专利名称：大分子印迹琼脂糖聚合物微球及其制备方法
技术领域：
本发明属于聚合物技术领域，特别涉及大分子印迹琼脂聚合物微球及其制备方法。
背景技术：
近年来，在分子印迹技术领域中，越来越多的研究者开始关注大分子的印迹，并且对 蛋白质大分子的印迹工作已经进行过许多研究。聚丙烯酰胺、海藻酸盐水凝胶均可作为大 分子的印迹基材，并都有一定的印迹效果。然而，在制备过程中，丙烯酰胺的聚合容易使 蛋白质变性，海藻酸盐需加入二价金属离子(如离子，锌离子等)才能进行凝胶化。
琼脂糖是从红海藻中提炼出来，主要由3 —连接一 e —D—吡喃半乳糖和4一连接一 a 一L一3， 6—内醚一吡喃半乳糖构成的琼二糖组成，其重要特征是在较高温度(8(TC以上) 下可以形成琼脂糖水溶液，而将其降温到4(TC左右开始凝胶，最终形成水凝胶。根据琼脂 糖的这一特点，我们通过调节温度来制备大分子印迹聚合物微球，另外，在制备过程中， 要保证在温度的变化范围内不使蛋白质变性。
目前还没有用琼脂糖微球做为大分子印迹基材的报道，因此本发明提供一种新型的大 分子印迹基材。
发明内容
本发明的目的是提供一种大分子印迹琼脂糖聚合物微球。与非印迹琼脂糖微球相比， 印迹微球的重结合性能有了较大的提高。
本发明的另一目的是提供一种以蛋白质为模板制备大分子印迹琼脂糖聚合物微球的 印迹方法。
本发明的大分子印迹琼脂糖聚合物微球，其中粒径为30 500Hm ，琼脂糖质量百分 含量为1% 4.8%。
本发明的一种大分子印迹琼脂糖微球，所述的蛋白质为卵白蛋白、溶菌酶或牛血清白 蛋白。
本发明的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是采用反相悬浮凝胶法。 所述的反相悬浮凝胶法制备如下将琼脂糖/水混合物加热到8(TC以上形成琼脂糖溶 液，然后将溶液放入恒温水浴中；将蛋白质溶液置于相同恒温水浴中；待两溶液恒温后， 将其混合均匀；将混合液在机械搅拌下分散在恒温水浴中的有机油相中；用冰水浴降温成 球后，静置使微球形成稳定水凝胶，然后用去离子水清洗微球；最后用缓冲溶液脱除模板 分子后制得。大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，具体步骤
a) 将琼脂糖/水混合物加热到8(TC以上形成琼脂糖溶液，将其置于38-5(TC的恒温水浴 中；
b) 配制好的蛋白质溶液置于相同的恒温水浴中，待上述两溶液恒温后，将其混合均匀， 混合溶液记为A;
c) 将溶液A在搅拌的条件下加入到2 5倍溶液A体积、置于与前述同温水浴中的的有 机相中，再搅拌15 30min，然后去水浴，进行0-4(TC低温凝胶化反应5-30min，停 止搅拌；
d) 在0-4(TC静置2h以上，最后脱除蛋白质模板分子后制得蛋白质大分子印迹琼脂糖微 球。
所述的混合溶液A的组分质量百分含量琼脂糖为0.99%%-4.8%;蛋白质为0.0137 % 0.33%。
由于最终体系的蛋白质被脱除，所以大分子印迹琼脂糖微球各组分及其含量范围与所 述A溶液各组分及其含量范围有所不同。
所述有机相是通常采用的有机相，其中溶解质量百分比为0 4%的表面活性剂或分散剂。
但是为了环保等的需要，也可以采用食用色拉油等为有机相。 所述搅拌速度为300-500r/min。
本发明所制备的大分子印迹琼脂糖微球，粒径在30-500pm，球形较好，见图2,经蛋 白质重结合测试结果表明，印迹微球的重结合量能达到非印迹微球，即不加蛋白质制备 的微球吸附量的1.2 5倍，见图3和图4。本发明采用反相悬浮凝胶法制备大分子印迹琼 脂糖聚合物微球具有制备方法简单易行、凝胶过程易于控制等优点，能够制备出一种以琼 脂糖为新型基材的具有较好重结合性的大分子印迹聚合物微球，具有广泛的应用前景。
图1为本发明制备的对应卵白蛋白印迹琼脂糖聚合物微球的非印迹微球照片；
图2为本发明实施例3所制备的卵白蛋白印迹琼脂糖聚合物印迹微球照片；
图3为本发明实施例3所制备的卵白蛋白印迹琼脂糖聚合物微球对卵白蛋白的重结合曲
线； . ， -
图4为本发明实施例3所制备的卵白蛋白印迹琼脂糖聚合物微球对卵白蛋白的印迹效率曲线。
具体实施例方式
实施例1:
1将10ml水与lg琼脂糖混合物加热到80'C以上形成琼脂糖溶液，将其置于38'C的恒温 水浴中；2量取配制好的质量百分含量为0.029X的溶菌酶溶液10ml，置于38'C的恒温水浴中，待
上述两溶液恒温后，将其等体积混合均匀，混合液记为A，此时A中琼脂糖质量百分含
量为4.8%，蛋白质含量为0.0137%; 3量取50ml三氯甲垸和50ml正己垸组成的有机相100ml，倒入装有搅拌装置的三口烧瓶
内，向其中加入质量百分比为4%的山梨醇酐单油酸酯，搅拌5min使其充分溶解形成溶液。
4将溶液A在搅拌的条件下加入到上述溶液中，再搅拌25min，然后去水浴，用冰水浴降 温10min，停止搅拌；
5冰水浴静置2h后使微球形成稳定水凝胶，用去离子水清洗微球，最后用lmol/L的NaCl 溶液洗脱掉蛋白质模板，制得微球。此实施方法制备出来的大分子印迹琼脂糖微球的琼 脂糖质量百分含量为4.8%。
实施例2:
1将15ml水与0.2g琼脂糖混合物加热到80。C以上形成琼脂糖溶液，将其置于50。C的恒温 水浴中；
2量取配制好的质量百分含量为1.3X的牛血清白蛋白溶液5ml，置于5(TC的恒温水浴中，
待上述两溶液恒温后，将其等体积混合均匀，混合液记为A，此时A中琼脂糖质量百分
含量为0.99%，蛋白质含量为0.33%; 3将溶液A在搅拌的条件下加入到40ml蓖麻油中，再搅拌25min，然后去水浴，用冰水
浴降温10min,停止搅拌； 4 4(TC条件下静置24h后使微球形成稳定水凝胶，用去离子水清洗微球，最后用0.001mol/L
的SDS (十二烷基磺酸钠)溶液洗脱掉蛋白质模板，制得微球。此实施方法制备出来的
大分子印迹琼脂糖微球的琼脂糖质量百分含量为1%。 实施例3:
1将10ml水与0.5g琼脂糖混合物加热到8(TC以上形成琼脂糖溶液，将其置于4rC的恒温 水浴中；
2量取配制好的质量百分含量为0.135X的卵白蛋白溶液10ml，置于4rC的恒温水浴中， 待上述两溶液恒温后，将其混合均匀，混合液记为A，此时A中琼脂糖质量百分含量为 2.44%，蛋白质质量百分含量为0.066%;
3将溶液A在搅拌的条件下加入到25ml食用色拉油中，再搅拌30min，然后去水浴，常 温降温10min，停止搅拌；
4常温静置10h后使微球形成稳定水凝胶，用去离子水清洗微球，最后用lmol/L的 SDS/NaCl (分别为0.0005mol/L和0.5mol/L)溶液洗脱掉蛋白质模板，制得微球。此实施 方法制备出来的大分子印迹琼脂糖微球的琼脂糖质量百分含量为2.44% 。 卵白蛋白印迹琼脂糖微球和对应的非印迹微球的光学显微镜照片见图1和图2，对卵
白蛋白的重结合量-时间曲线见图2，对卵白蛋白的印迹效率-时间曲线见图3。从图l和图
2可以看出，微球球形较好，表面粗糙，粒径在100-400nm。从图3和图4可以看出，印迹微球的重结合量明显大于非印迹微球对卵白蛋白的重结量，印迹效率极大值(特异重结 合点)出现在0-10分钟，其值为4.7，这说明印迹微球的重结合量达到非印迹微球，即不 加卵白蛋白质制备的微球吸附量的4.7倍。
重结合量即蛋白质印迹琼脂糖微球对该蛋白质的吸附量；印迹效率为印迹微球对模板 蛋白质的重结合量与对应非印迹微球对相同蛋白质的重结合量的比值，其中印迹效率极大 值所对应的点定义为特异重结合点。
本发明提出的一种大分子印迹琼脂聚合物微球及其制备方法，已通过实施例进行了描 述，相关技术人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的内容进行改 动或适当变更与组合，来实现本发明。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本 领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明的精神、范围和内容中。
权利要求
1.一种大分子印迹琼脂糖聚合物微球，其特征是粒径为30～500μm，琼脂糖质量百分含量为1％～4.8％。
2. 根据权利要求1所述的一种大分子印迹琼脂糖微球，其特征是所述的蛋白质为卵白蛋白、 溶菌酶或牛血清白蛋白。
3. 权利要求1或2所述的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是采用反相悬浮凝 胶法。
4. 如权利要求3所述的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是所述的反相悬浮凝 胶法制备如下将琼脂糖/水混合物加热到8(TC以上形成琼脂糖溶液，然后将溶液放入恒 温水浴中；将蛋白质溶液置于相同恒温水浴中；待两溶液恒温后，将其混合均匀；将混合 液在机械搅拌下分散在恒温水浴中的有机油相中；用冰水浴降温成球后，静置使微球进一 步凝胶化，然后用去离子水清洗微球；最后用缓冲溶液脱除模板分子后制得。
5. 如权利要求4所述的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是所述制备方法，具 体步骤a) 将琼脂糖/水混合物加热到8(TC以上形成琼脂糖溶液，将其置于38-5(TC的恒温水浴中；b) 配制好的蛋白质溶液置于相同的恒温水浴中，待上述两溶液恒温后，将其混合均匀，混 合溶液记为A;c) 将溶液A在搅拌的条件下加入到2 5倍溶液A体积，置于与前述同温水浴中的的有机 相中，再搅拌15 30min，然后去水浴，进行0-40'C低温凝胶化反应5-30min，停止搅拌；d) 在0-40'C静置2h以上，最后脱除蛋白质模板分子后制得蛋白质大分子印迹琼脂糖微球。
6. 如权利要求5所述的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是所述的混合溶液A 的组分质量百分含量琼脂糖为0.99%%-4.8%;蛋白质为0.0137% 0.33%。
7. 如权利要求5所述的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是所述有机相是通常 采用的有机相，其中溶解质量百分比为0 4%的表面活性剂或分散剂。
8. 如权利要求7所述的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是所述有机相是食用 色拉油。
9. 如权利要求4、 5所述的大分子印迹琼脂聚合物微球的制备方法，其特征是所述搅拌速度 为300-500r/min。
全文摘要
本发明涉及大分子印迹琼脂聚合物微球及其制备方法。大分子印迹琼脂糖聚合物微球其中粒径为30～500μm，琼脂糖质量百分含量为1％～4.8％。将琼脂糖/水混合物加热到80℃以上形成琼脂糖溶液，然后将溶液放入恒温水浴中；将蛋白质溶液置于相同恒温水浴中；待两溶液恒温后，将其混合均匀；将混合液在机械搅拌下分散在恒温水浴中的有机油相中；用冰水浴降温成球后，用去离子水清洗微球；最后用缓冲溶液脱除模板分子后制得。本发明所制备的大分子印迹琼脂糖微球，经蛋白质重结合测试结果表明，印迹微球的重结合量能达到非印迹微球，即不加蛋白质制备的微球吸附量的1.2～5倍。采用反相悬浮凝胶法简单易行、凝胶过程易于控制，具有广泛的应用前景。
文档编号C08L5/12GK101314648SQ20081005246
公开日2008年12月3日 申请日期2008年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者张立广, 成国祥, 李宇平, 英晓光 申请人:天津大学