基苄基吡喃酮结构获得的通常类别分子的任何类黄酮，并且包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄院-3-醇、儿茶素、花色素和查耳酮。在具体实施方案中，所述类黄酮是儿茶素或儿茶素基的类黄酮。儿茶素，或儿茶素基的类黄酮是属于一般称为儿茶素(或黄烷-3-醇衍生物)类别的任何类黄酮，并且包括儿茶素和儿茶素衍生物，包括表儿茶素、表焙儿茶素、儿茶素、表儿茶素掊酸酯和表焙儿茶素掊酸酯，并且包括儿茶素或儿茶素基类黄酮的全部可能的立体异构体。在具体实施方案中，所述儿茶素基类黄酮是(+)-儿茶素或(-)-表焙儿茶素格酸酯。认为在所述儿茶素基类黄酮之中，(-)-表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)具有最高活性，可能由于三羟基B环和该类黄酮C3位的掊酸酯酯部分。所述递送剂是任何化学基团或部分，其含有游离醛或基团，或者可以在酸存在下转化成游离醛基的官能团，例如縮醛基。所述递送剂能够形成递送载体，因而允许结合的类黄酮结合到所述递送载体中，而不损害类黄酮的生物学或药理学性质。同样，所述递送剂应该是生物相容的，并且在一些实施方案中可以是生物可降解的。下列讨论指的是类黄酮是儿茶素基类黄酮并且递送剂是聚合物的实施方案。然而，应当理解，含有醛的化学基团和类黄酮之间的醛缩作用适用于具有游离醛基的任何递送剂，包括将递送剂随后酸处理，结合至任何类黄酮，如上所述。因而，在一个实施方案中，所述方法涉及在酸存在下将含有游离醛基或能转化成游离醛基的基团的聚合物结合至儿茶素基类黄酮。所述儿茶素基类黄酮可以是儿茶素基类黄酮的单一单体单元或者它可以是一个或多个儿茶素基类黄酮的寡聚体。儿茶素基类黄酮的寡聚体趋于具有增强水平的与儿茶素基类黄酮有关的生物学和药理学性质，并且甚至可以具有减少的有时与单体儿茶素基类黄酮有关的助氧化剂效果。儿茶素基类黄酮的寡聚体是已知的，包括通过酶催化氧化偶合和通过醛介导的寡聚反应制备的寡聚体。醛介导的寡聚反应过程产生具有限定键的无支链的寡聚体，例如通过从一个单体的A环上的C6或C8位连接至下一个单体A环上的C6或C8位的CH-CH3桥，包括以任何一个可能的立体异构，在可应用的情况下。例如，图1A描述了从醛介导的寡聚反应法产生的寡聚的(-)-表焙儿茶素掊酸酯(OEGCG)，其通过(-)-表焙儿茶素掊酸酯单体的C6-C8键连接。儿茶素基类黄酮的寡聚体可以是连接在一起的2个或多个单体单元。在某些实施方案中，所述儿茶素基类黄酮寡聚体具有2至100个类黄酮单体单元，从IO至IOO，从2至80，从10至80，从2至50，从10至50，从2至30，从10至30，从20至100，从30至100或从50至100个单体单元。所述聚合物可以是在与儿茶素基类黄酮结合之前具有游离醛基的任何聚合物，或具有在酸存在下转化成醛基的基团，例如缩醛基。而且，应当理解所述聚合物应当是非毒性的、生物相容的并且适于药理学应用。所述聚合物也可以具有其它合乎要求的性质，例如，所述聚合物可以具有低免疫原性，并且它可以是生物可降解的或不可生物降解的，取决于所述组合物所需的生物学应用，例如，用于体内特定部位的儿茶素基类黄酮或其它生物活性剂的控释。所述聚合物可以基于它的特定特征和它形成某些类型递送载体的能力而选择。例如，所述聚合物可以是醛封端的聚(乙二醇)，或它可以是用醛基衍生化的透明质酸，或这种聚合物的衍生物。备选地，所述聚合物可以是苯氧甲基(甲基亚肼基)树状聚体(PMMH)，例如，环三磷腈核心的PMMH或硫代磷酰核心的PMMH。所述聚合物也可以是任何生物聚合物，改性成含有游离醛基或在酸存在下可转化成醛的基团，例如醛改性的蛋白质、肽或核酸。在一个具体实施方案中，所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)(PEG-CHO)。在另一个具体实施方案中，所述聚合物是醛衍生化的透明质酸，与氨基乙酰基醛二乙基縮醛结合的透明质酸，或者上述用酪胺衍生化的透明质酸聚合物的任何一种。所述聚合物上的游离醛基便于以受控方式将聚合物结合至类黄酮结构的A环的C6或C8位或两者上，因而防止类黄酮结构破裂，特别是所述类黄酮的B和C环，并且因而保留类黄酮有益的生物学和药理学性质。经由聚合物的醛基与儿茶素基类黄酮A环的C6和/或C8位的反应而将所述聚合物结合至儿茶素基类黄酮，如图1B和图1C中所示。利用所述聚合物的醛基与儿茶素基类黄酮縮合的酸催化，或者利用酸将所述聚合物上的官能团转化成游离醛之后是醛基与儿茶素基类黄酮的縮合，合成所述结合物。为了结合所述聚合物和儿茶素基类黄酮，可以将所述聚合物和儿茶素基类黄酮分别溶解在适合的溶剂中。在酸存在下，将具有游离醛的聚合物例如通过逐滴加入而添加至含有儿茶素基类黄酮的溶液。允许所述反应进行完全。在所述结合反应之后，可以从结合的组合物除去过量的未反应聚合物或儿茶素基类黄酮，例如通过渗析或者通过分子筛分离。可以改变儿茶素基类黄酮对于聚合物的比例，以便仅有一个聚合物部分附于所述聚合物的儿茶素基类黄酮部分，或者以便儿茶素基类黄酮部分附于所述聚合物上一个以上的位置，或者以便儿茶素基类黄酮部分具有两个聚合物部分，一个附于儿茶素基类黄酮的C6和C8位的任何一个。最终组合物中的聚合物对于儿茶素基类黄酮的比例可以通过起始试剂的比例控制。例如，当聚合物部分对于儿茶素基类黄酮部分的摩尔比约为1时，单一的聚合物部分将附于单一的儿茶素基类黄酮部分(可以使用单体的或寡聚的任何一种)。然而，在更高浓度的聚合物，例如在聚合物对于儿茶素基类黄酮的10:1摩尔比，可以获得具有聚合物-类黄酮-聚合物的三-嵌段结构的组合物。也预期含有游离醛的聚合物和儿茶素基类黄酮的结合物，所述结合物具有在类黄酮A环的C6和/或C8位结合的聚合物。所述聚合物的结合也容许儿茶素基的类黄酮结合到多种组合物或载体中。通过基于所述聚合物的物理性质选择含有游离醛基的特定聚合物，可以将类黄酮结合到不同的载体类型中，在不同上下文中容许将高浓度类黄酮递送至身体的多种靶向区域。因而，根据结合物的聚合物部分的属性，从上述方法产生的本结合物可以形成递送载体。根据递送载体的属性，所述递送载体可以用于将儿茶素基的类黄酮递送至身体，包括身体中特定的靶向部位。任选地，在递送载体中可以包括生物活性剂，其随后可以同时递送到身体内的部位。因而，提供包含组合物的递送载体，所述组合物包含通过聚合物上的游离醛基结合至聚合物的儿茶素基类黄酮，所述递送载体任选另外包含生物活性剂。所述生物活性剂可以是在身体内具有生物学、药理学或治疗效果的任何试剂，并且包括蛋白质、核酸、小分子或药物。作为蛋白质的生物活性剂可以是肽、抗体、激素、酶、生长因子、或细胞因子。作为核酸的生物活性剂可以是单链或双链DNA或RNA、短的发夹式RNA、siRNA，或者可以包含编码治疗产物的基因。抗生素、化疗剂和抗高血压剂也包括在生物活性剂范围内。在一个具体实施方案中，所述递送载体是胶束纳米络合物，其适于将儿茶素基类黄酮，和任选生物活性剂胃肠外递送至身体内的特定部位。选择所述聚合物具有容许它与所述组合物的儿茶素基类黄酮部分组装的性质，保护类黄酮免受溶液环境影响。如果选择适合的溶剂，其中所述结合物的聚合物部分是可溶的并且比儿茶素基类黄酮更可溶，则所述结合物将自组装，从类黄酮核心排除溶液，因而容许胶束络合物的组装。在胶束纳米络合物递送载体的具体实施方案中，选择的聚合物是醛封端的PEG，或其衍生物。PEG是广泛用作药理学成分的聚合物，并且拥有良好的亲水的、非毒性的、非免疫性的和生物相容性特征，具有低生物降解性。通过将PEG-CHO结合至儿茶素基类黄酮，形成具有强自组装趋势的结合物。在一个实施方案中，将PEG结合至儿茶素基类黄酮单体，以形成PEG-类黄酮。所述递送载体与非结合的儿茶素基类黄酮并且任选生物活性剂一起形成。因而，中心核心含有相对高浓度的类黄酮并且胶束纳米络合物的外壳包含结合的PEG-单体类黄酮，并且以两步过程组装。在具体实施方案中，寡聚EGCG的中心核心和外部核心由结合的PEG-EGCG组成。所述递送载体的该实施方案非常适合于递送生物活性剂。因为所述儿茶素基类黄酮具有刚性的、多环核心的结构，所以这些分子与生物活性剂诸如蛋白质和核酸以及含有环状结构的其它分子充分缔合，很可能通过儿茶素环与生物活性剂上的一个或多个环堆叠。因而，寡聚儿茶素基类黄酮可用于与生物活性剂缔合，之后在胶束纳米络合物中组装，如图2A中所示。根据递送到身体中特定部位的生物活性剂的总量，并且根据不动摇胶束结构的情况下包括在胶束纳米络合物中的生物活性剂的量，选择生物活性剂的浓度。在某些实施方案中，高达50重量％，或高达40重量%的胶束络合物可以包含所述生物活性剂。在另一个实施方案中，将PEG结合至寡聚的儿茶素基的类黄酮。所述递送剂的该实施方案具有强自组装性质并且可以在--步过程中自组装。随着上面的两步组装的胶束纳米络合物，单步自组装的胶束纳米络合物可以任选包括生物活性剂。图2B描述包含PEG-OEGCG和蛋白质的纳米络合物。以上胶束纳米络合物具有纳米级的尺寸，并且直径可以为约1nm至约10000nm，或者直径为约20nm至约4000nm，或者直径为约20nm至约100nm。通过改变寡聚儿茶素基类黄酮的长度、所述聚合物的长度、未结合的寡聚儿茶素基类黄酮的浓度，可以改变胶束纳米络合物的尺寸。胶束纳米络合物的尺寸可以是pH依赖的，取决于使用的聚合物。例如，在结合的聚合物是PEG的胶束纳米络合物中，胶束的直径趋于随着增加的pH而减小。—般地，所述胶束纳米络合物进行自组装并且因而需要很少的合成。对于两步的过程，将形成核心的组分溶解在适合的溶剂中，例如溶解在稀释的DMSO或甲醇中，并且容许组装。所述溶剂是核心组分可溶性的溶剂，并且其可以在水中可互溶，或者其可以是易挥发的，或者可以从其另外离析或萃取组装的胶束。如上所示，例如所述核心组分可以是生物活性剂和儿茶素基类黄酮，例如寡聚的儿茶素基类黄酮。然后将形成外壳的聚合物-儿茶素基类黄酮的结合物加入到溶液并且容许形成所述胶束络合物。该胶束纳米络合物体系提供实现儿茶素基类黄酮的受控生物分布和延长的血流中循环半衰期的能力，原因在于PEG外壳，并且提供增强的儿茶素基类黄酮化合物的病理学活性，具有附加的益处，这样的化合物可以伴有装载在所述胶束内核中的另外生物活性剂的治疗效果。当所述生物活性剂是敏感分子诸如蛋白质时，纳米级胶束提供方便的具有温和优点的递送载体，不涉及与当前使用的常规胶囊化技术有关的机械的、热的和化学应力的自组装方法，所述常规技术可以产生敏感生物活性剂诸如蛋白质的变性。在另一个具体实施方案中，所述递送载体是水凝胶，所述水凝胶可以用作缓释递送生物活性剂的伤口或烧伤敷料，用作组织再生、治疗关节炎，或者用于化妆品应用诸如美容面具的支撑物。选择所述聚合物具有良好的溶胀性特征并且具有可用于交联聚合物部分的适当基团，并且是非毒性的和生物相容性的，并且在一些实施方案中是生物可降解的。在所述水凝胶的具体实施方案中，所述聚合物是醛衍生化的透明质酸，或者是透明质酸的衍生物，诸如透明质酸氨基乙酰基醛二乙基缩醛结合物，或醛衍生化的透明质酸或透明质酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛结合物的酪胺衍生物。包含透明质酸-儿茶素基类黄酮的结合物可以容易地交联以形成水凝胶，而不破坏类黄酮的生物学或药理学性质。这样的水凝胶也可以任选包含如上所述的生物活性剂，用于在涂敷水凝胶的部位释放生物活性剂。通过将透明质酸与儿茶素基类黄酮在例如pH约为1的酸性条件下反应而合成所述透明质酸-类黄酮结合物。然后例如通过透析纯化结合的聚合物-类黄酮，并且然后与生物活性剂和交联剂诸如过氧化氢混合。加入交联的催化剂例如辣根过氧化酶，并且然后可以将水凝胶快速倾入到模型中而形成所需形状，之后完成所述交联反应。例如，所述水凝胶可以形成适于作为伤口敷料涂敷的厚片。也可以注入所述水凝胶的组分并反应而在体内形成水凝胶，例如通过与交联剂诸如过氧化氢和交联催化剂例如辣根过氧化酶一起，任选含有生物活性剂，注入未交联的结合物进行。这样一种水凝胶用于递送药物至身体内特定部位，或者用于组织工程。因为透明质酸具有可以在结合反应期间与类黄酮反应的多个位点，通过改变起始反应中的儿茶素基类黄酮的浓度，所以可以改变透明质酸聚合物和儿茶素基类黄酮之间的结合程度。例如，可以调节反应物的比例，以便产生的结合物具有约1%至约10%的聚合物上的与类黄酮结合的位点。备选地，可以将另外的未结合透明质酸加入到所述混合物，之后交联所述水凝胶，以便水凝胶中的一些聚合物分子不会结合至类黄酮。上述组合物和递送载体非常适于将儿茶素基类黄酮受控并耙向递送至体内的特定部位。所述类黄酮可以在靶向部位提供抗菌的、抗肿瘤的、抗血栓形成的、血管扩张的、抗氧化剂的(antioxidant)、抗诱变的、抗致癌的、高胆固醇血症的(hypercholesterolemic)、抗病毒的和抗炎的活性。因而，以上结合物和递送载体用于多种治疗应用。另外，递送载体可以包括另外的生物活性剂，使递送载体在治疗广泛的病症和疾病中有用。例如，包括细胞因子和生长因子的免疫调节肽和蛋白质己经作为治疗癌症、myelodepresssion和传染病的重要药物类别而出现。因而，目前提供将儿茶素基类黄酮递送至受试者的方法，所述方法包含施用含有游离醛和儿茶素基类黄酮的聚合物结合物，具有结合在类黄酮A环的C6和/或C8位的聚合物也是预期的，如上所述。在某些实施方案中，所述结合物形成递送载体，诸如胶束纳米络合物或水凝胶，如上所述。所述受试者是需要儿茶素基类黄酮并且可以还需要另外生物活性剂的任何动物，包括人。将根据所述结合物的形式，可以利用己知方法施用所述结合物。优选非口服的路线，特别是生物活性剂正在以和所述结合物的相同形式施用。如果将所述结合物配成溶液，或者是胶束纳米颗粒的形式，所述结合物可以是胃肠外递送的，包括静脉内的、肌肉内的，或者通过直接注射入耙向的组织或器官。如果将所述结合物配制成水凝胶，则可以将结合物局部施用或通过外科插入在损伤部位。可以将结合物与生物活性剂组合使用，特别是如上所述将所述结合物配制成递送载体的情况。当施用至患者时，以有效量和剂量将所述结合物施用充分的时期以实现所需结果。例如，可以以递送儿茶素基类黄酮所需的数量和剂量使用所述结合物，其可以对于感染、疾病或病症起缓和、改善、减轻、改良、稳定、预防其传播，减少或削弱其进展或治愈其，或抑制、减轻或修复疾病相关酶的活性的作用。疾病相关的酶是涉及代谢或生物化学途径的酶，当阻断所述途径时，或者当阻断或抑制所述酶或途径的调节控制时，所述酶的活性涉及疾病或病症的发作或进行。施用至受试者的结合物的有效量可以根据许多因素而改变，所述因素诸如结合物的药效性质，包括聚合物部分和儿茶素基类黄酮部分，施用方式，受试者的年龄、健康和重量，病症或疾病状态的属性和程度，治疗的频率和，如果有的话，共同作用的治疗类型，和结合物的浓度和形式。16本领域技术人员可以基于上述因素确定适当的量。根据受试者的临床反应，可以以根据需要调节的合适量最初施用所述结合物。可以实验确定所述结合物的有效量并且可以取决于可以安全施用的结合物的最大量。然而，施用的结合物的量应当是产生所需结果的最小量。通过下列非限制性实施例进一步说明本发明。实施例(+表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)，绿茶的主要成分，显示许多生物学和药理学效果。在下列实施例中，利用通过酸催化剂的醛-介导縮合而合成聚(乙二醇)与EGCG或寡聚EGCG(OEGCG)的结合物。用分子量、NMR光谱、酚分析、紫外-可见光谱、DSC热分析图、和；-电势表征合成的化合物。实施例1:聚乙二醇与(-)-表焙儿茶素掊酸酯或与寡聚(-)-表焙儿茶素掊酸酯的结合在该研究中，本发明人合成聚(乙二醇)(PEG)与(-)-表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)或寡聚EGCG(OEGCG)的结合物。利用醛封端的PEG(PEG-CHO)的PEG-EGCG或PEG-OEGCG结合是通过PEG链末端的醛部分和EGCG部分的亲核间苯三酚环之间的Baeyer酸催化的缩合进行的(图1)。材料(-)-表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)购自KURITALTD.,日本。醛封端的聚乙二醇(PEG-CHO)购自NOFCo.，日本。乙酸、乙醛、PURPALD,Folin-Ciocalteau酚试剂、碳酸钠、香草醛和二甲基亚砜-d(,购自Sigma-Aldrich。IN的氢氧化钠购自WakoPureChemicalIndustries,日本。其它试剂和溶剂是市场上可买到的并且原样使用。PEG-表焙儿茶素掊酸酯结合物的合成将PEG-CHO和EGCG分别溶解在乙酸/水/乙醇或乙酸/水/DMSO的混合物中。过量于PEG-CHO而改变EGCG的摩尔比。将所述反应通过逐滴加入PEG-CHO溶液而启动并且在空气或氮气气氛在20。C(pH2.9)进行各种反应时间。在室温下将得到的产物对于IOOO倍体积的甲醇透析(分子量截止值3.5xlO"两天。将渗析物替换至蒸馏水六次并冻干残留溶液而产生PEG和(-)-表焙儿茶素掊酸酯、或PEG-EGCG的结合物。'HNMR(画S0-4):S2.6-3.0(C环的H-4),3.2-3.7(PEG的CH30和CH2CH20),4.9-5.0(C环的H-2),5.5(C环的H-3),5.8-6.0(A环的H-6和8),6.3-6.5(3，4,5-三羟苯甲酰部分的H-2"和6"),6.7-6.9(B环的H-2'和6')。13CNMR(DMSO-^5):S31.5(C环的C-4)，47.8-49(PEG的CH2CHO),58.9(PEG的CH30),70.7-72.1(PEG的CH2CH20)，106.3-106.4(B环的C-2'和6'),109.5(3，4,5-三羟苯甲酰部分的C-2"和6")，146.2-146.4(B环的C陽3'和5'和3,4,5-三羟苯rp酰部分的C-3"和5")。寡聚表焙儿茶素掊酸酯的合成将EGCG溶解在乙酸/水/DMSO或乙酸/水/乙醇的混合物中。通过添加乙醛启动所述反应并且在20。C(pH2.3)在空气或氮气气氛下进行各种反应时间。将得到的产物以上述同样方式透析(分子量截止值lxl03)。将残留溶液冻干以产生寡聚的表焙儿茶素掊酸酯(OEGCG)。'HNMR(DMS0-4;):51.1-1.9(CHCH3),2.6-3.1(C环的H-4).3.0-3.5(C环的H-3),4.9-5.1(C环的H-2)，5.1-5.4(CHCH3),6.4-6.5(3,4,5-三羟苯甲酰部分的H-2"和6"),6.8-6.9(B环的H-2'禾卩6')。13C函R(DMSO-40:S15.6-19(CHCH3),19-24(CHCH;),26.6-27.4(C环的C-4)，68.5-68.6(C环的C-3),77.3-77.4(C环的C-2),106.2-106.3(B环的C-2'和6'),109.5-109.6(3,4,5-三羟苯甲酰部分的C-2"和6"),120.0-120.1(3，4,5-三羟苯甲酰部分的C-l"),129.3-129.5(A环的C-4c),133.1-133.2(B环的C-l'),139.4(B环的C-4'和3,4,5-三羟苯甲酰部分的C-4"),]46.2-146.5(B环的C-3'禾Q5'和3,4,5-三羟苯甲酰部分的C-3"和5").,150-158(A环的C-5，7和8b),166(3,4，5-三羟苯甲酰部分的C-a)。PEG-寡聚表焙儿茶素掊酸酯的合成将PEG-CHO溶解在乙酸/水/乙醇或乙酸/水/DMSO的混合物中。将OEGCG溶解在对于PEG-CHO的那些具有多种摩尔比(0.1-1)的相同溶剂中。逐滴加入PEG-CHO的溶液并且在空气或氮气气氛下在20-5(TC(pH2.3-3.0)进行所述反应不同的反应时间。以上述的相同方式透析(分子量截止值5000)得到的不透明产物。在离心(rpm-3.5xl0"以后，收集沉淀并一式三份用蒸馏水洗涤，接着是冻干以产生PEG和寡聚(-)-表焙儿茶素掊酸酯(PEG-OEGCG)的结合物。'HNMR(DMSO隱^):S1.1-1.5(CHCH3)，2.6-3.1(C环的H-4),3.2-3.7(PEG的CH30和CH2CH20)，4.9-5.0(C环的H-2)，5.1-5.4(CHCH3),6.4-6.5(3，4,5-三羟苯甲酰部分的H-2"和6")，6.8-6.9(B环的H-2'和6')。13CNMR(DMSO誦^):570.7-72.2(PEG的CH2CH20),77.3-77.4(C环的C-2)，106.2-106.4(B环的C國2'和6')，109.5-109.6(3，4，5画三羟苯甲酰部分的C-2"和6"),120.0-120.1(3,4，5-三羟苯甲酰部分的C-l")，129.3-129.5(A环的C-4c)，133.1-133.2(B环的C-l'),139.4(B环的C-4'和3，4，5-三羟苯甲酰部分的C-4")，146.2-146.5(B环的C-3'和5'和三羟苯甲酰部分的C-3"和5")，150-158(A环的C-5,7和8b),166(三羟苯甲酰部分的C-a)。测量在乙酰化以后，用具有WatersStyragelHR4E/HR5E柱的尺寸排阻色谱法(SEC)(装有RI-2410检测器的Waters26卯，聚苯乙烯标准物)在40'C利用流速为1ml/min的THF作为洗脱剂估计分子量。将'H和13CNMR记录在Bruker400-MHz核磁共振(NMR)光谱仪上。利用对于醛类非常特异性的和敏感的并且产生紫色至紫红色显色的6-mercatriazolo-[4，3-b]-s-四嗪的4-氨基-3-肼基-5-巯基-l，2，4-三唑(PURPALDTM)定量地评价未反应的PEG-CHO的醛部分。3U2将100pl的样品溶液滴入3ml的PURPALDtm溶液(7.5mg/ml1NNaOH)中。在室温下充气以后，利用UV-VIS分光计在545nm记录溶液的最大吸收(JASCOV-510UV/VIS/NIR分光计，日本)。因为PURPALDTM对即使少量存在于空气中的醛也是敏感的，并且因此产生显色反应，测量空气中的阴性对照并从所述值减去。利用PEG-CHO标准曲线确定未反应的PEG-CHO。将这个PURPALDM测定的结果与NMR测量的结果相比。用Folin-Ciocalteu测定法和香草醛-HCl测定法评价结合物的酚含量。Folin-Ciocalteu测定法已经由许多研究者用于总酚类测定(Julkunen画tiittoR.J.Agric.FoodChem.33,21-217(1985))。将15pl的样品加入到300pl水中。加入150jxl的Folin-Ciocalteu酚试剂并将所述溶液剧烈振荡。立即加入750^的20%碳酸钠溶液并将所述混合物用水补足至1.5ml，接着再次振荡。在20min后，利用UV-VIS分光计在720nm读取混合物的吸收率。香草醛-HCl法已经用于儿茶素和浓縮鞣质测定(BroadhurstR.B.和JonesW.T.J.Sci.FoodAfric.29，788-794(1978))。对于该测定，将100^1的样品加入到1ml甲醇中的4%香草醛中并将混合物剧烈振荡。然后加入0.5ml的浓HC1，并且立即将混合物再次振荡。将所述混合物在室温下保持20min以后在500nm读取吸收率。利用以同样方式测量的EGCG标准曲线确定利用这两种测定的合成化合物的酚含量。每个测量一式三份进行。用DSCQ100TAInstruments测量产物的熔化温度(Tm)。所述测量利用铟校准，并且在氮气吹扫下以20°C/min的扫描速率在-40至200'C的温度进行。在25°C用ZetaPALSZetaPotentialAnalyzer(BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)测量样品溶液的S-电势。每个测量一式三份进行。聚乙二醇和(-)-表焙儿茶素格酸酯或寡聚(-)-表焙儿茶素掊酸酯之间的醛-介导结合在该研究中，通过酸催化剂利用醛介导的縮合进行聚乙二醇(PEG)与EGCG或寡聚EGCG(OEGCG)的结合。OEGCG的合成总结在表1中。在不同反应条件下用过量乙醛进行所述反应。在用透析(MWC(^1000)纯化以后，获得了具有数千分子量的寡聚体。在乙酰化以后用SEC测量分子量，因为在EGCG单元和SEC柱上存在的许多羟基之间的相互作用导致较低的分子量估算。分子量和收率都没有受反应时间的影响，但是非常受溶剂和反应气氛的影响在二甲亚砜(DMSO)和水混合物中分子量和收率都比乙醇和水混合物中高，即使溶剂混合物中水量的增加减少分子量和收率。N2气氛中的反应产生更高的分子量和收率，大概由于空气中的02终止EGCG的寡聚。得到的寡聚体也可溶于EGCG的良好溶剂，诸如DMSO、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙醇、甲醇、四氢呋喃和除水以外的碱性水溶液，并且不溶于其中都不是EGCG的氯仿和己烷。产物的H和"CNMR分析显示在乙醛存在下的EGCG缩合提供在间苯三酚环(A环)的C6和C8位通过CH-CH3桥接连接的EGCG寡聚体(图1)。由于A环的H6和H8在S^5.83和5.93观察到的单峰在寡聚以后消失，并且由于CH-CH3桥接的甲基和次甲基质子产生的新的峰分别出现在5'H1.48和5.08(513C21.2和16.2)。与EGCG的峰相比，全部OEGCG的峰展宽并且具有更低的强度。PEG与EGCG和OEGCG的结合物分别总结在表2和表3中。在进行PEG-EGCG结合以后，将未反应的EGCG通过透析除去(MWCO=3.5X103)。为了完全消耗PEG-CHO，将过量的EGCG进料到反应器中。当在N;j气氛中以比PEG-CHO的摩尔量大20倍的摩尔量进料EGCG时，如用NMR(S9.65(s，CHO))和利用PURPALDTM分光光度法测定法分析显示所述产物不含未反应的PEG-CH03。即使EGCG对于醛在C6和C8位具有两个可用的连接位置，结合物的分子量显示仅PEG-CHO的一个链结合到EGCG(表2)。这可能是由于单一的PEG链在A环的C6和C8位任何一个的结合以后的位阻。然而，当用比OEGCG的摩尔量大10倍的摩尔量进料PEG-CHO时，获得了双-和三-嵌段的结合物(PEG-OEGCG和PEG-OEGCG-PEG)这两者的PEG-OEGCG结合物(表3)。通过用相同摩尔比的OEGCG和PEG-CHO进料，所述结合仅产生双-嵌段结合物而不产生三-嵌段的结合物。如上述EGCG寡聚的情况中，在DMSO和Nz气氛中的反应产生高收率。包括具有Mn=10000的长链PEG的全部PEG-OEGCG结合物不是水溶性的，而全部PEG-EGCG结合物是水溶性的。在用相对于甲醇的透析除去未反应的OEGCG以后，通过离心不透明水溶液分离PEG-OEGCG。NMR分析显示上清液是未反应的PEG-CHO而沉淀是PEG-OEGCG结合物。PEG-EGCG结合物的&和13CNMR光谱显示全部固有峰属于PEG和EGCG,并且PEG-OEGCG光谱对于包括CHCH3桥接的OEGCG以及对于PEG也显示展宽的峰(图1)。结合物的酚测定利用植物材料中普遍用于酚定量的香草醛和Folin-Ciocalteau测定评价PEG-EGCG和PEG-OEGCG结合物的EGCG部分含量。Folin-Ciocalteau测定是用于检测蛋白质的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基的蛋白质测定方法。(FolinO.和CiocalteuU.J.Biol.Chem.73,62-650(1927))。该测定对于酚基团是非特异性的并且也与脲、壳聚糖和鸟嘌呤反应而产生深蓝色化合物。香草醛-浓HCl测定(BroadhurstR.B.andJo加sW.T.J.SciFoodAfric.29，788-794(1978))经常用于检测儿茶素和矢车菊苷配基(浓縮鞣质)。利用EGCG制备标准曲线。两者测定中测试的全部标准物都显示吸收率和分别在Folin-Ciocalteau的125yM至4mM和香草醛测定的62.5UM至2mM范围内变化的标准物浓度之间的线性关系。PEG-EGCG和PEG-OEGCG溶液的香草醛测定是完全可重现的并且给出与基于它们的分子量计算的浓度几乎相同的量。然而，对于PEG-EGCG和PEG-OEGCG，Folin-Ciocalteau测定分别产生比基于分子量计算的浓度高48.3±18.9%和126.5±43.2%的浓度。光学性质图3描述OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的UV-VIS光谱。以类似于前体的方式表征这些化合物。EGCG在280nm显示最大吸收，表明保持原始的黄烷骨架。另外，本发明人发现利用酶催化剂通过氧化偶合聚合的(+)-儿茶素除在280nm之外还在388nm显示最大吸收，产生复杂的结构，而通过CH-CH3桥接縮合的(+)-儿茶素仅在280nm显示最大吸收。因此，认为本发明的OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的UV-VIS光谱是它们的由如上所述的NMR显示的结构的另外证据。热性质OEGCG、PEG-EGCG和PEGC-OEGCG的热性质用DSC测量表征(图4)。分别在62.0和150.5'C观察到对应于PEG和EGCG的熔点(Tm)的吸热峰。与EGCG相比，OEGCG显示移动至更低温度的展宽Tm峰，反映了结晶度的减小。PEG-EGCG和PEG-OEGCG的DSC热分析图具有对应于PEG和EGCG或OEGCG的双峰。源自PEG的Tm也移动至更低的温度并且熔化中的PEG的热容(△H)变小，当分别与EGCG和OEGCG结合时减少26%和73%。这些数据表明如所描述发生结合和寡聚。C-电势在PBS中测量寡聚体和结合物的C-电势(图5)。PEG和EGCG显示具有类似值的稍微负的表面电荷，并且与EGCG相比，PEG-EGCG结合物显示没有电荷差异。另一方面，OEGCG比EGCG显示更多负电荷，并且OEGCG与PEG的结合物产生比PEG-EGCG和OEGCG显然更强的负电荷。实施例2:通过寡聚和与PEG结合的(-)-表焙儿茶素掊酸酯的生理活性增加材料(-)-表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)购自KURITALTD.，日本。醛封端的聚乙二醇(PEG-CHO)购自NOFCo.，日本。乙酸、乙醛、二甲亚砜-d6、U-二苯基-2-苦基-偕腙肼(DPPH)、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶(XO)、氮蓝四唑(NBT)、2-氨基-2-羟甲基-l，3-丙二醇(Tris)和聚乙二醇(PEG)8000购自Sigma-Aldrich。尿激酶(uPA)和SPECTROZYMEUK购自AmericanDiagnosticalnc。其它试剂和溶剂是商购的并且原样使用。OEGCG、PEG-EGCG或PEG-OEGCG的合成如上所述合成寡聚EGCG(OEGCG)和聚(乙二醇)与EGCG(PEG-EGCG)或OEGCG(PEG-OEGCG)的结合物。对于OEGCG合成，将EGCG溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通过添加乙醛启动反应并且在氮气气氛下在20*€0>112.3)进行24小时。在室温下将得到的产物相对于1000倍体积的甲醇透析(分子量截止值1X10"两天，然后冻干残留溶液而得到OEGCG。对于结合物的合成，将PEG-CHOs和EGCG或OEGCG单独溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通过逐滴添加PEG-CHO溶液启动所述反应并在氮气气氛下在20'C(pH2.9)进行24小时。以上述相同方式透析得到的产物(分子量截止值3.5X103)。通过冷冻干燥透析的残留溶液而获得PEG-EGCG和结合物。在透析(分子量截止值5000)以前通过离心(rpn^3.5X10"沉淀PEG-OEGCG结合物并且然后冻干。在乙酰化以后，用WatersStyragelHR4E/HR5E柱利用THF作为洗脱液以1ml/min的流速在40'C通过尺寸排阻色谱法(装有RI-2410检测器的Waters26卯，聚苯乙烯标准物)评估分子量。在Bruker400-MHz核磁共振(NMR)光谱仪上记录^和13CNMR。二苯基-苦基-偕腙肼清除活性将不同量的样品与化学稳定的游离自由基1，l-二苯基-2-苦基-偕腙肼(DPPH)溶液混合，并且在25'C利用UV-可见分光光度计(JASCOV-510UV/VIS/NIR分光计，日本)将519nm的吸光度连续记录30min。全部分析运行一式三份并且平均所述结果。超氧化物阴离子清除活性利用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶(XO)产生超氧化物阴离子，并且用氮蓝四唑(NBT)还原法测量。在25'C将试样在含有黄嘌呤和NBT的缓沖溶液(pH7.0)中混合。随着添加XO开始测量。利用UV-可见分光光度计在25'C在560nm将超氧化物阴离子产生用分光光度法监视10min。全部分析运行一式三份并且平均所述结果。根据下式计算超氧化物清除活性吸光度对iB-吸光度样a，_超氧化物清除活性(％)=吸光度对照黄嘌呤氧化酶抑制活性通过利用UV-可见分光计在295nm将尿酸的形成监控30min而用分光光度法测量XO的活性。在与超氧化物阴离子测定的相同条件下进行测定，并且计算百分比活性。uPA抑制活性在缓冲溶液中将不同量的样品与uPA混合，并在37'C温育15min。用SPECTROZYME添加所述混合物溶液并利用微板阅读器在405nm记录10min。结果通过上述醛介导的縮合合成寡聚的(-)-表焙儿茶素掊酸酯(OEGCG)和聚(乙二醇)与EGCG(PEG-EGCG)或寡聚体(PEG-OEGCG)的结合物。在乙酰化以后用尺寸排阻色谱法对于OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG估计的分子量分别是Mw=4000,Mw/Mn=1.2:M『7卯0，Mw/Mn=1.2;和M『10100，Mw/Mn-1.1。二苯基-苦基-偕腙肼清除活性和超氧化物阴离子清除活性测量氢原子给予活性的1,l-二苯基-2-苦基-偕腙肼根(DPPH)测定提供由于自由基清除产生的抗氧化剂活性的评价。DPPH，一种紫色的稳定自由基，被还原成黄色的二苯基苦基肼，因为通过氢给予的抗氧化剂清除所述自由基。能够DPPH清除的化合物在519nm显示降低的吸光度，作为自由基清除活性的指示。在OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的全部情况下，样品溶液的添加显示519nm处显著降低的最大吸光度(图6)。样品的DPPI-l清除活性由IC5o(需要将DPPH清除50。/。的浓度)表示，如表4中所示。与对于完好的EGCG所观察的ICso相比，OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的浓度依赖的自由基清除活性是增强的。这些活性也比商业抗氧化剂维生素C和二丁基羟基甲苯(BHT)的活性更高。黄嘌呤和XO的混合物产生还原氮蓝四唑(NBT)的过氧化物阴离子，得到蓝色生色团甲腥并且增加560nm的UV吸光度。能清除过氧化物阴离子的化合物，诸如过氧化物歧化酶(SOD)，抑制NBT还原。本发明人发现，相比于具有较低IC5o(需要将过氧化物阴离子清除50%)的完好EGCG所观察到的活性，在PEG-EGCG、PEG-OEGCG和OEGCG的情况下，浓度依赖的类似SOD的活性增加，表明这些化合物对于过氧化物阴离子比未改性的EGCG是更有效力的清除剂。因为能清除过氧化物阴离子的化合物还可以影响NBT还原，所以研究样品对于这些过程的效果。对照实验揭示所述样品在测试浓度范围内不直接减少NBT。对于DPPH和过氧化物阴离子的清除活性的评价提供那些化合物自由基清除电势的直接证据。DPPH和过氧化物阴离子测定结果显示抗氧化剂活性在EGCG单元-基础上由寡聚和/或EGCG的PEG结合而放大。这些结果意味着任何寡聚体和结合物(OEGCG、PEG-EGCG或PEG-OEGCG)的单一构成EGCG单元具有比非改性形式中的单独一个EGCG单元更有效力的清除活性。黄嘌呤氧化酶抑制活性XO不仅是反应性氧种类的重要生物来源而且是担负关节中与导致疼痛炎症的痛风有关的尿酸形成的酶(McCordJ.M.和FridovichI.J.Biol.Chem.1968，243,5753;ChiangH.C,LoY.J.和LuF.J.J:EnzymeInhibition1994，8，61)。图7显示通过评价从XO形成的尿酸而确定XO抑制活性。以浓度依赖方式，全部OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG显示比别嘌呤醇更高的抑制活性，所述别嘌呤醇是用于痛风治疗而经常使用的商业抑制剂(FeherM.D.,等Rhermatology42,321(2003))。相反，EGCG显示较低的抑制活性，即在测试浓度范围上小于约5%抑制。对于PEG-OEGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和别嘌呤醇，以及EGCG，利用10UM样品测量的抑制活性分别是IOO、89.3、30.7、22.6、和1.2%。因为能抑制XO的化合物还可以正面影响清除过氧化物自由基的活性，XO抑制活性可以部分有助于表4中显示的结果。然而，在测试浓度范围中XO抑制活性比过氧化物自由基清除活性更低。因此，OEGCG和那些结合物对于过氧化物阴离子清除的更大抑制效果出现，主要是由过氧化物自由基清除而不是XO抑制引起的。这些结果表明，与未改性的EGCG相比较，EGCG寡聚体和PEG结合物对于过氧化物阴离子清除和XO抑制都具有更高的电势。uPA抑制活性人癌症需要蛋白水解酶以侵入细胞并形成转移。这些酶的一种是尿激酶(uPA)。在小鼠中uPA的抑制可以减少肿瘤尺寸或者甚至引起癌症完全好转。已知的uPA抑制剂不太可能用于抗癌治疗，由于它们的弱抑制活性或高毒性。表明EGCG结合至uPA，封闭uPA催化三联体的His57和Serl95并且从正电荷的uPA环对着Arg35延伸。这样的EGCG局部化将干扰uPA识别它的底物并且抑制酶活性的能力。在测试浓度范围内，EGCG显示非常低的uPA抑制活性(图8)。然而，在EGCG单元的浓度依赖方式中，OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG显示更髙的抑制活性。实施例3:OEGCG和PEG-EGCG的胶束纳米络合物材料(-)-表焙儿茶素格酸酯(EGCG)购自KURITALTD.，日本。醛-封端的聚乙二醇(PEG-CHO)购自NOFCo.,日本。乙酸、乙醛、牛血清清蛋白(BSA)、异硫氰酸荧光素牛清蛋白(FITC-BA)、PURPALD和香草醛购自Sigma-Aldrich。其它试剂和溶剂是市场上可买到的并且原样使用。OEGCG、PEGCG和POEGCG的合成如上合成寡聚EGCG(OEGCG)和聚(乙二醇)与EGCG的结合物(PEG-EGCG)。对于OEGCG的合成，将EGCG溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通过添加乙醛启动反应并且在氮气气氛下在20'C(pH2.3)进行24小时。在室温下将得到的产物相对于1000倍体积的甲醇透析(分子量截止值1X103)两天，然后冻干残留溶液而得到OEGCG。对于结合物的合成，将PEG-CHOs和EGCG单独溶解在乙酸/7jC/DMSO的混合物中。通过逐滴添加PEG-CHO溶液启动所述反应并且在氮气气氛下在20'C(pH2.9)进行24小时。以上述相同方式透析得到的产物(分子量截止值3.5X103)。通过冷冻干燥透析的残留溶液而获得PEG-EGCG和结合物。在乙酰化以后，通过用WatersStyragelHR4E/HR5E柱的尺寸排阻色谱法(装有RI-2410检测器的Waters2690，聚苯乙烯标准物)利用THF作为洗脱液以1ml/min的流速在40。C估计所述分子量(分别对于OEGCG和PEG-EGCG，Mw=4000;Mw/Mn=1.2和Mw^7卯0;Mw/Mn=1.2)。寡聚(-)-表焙儿茶素掊酸酯与蛋白质或DNA的相互作用将DMSO或甲醇中的10liMOEGCG储备溶液以多种终浓度(0-0.14mg/ml)加入到2ml具有多种浓度(0-100mg/ml)的PBS中的BSA溶液。在通过自发自组装的混合以后，OEGCG和蛋白质的络合物立即形成。利用颗粒分析仪(ZetaPALS,BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)将络合物的尺寸在指示的时间测量2天。以相同方式观察DNA与OEGCG的络合物的形成。利用；电势分析仪(ZetaPALS，BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)在25'C测量样品溶液的C-电势。每个测量运行一式三份。胶束纳米络合物载体形成和表征将以多种浓度制备的在DMSO中的50u1PEG-EGCG溶液加入到OEGCG/BSA络合物溶液以形成胶束纳米络合物(MNC)载体。利用超滤膜(分子截止值=200000)将MNC溶液超滤三次以除去过量的未参与MNG的flavonoic化合物和蛋白质。在25'C，利用颗粒分析仪和C电势分析仪分别测量MNC的尺寸和4-电势。用香草醛-HCl测定评价MNC的酚含量。将100li1的样品加入到1ml甲醇中的4%香草醛溶液并且将混合物剧烈振荡。然后添加0.5ml的浓HC1，并且将所述混合物立即再次振荡。在将混合物在室温下保温20min以后，在500nm读取吸收率。利用以相同方式测量的EGCG标准曲线确定酚含量；每个测量运行一式三份。为了确定MNC载体中负荷的蛋白质的量，以上述相同方式将FITC-BA负荷的MNC制造在10mMTris(pH7.0)中并且利用分光荧光计测量荧光强度。将激发和发射波长分别设定在491nm和519nm。通过用负荷蛋白质的质量除以进料蛋白质的初始质量而确定蛋白质的负荷效率。将负荷蛋白质的量表示为通过用负荷蛋白质质量除以冻干MNC的质量而确定的百分比。利用透射电子显微镜(TEM)(FEITecnaiG2F20S-Twin)在200kV观察MNC的形态。将用0.001mg/ml的磷鸽酸染色的100y1的MNC溶液固定在涂有碳膜的铜网上并在室温下干燥过夜。结果在该实验中，根据络合物的尺寸表征寡聚EGCG(OEGCG)与BSA的络合物形成(图9)。当将OEGCG加入到BSA溶液时，由于络合物形成，所述混合物中的颗粒尺寸立即增加。在恒定的BSA浓度，络合物尺寸随着递增的OEGCG浓度而增加，而随着在测试浓度范围内的EGCG添加未观察到尺寸增加。随着BSA浓度改变，络合物尺寸增加直到最大尺寸，在所述点之后络合物尺寸随着递增的BSA浓度降低。这些结果表明，作为蛋白质分子的络合物形式被OEGCG分子结合(BaxterN.J"等.Biocehmistry,36,5566-5577(1997);SiebertK.J"等.J.Agric.FoodChem.44,80-85(1996))。因此，当BSA浓度小于临界量时，OEGCG过量存在，容许形成更大的颗粒。当蛋白质浓度高时，络合物形成限于较小的尺寸，导致更少的OEGCG分子可用于形成多个蛋白质分子之间的桥接。将所述络合物观察超过2天是稳定的。接着将PEG-EGCG加入到具有递增浓度的OEGCG/BSA络合物溶液并观察得到的络合物尺寸(图10)。最初选择具有不同浓度OEGCG和BSA的两种组合以获得直径约为30nm的OEGCG/BSA络合物。在某一PEG-EGCG浓度之上尺寸快速增加并且终止在约80nm，表明通过围绕OEGCG/蛋白质络合物组装的PEG-EGCG形成胶束纳米络合物(MNC)。对于更低的BSA浓度，与对于更高浓度BSA所需的量相比，需要形成胶束的PEG-EGCG量是相对较小的。络合物的4-电势测量也表明MNC形成(图11)。OEGCG/BSA络合物的表面电荷显示比单独的BSA或OEGCG任一种更多的负电荷。然而，在将PEG-EGCG加入到OEGCG/BSA络合物以后，所述络合物具有与单独的PEG相同的表面电荷，表明所述胶束结构由PEG链围绕。在没有OEGCG时，通过PEG-EGCG的EGCG部分和BSA之间的自组装，PEG-EGCG仍与BSA单独形成胶束络合物(图12)。同样，EGCG部分的疏水性相互作用能驱动PEG-EGCG自身之间的自组装并且在水溶液中形成胶束。然而，当另外添加蛋白质时，没有OEGCG的组装都不足够稳定并且显示尺寸的严重减少，表明胶束离解。相反，由PEG-EGCG和OEGCG/BSA形成的络合物在另外添加蛋白质时不显示尺寸改变，很可能由于通过强疏水性和氢键相互作用而产生的纳米络合物结构的OEGCG稳定。为了估计纳米络合物中负荷的蛋白质的量，制造并测量FITC-BA负荷的胶束。负荷的蛋白质的量是39.3%并且负荷效率是60.9%。另外，利用香草醛-HCl方法确定一起负荷的类黄酮的量。当香草醛测定用于确定OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG中的EGCG单元时，结果是完全可重现的并且得到几乎与基于它们的分子量计算的量相同的量。香草醛-HCl测定显示58.5%的类黄酮负荷量与7.3%的负荷效率。纳米络合物的光散射分析显示约80nm的单分散性粒度(图13B)。TEM图像显示纳米络合物的球形紧密形状，显示所述纳米络合物与用光散射观察的尺寸具有良好一致性(图13A)。图14显示OEGCG也与DNA形成络合物。用光散射测量的络合物尺寸随着OEGCG的EGCG单元的浓度增加而增加。没有观察到未改性的EGCG与DNA在测试浓度范围内形成络合物。实施例4:PEG-OEGCG胶束纳米络合物的形成材料(-)-表焙儿茶素掊酸酯(EGCG)购自KURITALTD.，日本。醛-封端的聚乙二醇(PEG-CHO)购自NOFCo.，日本。乙酸、乙醛、牛血清清蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich。其它试剂和溶剂是市场上可买到的并且原样使用。OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的合成如上合成寡聚EGCG(OEGCG)和聚(乙二醇)与EGCG的结合物(PEG-EGCG)。对于OEGCG的合成，将EGCG溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通过添加乙醛启动反应并且在氮气气氛下在20'C(pH2.3)进行24小时。在室温下将得到的产物相对于1000倍体积的甲醇透析(分子量截止值1X103)两天，然后冻干残留溶液而得到OEGCG。对于结合物的合成，将PEG-CHO和EGCG或OEGCG单独溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通过逐滴添加PEG-CHO溶液启动所述反应并且在氮气气氛下在20'C(pH2.9)进行24小时。以上述相同方式透析得到的产物(分子量截止值3.5X103)。通过将透析的残留溶液冷冻干燥而获得PEG-EGCG和结合物。在透析(分子量截止值5000)以前通过离心(rpm-3.5X10"沉淀PEG-OEGCG结合物，然后冻干。在乙酰化以后，通过用WatersStyragelHR4E/HR5E柱的尺寸排阻色谱法(装有RI-2410检测器的Waters26卯，聚苯乙烯标准物)估计分子量，在40'C利用THF作为洗脱液，流速为1ml/min。(对于OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG，分别为，Mw=4000,Mw/Mn=1.2;Mw=7^0,Mw/Mn=1.2;和Mw=10100，Mw/Mn=l.l)。胶束纳米络合物载体的形成将以多种浓度制备的DMSO中的50y1PEG-EGCG溶液加入到BSA、EGCG、OEGCG和OEGCG-BSA络合物溶液以形成胶束纳米络合物(MNC)载体。利用超滤膜(分子截止值=200000，ADVANTEC)将MNC溶液超滤三次以除去过量的未络合的flavonoic化合物和蛋白质。在25°C利用颗粒分析仪(ZetaPALS,BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)测量MNC的尺寸。29结果当PEG-EGCG加入到预先形成的OEGCG蛋白质络合物时，PEG-EGCG围绕络合物自发组装并形成胶束络合物(MNC),络合物尺寸约为100nm。有趣的是，如果在与蛋白质形成复合物以前将PEG-EGCG直接加入到OEGCG，形成尺寸约为500nm的不可溶光雾状络合物(图15)。这可能是由于OEGCG与PEG链的强络合物形成。在添加OEGCG和未改性的PEG时观察到类似的现象，表明OEGCG和PEG链之间存在强相互作用。当PEG-OEGCG添如到蛋白质时，形成大的络合物，络合物尺寸为800nm以上(图16)。该络合物可以由结合物分子的PEG节段和OEGCG节段之间以及结合物和蛋白质之间的分子内和分子间络合作用产生。不像在PEG-EGCG体系中，将PEG-OEGCG添加到预先形成的OEGCG-蛋白质络合物同样产生大的络合物，即使在添加PEG-OEGCG时尺寸稍微降低。这些巨大的络合物对于物理破碎能量如超声破碎是稳定的。然而，PEG-OEGCG的强络合作用显著地受介质中pH和离子强度的影响。图17显示当pH沿箭头方向改变时PEG-OEGCG络合物的可逆性尺寸改变。而且，在蒸馏水中，PEG-OEGCG与蛋白质、EGCG、OEGCG、和OEGCG-蛋白质络合物形成可溶性络合物，得到约100nm的尺寸(图18)。曾经形成在蒸馏水中的络合物不再次显示尺寸增加，即使将它们放回PBS中，可能因为在所述纳米络合物核心内部保护OEGCG节段。OEGCG与PEG的强相互作用可归因于在酸性和含盐溶液中这些化合物的疏水性和氢键作用增加。实施例5:用于药物递送和组织工程的可注射可生物降解的水凝胶透明质酸-氨基乙酰基醛二乙基縮醛(HA-ADD)结合物的合成)如下通过下列一般规程合成HA-AAD结合物(图19中的(l)。将透明质酸(HA)(lg,2.5mmol)溶解在100ml的蒸馏水中。将氨基乙酰基醛二乙基缩醛(1.2g，9mmol)加入到该溶液。通过添加0.1M的HC1将反应混合物的pH调节至4.7。N-羟基丁二酰亚胺(0.34g,3.0mmol)和l-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.575g，3.0mmol)加入到所述溶液。在混合以后，将反应的pH保持在4.7。将所述溶液在温和的搅拌下在室温保持24h。通过透析(分子量截止值-1000)将混合物进行纯化。透明质酸-表焙儿茶素掊酸酯(HA-EGCG)结合物的合成将HA-EGCG结合物合成如下。将1g的HA-AAD结合物(l)溶解在60ml蒸馏水中。通过添加HC1将溶液pH调节至1。加入5ml溶解在DMSO中的EGCG溶液(0.2g/ml)。在温和搅拌情况下，在氮气气氛下将所述溶液在室温下保持24h。通过透析(分子量截止值-1000)将混合物进行纯化，产生如图20所示的HA-EGCG结合物。水凝胶合成和来自所述水凝胶的BSA释放通过在由隔离物分开的两个玻璃板之间注入HA，Tyr、含有FITC标记的牛血清白蛋白(BSA)的HA-Tyr-EGCG、辣根过氧化酶(HRP)和H202的溶液混合物而制备厚片形状的水凝胶。在反应完成以后，将得到的水凝胶放在50ml的PBS中并通过测量FITC-BSA的荧光强度检验BSA从水凝胶的释放。与没有儿茶素基类黄酮的HA-Tyr相比，含有EGCG或儿茶素的水凝胶显示较少的释放BSA(分别地，图22A和图22B)。这可能是由于疏水性相互作用，如BSA中的脯氨酸侧链和结合物中EGCG或儿茶素部分之间的Jl-3!堆积。由此，从含有儿茶素基类黄酮的水凝胶的蛋白质释放可以是更慢的，并且将在身体内具有更长的半衰期。利用上述没有任何三胺(tiramine)含量的HA-EGCG结合物(或另一个HA-儿茶素基类黄酮结合物诸如HA-儿茶素)也可以制备水凝胶。在图22中，所述水凝胶包含多种重量％的儿茶素基类黄酮成。例如，HA-Tyr-EGCG40包含60重量％的HA-Tyr和40重量％的HA-Tyr-EGCG。HA-EGCG结合物的黄嘌呤氧化酶抑制和过氧化物清除活性如上所述进行这些实验。结果显示在图23A和图23B中。在这些图中，结合的儿茶素基类黄酮对于HA重复单元的比例显示在每个结合物的名称中。例如，HA-6.8-EGCG指的是EGCG对于HA重复单元的结合程度是6.8%。HA-EGCG结合物的尿激酶抑制如上所述进行这些实验。所述结果显示在图24中。本领域技术人员可以理解，对于描述于此的例举性实施方案的许多修改是可能的。更确切地，本发明意欲包括如权利要求所限定的它的范围之内的全部这种修改。在这里涉及的全部文件通过参考完全结合。虽然在这里公开了本发明的多种实施方案，但是根据本领域技术人员的普通常识可以在本发明的范围内进行许多改编和修改。这样的修改包括本发明任何方面的已知等价物的替换，以便以基本相同方式实现相同的结果。除非另外限定，在这里使用的全部专业和科学术语具有本发明领域的普通技术人员通常理解的含义。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>(0.18:0.15:0,67)wa乙酸、乙醇和H20的混合物，圆括号中是体积比，b乙酸、DMSO和H20的混合物，圆括号中是体积比，"6在乙酰化以后用SEC测量的分子量。气氛收率MweMneMw/Mne(%)样品EGCG乙醛摩尔比溶剂(ml)(g)(g)(EGCG:乙醛)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表3.PEG与寡聚EGCG的结合物的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a乙酸、乙醇和H20的混合物，圆括号中是体积比，b乙酸、DMSO和H20的混合物，圆括号中是体积比，e乙酸、乙醇、DMSO和H20的混合物，圆括号中是体积比，d在乙酰化以后用SEC测量的分子量。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>权利要求1.一种含有游离醛和类黄酮的递送剂的结合物，所述结合物具有结合在类黄酮A环的C6和/或C8位的递送剂。2.权利要求1的结合物，其中所述递送剂是聚合物并且其中所述类黄酮是儿茶素基类黄酮。3.包含权利要求1或权利要求2的结合物的递送载体。4.权利要求3的递送载体，其中所述类黄酮是儿茶素基类黄酮即(-)-表儿茶素、(-)-表焙儿茶素、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素掊酸酯或(-)-表焙儿茶素掊酸酯。5.权利要求3或权利要求4的递送载体，其中所述类黄酮是单体的。6.权利要求3或权利要求4的递送载体，其中所述类黄酮是寡聚的。7.权利要求3至6任何一项的递送载体，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)、醛衍生化的透明质酸、透明质酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛结合物、醛衍生化的透明质酸-酪胺、透明质酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛结合物-酪胺、环三磷腈核心苯氧甲基(甲基亚肼基)树状聚体或硫代磷酰核心苯氧甲基(甲基亚肼基)树状聚体。8.权利要求7的递送载体，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)并且所述递送载体是胶束纳米络合物。9.权利要求8的递送载体，其中所述胶束纳米络合物包含结合至寡聚儿茶素基类黄酮的醛封端聚(乙二醇)。10.权利要求8的递送载体，其中所述胶束纳米络合物包含含有寡聚儿茶素基类黄酮的内核和含有所述结合物的外壳，所述结合物包含结合至单体儿茶素基类黄酮的醛封端的聚(乙二醇)。11.权利要求7的递送载体，其中所述聚合物是醛衍生化的透明质酸、透明质酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛结合物、醛衍生化的透明质酸-酪胺、透明质酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛结合物-酪胺或其组合，并且所述递送载体是水凝胶。12.权利要求11的递送载体，通过与交联剂一起注射未交联的聚合物-类黄酮结合物而在体内形成所述递送载体。13.权利要求3至12任何一项的递送载体，所述递送载体还包含生物活性剂。14.权利要求13的递送载体，其中所述生物活性剂是蛋白质、肽、核酸、小分子、药物、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、短发夹RNA、siRNA、抗生素、化疗剂或抗高血压剂。15.在酸存在下将具有游离醛基的递送剂结合至类黄酮的方法，所述方法包含将所述递送剂与所述类黄酮在酸催化剂存在下反应。16.权利要求15的方法，其中所述游离醛基是通过在所述递送剂上的縮醛基转化而产生的。17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述递送剂是聚合物。18.权利要求15至17任何一项的方法，其中所述类黄酮是儿茶素基类黄酮。19.权利要求18的方法，其中所述儿茶素基类黄酮是(-)-表儿茶素、(-)-表焙儿茶素、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素掊酸酯或(-)-表焙儿茶素掊酸酯。20.权利要求18或权利要求19的方法，其中所述儿茶素基类黄酮是单体的。21.权利要求18或权利要求19的方法，其中所述儿茶素基类黄酮是寡聚的。22.权利要求17至21任何一项的方法，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)、醛衍生化的透明质酸、透明质酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛结合物、醛衍生化的透明质酸-酪胺、透明质酸氨基乙酰基醛二乙基缩醛结合物-酪胺、环三磷腈核心苯氧甲基(甲基亚肼基)树状聚体或硫代磷酰核心苯氧甲基(甲基亚肼基)树状聚体。23.权利要求17至21任何一项的方法，其中所述聚合物是蛋白质、肽或核酸。24.将儿茶素基类黄酮递送至受试者的方法，所述方法包含将权利要求1或权利要求2的结合物或者权利要求3至14任何一项的递送载体施用至所述受试者。全文摘要本发明提供在酸催化剂存在下将含有自由醛基的聚合物与类黄酮结合的方法，以致将所述聚合物结合至类黄酮A环的C6或C8位。得到的结合物可以用于形成递送高剂量类黄酮的递送载体，并且也可以用作递送另外的生物活性剂的递送载体。文档编号C08B37/08GK101180319SQ200680017596公开日2008年5月14日申请日期2006年3月7日优先权日2005年5月20日发明者朗卓,杨仪岩,栗泽元一,郑株润申请人:新加坡科技研究局