专利名称：：大孔网状聚乙烯醇球状载体及其制备的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种生物载体的制备，尤其涉及一种大孔网状聚乙烯醇球状载体及其制备；主要用于固定酶及微生物构成各种床型生物反应器。
背景技术：
：聚乙烯醇(PVA)载体具有可溶于水，对生物体无毒，价廉，工业化简单易行等特点而被广泛应用于固定化生物活性物质。近年来国内外对PVA载体固定生物活性物质进行了大量的研究，其制备方法主要有PVA-硼酸法和冷冻解冻法。硼酸法包埋生物活性物质机械强度高，使用寿命长，弹性好。缺点是硼酸对被包埋的生物有毒害作用，生物残余活性低，且固定化颗粒发生粘联现象。冷冻解冻法应用物理交联形成凝胶，这种方法制得的凝胶含水率较大，但是载体的稳定性不如化学交联法得到的凝胶，很难达到一些生物反应器尤其是流动床反应器的要求。一些改进的PVA载体制备方法采用不同的凝胶化试剂来解决凝胶过程中产生的毒性或载体稳定性等问题，如KuChengChen等人(ChenK.C.andLinY.F.,Immobilizationofmicroorganismwithphosphorylatedpolyvinylalcohol(PVA)gel.EnzymeMicrob.Technol.1994，16，79-83.)将PVA溶液滴入饱和硼酸形成小球后，把这种不稳定的小球浸泡到0.5M的磷酸钠溶液中进一步固化成型；Anildris等人(IdrisA.，ZainN.A.M.andSuhaimiM.S.,ImmobilizationofBaker'syeastinvertaseinPVA-alginatematrixusinginnovativeimmobilizationtechnique.ProcessBiochemistry,2008,43,331-338.)用PVA國海藻酸钠-硼酸法制备载体后，继续用0.5M的硫酸钠溶液处理，形成更稳定的凝胶；ChihChengChang等人(ChangC.C.andTsengS.K.，ImmobilizationofAlcaligeneseutrophususingPVAcrosslinkedwithsodiumnitrate.BiotechnologyTechniques,1998,12,865-868.)以硝酸钠作为凝胶化试剂并在PVA溶液中加入少量海藻酸钠以便成型，可以同时解决PVA载体易粘连和PVA-硼酸法与磷酸化PVA的毒性问题；李红玉等人(李红玉，王玉建，支德娟.一种聚乙烯醇固定化细胞球状载体的制备方法CN1920018A)以硝酸钙溶液代替饱和硼酸和传统的氯化钙溶液制备PVA-海藻酸钠凝胶小球固定微生物和酶，解决了PVA-硼酸法中的聚乙烯醇颗粒粘连膨胀和硼酸对微生物的毒性问题。尽管这些方法都在某一方面体现出优势，但往往是顾此失彼，没有同时解决载体的毒性和不稳定性问题。另外，作为固定化载体，除了无毒性和稳定性外，其传质性、负载性是很重要的，但目前固定化微生物研究中的包埋法势必要将固定后的微生物浸泡于化学试剂中或者冷冻而影响微生物的活性及应用效率，而且包埋载体的空隙度小，传质性和负载性受到限制。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种无毒性、清水性、稳定性好，生物代谢增值性、基质的传质性、负载性都较好的大孔网状聚乙烯醇球状载体。本发明的另一目的是提供一种大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备方法。本发明大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备方法，包括以下工艺步骤①将聚乙烯醇、碳酸钙、海藻酸钠、水以质量比为(610):(810):(1.21.8):(95100)的比例混合后，搅拌使其充分溶解，得白色PVA溶胶；②将所得溶胶用蠕动泵加入到含2~5%氯化钙的饱和硼酸溶液中，形成PVA凝胶球，放置2028h，用水清洗后，置于稀盐酸溶液浸泡至无气泡产生；③将球状载体投入到戊二醛水溶液中，并调节至酸性，使其发生交联反应以形成更稳定的交联结构；最后用水浸泡、清洗至中性，得到具有弹性的白色大孔网状PVA球状载体。步骤①中，可先将海藻酸钠加入水中，加热，使其沸水浴中充分溶解，再将PVA、碳酸弼加入其中，继续搅拌使PVA充分溶解，并使碳酸转均匀分布，得白色PVA溶胶。步骤②中，将PVA凝胶球用水清洗后，置于质量浓度为1~5%的盐酸溶液中浸泡。步骤③中，将球状载体投入质量浓度为0.10.5%的戊二醛水溶液中，并调节调节pH值至l-2，在搅拌下，于304(TC反应l2h。本发明于现有技术相比具有以下优点1、本发明制备的大孔网状聚乙烯醇球状载体，经扫描电镜(SEM)照片显示，该载体的内部结构为大孔网状，表面为致密的孔状结构，其孔径由外到内逐渐增大。载体内部的大孔骨架内有很多微孔存在，载体表面亦有孔洞存在且与内部孔是相互贯通的。这种相互贯通的大孔网状有利于载体的传质性；大孔骨架的微孔结构有利于增大载体与微生物的接触比表面积，以及增大固定化微生物与反应基质的接触几率而提高生物反应效率，所以该载体应该是微生物固定化的良好的载体。2、本发明制备的大孔网状聚乙烯醇球状载体，可以应用载体吸附结合法固定生物活性物质，从而消除载体制备过程中对生物活性物质的毒性。3、本发明制备的大孔网状聚乙烯醇球状载体，具有良好的亲水性，有利于固定化微生物的代谢增殖、特别是优势微生物菌群的形成。由于PVA是水溶性聚合物，故作为水处理所用的微生物固定化材料必须经过交联以增强其耐水溶性，因此，本发明制备的大孔球状聚乙烯醇球状载体同时具有良好的耐水性。4、本发明制备的大孔网状聚乙烯醇球状载体，适用于好氧条件的废水处理工艺，如沸腾床等，应避免厌氧特别是长期的厌氧反应条件。实验证明，本发明制备的球状载体，应用于沸腾床反应器有处理效果明显，出水稳定的特点。同时由于体系内无硝酸根和亚硝酸根的积累，说明体系发生了同步硝化反硝化反应，体现了大孔网状PVA球状载体在处理氨氮废水上的优势。图1为本发明制备的大孔网状聚乙烯醇球状载体的SEM照片a为载体的表面显微照片，b为载体的剖面显微照片图2为本发明制备的大孔网状聚乙烯醇球状载体在B350，B500，B570三种微生物菌群存在的好氧条件下检测其3个月的重量损失曲线具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备及其结构、性能等做进一步的说明。1、大孔网状PVA球状载体的制备PVA、碳酸钙、海藻酸钠、水按8:10:1.3:100的质量比例称(量)取。先将海藻酸钠加入水中，搅拌下加热，使其于沸水浴中充分溶解；然后将PVA、碳酸钙加入其中，继续搅拌使PVA充分溶解并使碳酸钙均匀分布，得白色PVA溶胶。将所得溶胶室温冷却后用蠕动泵滴入含3%氯化钙的饱和硼酸溶液中，搅拌下制成粒径均一的PVA凝胶球体，放置24h。取出用水清洗后，置于质量浓度为5%的稀盐酸溶液中浸泡至无气泡产生。将所得球状载体投入浓度为2.5。/。的戊二醛水溶液中并调节pH值至l，搅拌下加热到35"C，使其交联2h后用蒸馏水浸泡、清洗至中性，得到直径为4.5mm左右并具有弹性的白色大孔网状PVA球状载体。2、大孔网状PVA球状载体的结构本发明制备的大孔网状PVA球状载体的SEM照片显示，该载体的内部结构为大孔网状，表面为致密的孔状结构，其孔径由外到内逐渐增大。载体内部的大孔骨架内有很多微孔存在，载体表面亦有孔洞存在且与内部孔是相互贯通的。经SEM统计分析，所得大孔网状PVA球状载体的内部平均孔度89.65%和平均孔半径233.62pm。因为相互贯通的大孔网状有利于载体的传质性、大孔骨架的微孔结构有利于增大载体与微生物的接触比表面积、以及增大固定化微生物与反应基质的接触几率而提高生物反应效率，故所得大孔网状PVA球状载体应该是微生物固定化的良好的载体。3、大孔网状PVA球状载体的物理性能本发明制备的大孔网状PVA球状载体的物理性能测试结果见表1。表l大孔网状PVA球状载体的物理性能<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可以看出，大孔网状PVA球状载体的干视密度与湿视密度小于水的相对密度，载体内部附着微生物后可以使其密度增大，此性质可以使PVA载体在水处理过程中，能够长时间悬浮于水中，提高了固定化微生物与处理水中污染物的接触几率进而增强了水处理效率。较高的持水量与持水倍率说明PVA载体有良好的亲水性，有利于固定化微生物的代谢增殖、特别是优势微生物菌群的形成。由于PVA是水溶性聚合物，故作为水处理所用的微生物固定化材料必须经过交联以增强其耐水溶性，90.9%的交联率将赋予所得PVA载体良好的耐水性。此外，261.7n/。的平均膨胀率则是PVA载体良好亲水性的又一佐证。4、大孔网状PVA球状载体的生物稳定性好氧条件下，将大孔网状PVA球状载体分别置于美国BIO-SYSTEM公司生产的高效废水处理工程菌B350(含28种专用微生物及纤维酶、淀粉酶、脂肪酶和水解酶，堆密度为0.6-0.8g/cm3,微生物数量为30-50亿个/克)，B500(含14种专用微生物，能在好氧和厌氧条件下降解包括蛋白质，脂肪，碳水化合物的有机物质)，B570(含高效微生物能产生纤维素酶，半纤维素酶，淀粉酶和脂肪酶)三种微生物菌群存在的好氧条件下检测其3个月的重量损失曲线。结果表明，PVA球状载体在B350和B500存在条件下降解幅度不大，载体剩余质量均大于97%;在B570存在条件下PVA载体的降解率随微生物浓度却有较大变化，但载体剩余质量平均在95%左右。反映出大孔网状PVA球状载体具有一定的抗生物降解性。同时也发现大孔网状PVA球状载体在厌氧条件下的降解率大于好氧条件下的结果。因此，大孔网状PVA球状载体适用于好氧条件的废水处理工艺，如沸腾床等，应避免厌氧特别是长期的厌氧反应条件。5、大孔网状PVA球状载体固定化微生物处理废水在沸腾床反应器中填加60%的大孔网状PVA球状载体，投加高效微生物菌群B350，反应器底部设有曝气系统。表2为驯化3个月后，在HRT为8h，连续运行7天处理校园污水的结果。表2大孔网状PVA球状载体应用于沸腾床反应器处理校园污水的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表2可看出出水结果优于中国《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)中的一级标准(pH值为69，COD^50mg/L;氨氮2mg/L;色度^30倍)，说明大孔网状PVA球状载体应用于沸腾床反应器有处理效果明显，出水稳定的特点。同时由于体系内无硝酸根和亚硝酸根的积累，说明体系发生了同步硝化反硝化反应，体现了大孔网状PVA球状载体在处理氨氮废水上的优势。权利要求1、一种大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备方法，包括以下工艺步骤①将聚乙烯醇、碳酸钙、海藻酸钠、水以质量比为(6～10)∶(8～10)∶(1.2～1.8)∶(95～100)的比例混合后，搅拌使其充分溶解混匀，得白色PVA溶胶；②将所得溶胶用蠕动泵加入到含2～5％氯化钙的饱和硼酸溶液中，形成PVA凝胶球，放置20～28h，用水清洗后，置于稀盐酸溶液浸泡至无气泡产生；③将球状载体投入到戊二醛水溶液中，并调节至酸性，使其发生交联反应以形成更稳定的交联结构；用水浸泡、清洗至中性，得到具有弹性的白色大孔网状PVA球状载体。2、如权利要求1所述大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备方法，其特征在于所述步骤①中，先将海藻酸钠加入水中、加热，使其在沸水浴中充分溶解，再将PVA、碳酸钙加入其中，继续搅拌使PVA充分溶解，并使碳酸钙均匀分布，得白色PVA溶胶。3、如权利要求1所述大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备方法，其特征在于所述步骤②中，将PVA凝胶球用水清洗后，置于质量浓度为1~5%的盐酸溶液中浸泡。4、如权利要求1所述大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备方法，其特征在于所述步骤③中，将球状载体投入质量浓度为0.1~0.5%的戊二醛水溶液中，并调节pH值至12，在搅拌下，于3040'C反应l~2h。全文摘要本发明提供了一种大孔网状聚乙烯醇球状载体的制备方法，该方法是将聚乙烯醇、碳酸钙、海藻酸钠、水以一定的质量比例混合后，搅拌使聚乙烯醇充分溶解混匀得白色PVA溶胶；再将所得溶胶用蠕动泵加入到含3％氯化钙的饱和硼酸溶液中，形成PVA凝胶球，用水清洗后，置于稀盐酸溶液浸泡至无气泡产生；然后将球状载体投入到戊二醛水溶液中，并调节至酸性，使其发生交联反应以形成更稳定的交联结构；最后用水浸泡、清洗至中性，得到具有弹性的白色大孔网状PVA球状载体。本发明制备大孔网状聚乙烯醇载体具有稳定大孔网状结构，呈现良好的亲水性、物理化学稳定性和抗生物降解性，适用于固定化酶及微生物以构成多种床型的生物反应器，用于污水处理等现代生物工程领域。文档编号C08J3/24GK101348782SQ20081015083公开日2009年1月21日申请日期2008年8月30日优先权日2008年8月30日发明者李彦锋,杨柳青,雪白,门学虎申请人:兰州大学