包括至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键的低分子量肝素、其制造和其用途的制作方法

专利名称：：包括至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键的低分子量肝素、其制造和其用途的制作方法包括至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键的低分子量肝素、其制造和其用途本发明涉及具有至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键的低分子量肝素，更通常地为由类肝素得到的多糖混合物，还涉及它们的制备方法、含有它们的药物组合物和它们的治疗用途。肝素是分子量为大约15OOO道尔顿(Da)的动物来源的硫酸化粘多糖混合物，尤其因其抗凝血和抗血栓形成性质而被使用。但是，肝素具有限制其使用条件的缺陷。特别地，其高抗凝血活性(尤其是其高的4元IIa因子5舌'I"生)可造成出血(SeminarsinThrombosisandHemostasis,第5巻，sup.3，1999),尤其通过肝素酯的碱性解聚(d6polym6risationbasique)获得的且目前出售的例如3000至7000Da,更特别地3500至5500道尔顿的低分子量肝素，如依诺肝素也具有高的抗IIa因子活性。肝素衍生物由于这些不合意的出血副作用是已知的。但是，在用上述产品治疗血栓形成的领域中，目标是在避免诱发出血的同时重建或维持血液流动性。实际上，公知的是，任何意外原因都可能在治疗的患者中触发出血。也可以需要对处于抗血栓形成治疗中的患者进行外科手术。此外，在某些外科手术过程中，可高剂量使用抗凝血剂以防止血液凝结，有用的是可在手术最后中和它们。因此需要可中和的抗血栓形成剂以随时终止抗凝血活性。在专利申请WO02/24754和WO06/030104中已经描述了可中和的抗血栓形成剂，如生物素化的合成多糖。它们的合成，尤其包括在上文提到的多糖的被护等价物上而非在这些多糖本身上进行的生物素或生物素衍生物的接枝，不适用于本发明的化合物。原因在于，希望对最终产品进行生物素化，该最终产品是由肝素得到的多糖的混合物并因此是异质产品，如上述专利申请中所述的生物素在其上的接枝不能诱发接枝位置的充足区域选择性并且不能实现低分子量肝素的所有可官能化多糖链的生物素化。Osmond等人的团队在AnalyticalBiochemistry,31(2002)199-207中描述了将猪肝素生物素化的几种技术，其中之一被描述为经由还原6性氨基化在肝素的还原端偶联生物素，然后与生物素偶联。但是，所述文献中描述的操作条件不能完全和可再现地获得生物素化肝素它们未考虑肝素的结构多样性和如在市售肝素中存在的多糖链的实际结构。市售肝素包含大比例的在其还原端含有根据Osmond等人所述的规程用生物素不能官能化的降解糖丝氨酸(glycos^ine)的多糖链。因此，所述出版物中描述的用于猪肝素生物素化的操作条件不能完全和可再现地获得具有预期特征(如足以实现有效中和的生物素化率)的生物素化肝素。Tseng等人的团队在Biomaterials,27(2006)，2627-2636中描述了通过与抗生物素蛋白的相互作用然后用生物素将肝素官能化来将肝素固定在薄膜上的技术。通过用碘氧化然后形成内酯然后与生物素的2-(4-氨基苯基)乙胺衍生物偶联，进行肝素的生物素化。但是，Tseng等人提出的操作条件没有预想到在还原端完全和可再现获得被生物素化的肝素具体而言，没有表明该氧化步骤在还原端上可以是选择性的，也没有表明在这种处理后保持肝素的生物活性。因此，申请人的目标是提供可用抗生物素蛋白或链霉亲和素中和并具有与原料低分子量肝素相当的生物性质，尤其是抗Xa因子和抗IIa因子活性的新型低分子量肝素。本发明涉及新型的改性低分子量肝素，在下文被称作"生物素化低分子量肝素，，，其特征在于它们具有3000至7000Da的平均分子量且它们的构成多糖(polysaccharidesconstitutifs)在它们的还原端以共价方式键合到生物素或生物素衍生物上。令人惊讶地，在多糖t连的还原端引入生物素或生物素衍生物不会改变该低分子量肝素的药理活性。事实上，作为本发明的主题的该新型生物素化低分子量肝素具有与天然(native)低分子量肝素，即生物素化之前的肝素相当的抗血栓形成活性。它们相对于天然低分子量肝素具有显著优点在紧急情况下，它们可以用特异性解毒剂快速中和。这种特异性解毒剂是四聚或单体形式的抗生物素蛋白，或链霉亲和素，各自质量等于大约66000、16400和60000Da(TheMerckIndex,第12版，1996,M.N.920，第151-152页,RevuePierceAvidin-BiotinHandbook)。它们的优点还在于，可用在一些治疗适应症(indicationsth打apeutiques)中，对该适应症4吏用的剂量是更高的，同时降低出血危险；它们因此可用在动脉领域中的治疗中。在本发明范围内，术语"低分子量肝素"是指具有肝素的构成多糖的一般结构的硫酸化多糖混合物，其具有3000至7000Da的平均分子量并通过肝素的解聚获得。在下文中，术语"低分子量肝素"或"天然低分子量肝素，，是指生物素化之前的多糖混合物，相对地，术语"生物素化低分子量肝素"是指根据本发明的化合物，其包含与生物素或其衍生物中的一种的共价键。术语"还原端"是指多糖链端，其中末端葡糖胺(glucosamine)或甘露糖胺(mannosamine)(甘露糖胺来自葡糖胺在碱性介质中的差向异构化)具有符合下式(II)的环形半缩醛官能NHY(II)其中-X代表H或S03Na，誦Y代表COCH3或S03Na，且-波形线是指位于与其相连的吡喃糖环的平面下方或上方的键(下方葡糖胺，上方甘露糖胺)。在本发明中可用的低分子量肝素中，它们中的一些可以使得其多糖链的至少75%在它们的还原端包含半缩醛形式的葡糖胺；它是该混合物的可官能化的多糖。该混合物中存在的某些多糖链可以是1,6-脱水形式，其含量小于或等于25%;这类多糖不可被生物素或生物素衍生物官能化。术语"该混合物的可官能化的构成多糖"是指在其还原端包含如式(II)所定义的半缩醛形式的葡糖胺的多糖。术语"肝素的构成多糖"是指以含有糖醛酸残基(D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)和D-葡糖胺的残基的二糖单元的重复为特征的多糖，该二糖单元可以是N-硫酸化或N-乙酰化的。该二糖单元也可以在D-葡8糖胺的C6和/或C3位置和在糖醛酸的C2位置被O-疏酸化(Heparin-bindingproteins,H,EdwardConrad,1998，第1页)本发明的生物素化低分子量肝素的特征有利地在于，它们的构成多糖符合通式(I):fR1)—BiotNHY(I)其中i等于0或1，Rl代表式(a)或(b)的f连区(enchainement):oCH.H■N一OCH,CH,O(a)H(b)其中j和k，相同或不同，是可以取1至10的任何值的整数，-Biot代表生物素基团或生物素衍生物，-PE代表具有肝素的构成多糖的一般结构的多糖链，-X代表H或S03Na，國Y代表S03Na或COCH3,-波形线是指位于与其相连的吡喃糖环的平面下方或上方的键，及其可药用盐。上文提到的生物素基团(Biot)是来自六氢-2-氧代-lH-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-戊酸的基团。有利地，根据本发明的通式(I)中的Biot基团符合式(c):0(c)该生物素书f生物可商业购得("Pierce，，生物素-抗生物素蛋白产品目录，2005，第7-11页)或可以使用本领域技术人员已知的传统方法进行制备。尤其可以提到专利申请WO02/24754中提到的生物素衍生物。在本发明的生物素化低分子量肝素中，指数i可以等于0,在这种情况下，在多糖链的还原端的糖单元所带的胺官能上直接进行与生物素或生物素书f生物的键合。或者，i可以等于1，与生物素基团或生物素衍生物的4建可以例如由上式(a)的链区(其中j等于》或由上式(b)的链区(其中j和k是相同的并等于5)构成。因此，在上式(I)中，Rl可以代表例如，式-CO-(CH2)5-NH或-CO-(CH2)5-NH-CO誦(CH2)5-NH-的链区。本发明的生物素化低分子量肝素使得它们的构成多糖的至少60%,有利地至少80%,再更有利至少90%在其还原端上具有与生物素或生物素衍生物的共价键。本发明中所用的低分子量肝素可以例如选自依诺肝素(enoxaparine)、阿；也肝素(ardeparine)、贝米肝素(b6miparine)、巾白肝素(parnaparin)和亭扎肝素(tinzaparine)。如专利US5,389,618和USRE38,743中所述，本发明中所用的低分子量肝素尤其可以为如它们的构成多糖的9%至20%具有小于2000Da的平均分子量，它们的构成多^f唐的5%至20%具有大于8000Da的平均分子量，它们的构成多糖的60%至86%具有2000至8000Da的平均分子量，质量平均分子量(massemol6culaireenmasse)与数均分子量(massemol6culaireennombre)之间的比率为1.3至1.6,且所述低分子量肝素具有比肝素更好的生物利用率和抗血栓形成活性，并具有大约3500至5500Da的平均分子量。本发明包括呈其可药用盐任一种的形式的生物素化的低分子量肝素。本发明的主题还包括上述生物素化低分子量肝素的制备方法，其特征在于a)在胺盐和还原剂存在下和在20至8(TC的温度下，在如上定义的低分子量肝素上进行还原性氨基化，b)然后在水性介质或在有机介质中在碱存在下用活化基团-(111)^61(^进4亍酰化，其中Rl、i和Biot如上文针对式(I)所定义。可以通过^f吏用例如专利申i青WO2004/027087中所述的方法通过HPLC(尤其是SAX类型的)分析监测，或任选地使用例如RobertJ.Linhardt在J.Biol.Chem.，2004,279(4)，第2608-2615页中所述的方法通过LC-MS来控制上述制备方法的步骤。该生物素化低分子量肝素也可以通过由Pierce公司出售的负载型行分析和表征。尤其证实，在还原性氨基化步骤a)后，所述低分子量肝素的构成多糖的至少90%在其还原端带有-NH2官能(氨基还原多糖)。尤其证实，在酰化步骤b)后，至少所述氨基还原多糖的90%被生物素化。本发明的生物素化低分子量肝素的制备方法的总收率罔此为至少80%和有利地至少90%。本发明的化合物的制备方法使用之前如文献所报道制成的低分子量肝素作为原料低分子量肝素("天然"低分子量肝素)。尤其参考专利USRE38,743(关于依诺肝素)、US4,757,057(关于阿地肝素)、EP0293539(关于贝米肝素)、US4,791，195(关于帕肝素)和US5,106,734(关于亭扎肝素)。在上述制备方法的还原性氨基化步骤a)中，胺盐可以是季胺盐；其有利地的是符合式NH4Z(其中Z代表卣素原子，如氯、氟、溴或碘原子)的卣化铵盐。在上述制备方法的还原性氨基化步骤a)中，还原剂可以是硼氢化物盐，例如氰基硼氢化物盐。在上述制备方法的还原性氨基化步骤a)中，温度有利地为50至80°C。在上述制备方法的酰化步骤b)中，碱可以是碳酸盐或碳酸氢盐，尤其是钠或钾盐形式，或本领域技术人员已知的其它的任何水溶性或在有机介质中可溶的有机石威。在上述制备方法的酰化步骤b)中，术语"有机介质"是指例如二氯甲烷或二曱基甲酰胺。本发明的生物素化低分子量肝素的制备方法有利地包括下列步骤a)在卣化铵盐和硼氢化物盐存在下，在50至80。C的温度下，在低分子量肝素上进行还原性氨基化，b)然后在水性介质中在碱存在下用呈活化酯形式的如上定义的基团-(Rl)i-Biot进行酰化。如上定义的生物素化衍生物-(Rl)i-Biot可直接以活化酯形式用在酰化反应中，使用本领域技术人员已知的传统偶联条件原位预先形成或生成。尤其可以使用N-羟基琥珀酰亚胺衍生物或3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺书f生物形式的活化酯。本发明的制备方法在流程图1中说明。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>根据流程图1,在胺盐和还原剂(如硼氬化物盐)存在下使低分子量肝素经受还原性氨基化以获得在还原端具有游离胺官能的衍生物A。该衍生物可随后通过在碱存在下与如上定义的生物素活化衍生物-(Rl)rBiot反应进行酰化以提供生物素化衍生物B。当Rl代表链区-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-时，可以例如用酯3-磺基琥珀酰亚胺基的6-生物素酰氨基己酰己酸酯的钠盐(seldesodiumdel，esterde6-biotinamidohexanoylhexanoatede3-sulfosuccinimidyl)进行这种反应，或当Rl代表链区-CO-(CH2)s-NH-时用3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酉旨的钠盐(seldesodiumde1，esterde6-biotinamidohexanoatede3-sulfosuccinimidyl)进行这种反应，或当Rl不存在(i-O)时用生物素酰基-3-磺基琥珀酰亚胺基酯钠盐(seldesodiumdel，esterdebiotinoyl画3國sulfosccinimidyl)进行这种反应。在流程图1中，要理解的是，衍生物A和B是理论示意图，因为其实际上是多糖链的混合物作为低分子量肝素的衍生物。在下文中，举例详述了本发明的生物素化低分子量肝素和可用于获得它们的各种中间体的合成实施例。使用下列缩写HPLC:"高效液相色"i普"；SAX:"强阴离子交换色镨"；LC-MS:"液相色谱-质谱"，表示液相色谱-质谱联用Q.S.P.:"足量至"；LC:"长链"，对应于6-氨基己酰基链区；，LC-LC:代表两个LC链区并对应于酰氨基-己酰基-6-氨基-己酰基链区；Sulfo-NHS:3-石黄基琥珀酰亚胺基酯的钠盐；肝素酶1:来自肝素黄杆菌的肝素裂合酶I酶(EC4.2.2.7)图1显示了通过HPLCSAX对根据实施例1的依诺肝素转化过程的反应监测。图2、3和4显示了使根据实施例1、2和3分别获得的产物通过负载型抗生物素蛋白单体柱(colonned，avidinemonom6riquesupport^)后获得的生物素化和未生物素化馏分的HPLCSAX分析。实施例1:NHLC生物素酰基依诺肝素(EnoxaparineNHLCBiotinoyl)依诺肝素是根据专利USRE38,743中所述的方法获得的低分子量肝素。根据流程图2中描述的反应次序将其转化成生物素化衍生物将依诺肝素经由还原性氨基化反应转化成在其还原端上具有氨基官能的化合物1,然后经由与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酯，钠盐的反应将该衍生物转化成生物素化化合物2。13流程图2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>1.1:l-氨基依诺肝素将1克依诺肝素溶解在40亳升5M氯化铵水溶液中。将1克氰基硼氲化钠添加到所得溶液中。将该混合物在60。C下保持24小时。将该溶液冷却至大约2(TC并用水稀释(Q.S.P.100毫升)。将所得滤液在S印hadexG10柱上脱盐，然后冻干。获得824毫克白色冻干产物。观测到的收率为82%。通过HPLCSAX控制产物(参见图l)且原样用在生物素化步骤中。1.2:NHLC生物素酰基依诺肝素将200毫克1-氨基依诺肝素在大约20。C温度溶解在5毫升0.5M爿碳酸氩钠溶液中。将136毫克Sulfo-NHS-LC-生物素添加到所得溶液中。将该溶液在大约2(TC的温度搅拌1小时。所得悬浮液用10毫升0.5M碳酸氲钠溶液稀释。加入136亳克Sulfo-NHS-LC-生物素，并将所得混合物搅拌18小时。再加入136毫克Sulfo-NHS-LC-生物素并将该反应混合物搅拌1小时。再加入70毫克Sulfo-NHS-LC-生物素并将反应混合物搅拌3小时。所得反应介质用水稀释(Q.S.P.200毫升)，在0.45)im膜上过滤，然后在S6phadexG10柱上脱盐。将所得馏分注入到Q-S印harose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将收集的馏分在S6phadexG10柱上脱盐。所得产物再通过使其通过Q-S6pharose柱和在S6phadexG10上脱盐来提纯。将收集的最终馏分冻干。获得190毫克白色冻干产物。观测到的收率为87%。该寡糖混合物在D20中的^NMR谱(25。C,S(ppm)):1.3-1.8(12H,m),2.05(CH3CO，s)，2.25(2CH2CO生物素，m),2.80(1H，d，12Hz),3.03(1H,dd,12和5Hz),3.15-5.65(多糖质子)，5.99(1H，d，4Hz).通过HPLCSAX控制所得产物图l(附图1/4)显示了依诺肝素经由还原性氨基化反应转化成在其还原端上具有氨基官能的衍生物l(参见流程图2)的通过HPLCSAX进行的反应监测。该衍生物随后通过与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酯，钠盐反应而转化成生物素化书f生物2。所用分析方法描述在专利申请WO2004/027087中。图l表明，具有可官能化葡糖胺的物类以高于90%的转化率被转化成在其还原端上含有氨基官能的衍生物，从而产生1-氨基依诺肝素。图l还表明，在其还原端上具有氨基官能的物类通过与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酯，钠盐反应而以高于90%的转化率被转化成生物素化衍生物，从而产生NHLC生物素酰基依诺肝素。例如，图l显示了与根据实施例1获得的寡糖混合物中存在的主要产物对应的峰，其主要结构如下所示(所用术语对应于专利申请WO2004/027087的术语)。LC-MS分析能够经由与酸形式的产物对应的质谱证实这些化合物的结构△Islsidm/z-1154;Alslswlswm/z=1731;Alslsldlsldlsldm/z=2308;Alslsnn,6-脱水m/z=1056;Alslsldlsld1,6<脱水m/z=1633;Alslswls,dlSun务脱水m/z=2210;AlslsldNH2m/z=1155;AlslsldlsldNH2m/z=1732;Alslswls!dlsidNH2m/z=2309;AlslsldNHLCBiotm/z=1494;AlslsldlsldNHLCBiotm/z=2071;AlslsldlsldlsldNHLCBiotm/z=2648.NaOOCOS03NaNHS03W△IsisOS03NaNHS03NaOSO,NaNHSO，NaOSO,NaIOSO,Na3NHSO，Na,OSO)NaNHSO，Ns.OSO，NaOSO,NaNHSO，Ni,OSO，Na6sO，NaIOSO，Na，NHSO，NaAlslslrflslrtlslrigOONa△lslsldlsld,OSO，NaOSO,NaNHSO，PJaNHSC^Ma,OSO，NaOSO,fJaNHSO，NaOSO,NaMHSO,NaOSO，Na,OSO，NaNHSO，NaOSO，NaNHSO，NaOSO，NaAisiSldiSld1.6脱水,OSO，NaOSO，Na,NHSO,Na簡O，MaNHSO,NsAlslS|dIS|dIS|d16脱水,OSO，Na.OSO，Ma一OSO，NaOSO,NaNHS(^NaOSO，NaAlslSldNH2一OSO，NaOSO》NaNHSO,NaOSO，Na鹏o,Na0S0NaAlslsldlsldNH2.OSO，Na.OSO,Na■NH,NHSO，NaOSO,NaNHSO，Na6S0^a(!)HSO，NaOSO"a△lslsldlsldlsldNH2OSO，NaNHSO，NaO，；，△lslsldNHLCBiotOSO，NaNHSO，NaOSO,NaWso，NaNHSO，Na,OSO，Na,OSO，NaAlslsldlsldNHLCBiot,OSO，NaUOSO，NaNHSO，NaOSO，NaAlslsldlsldlsldNHLCBiot说明书第12/25页此外，根据实施例1获得的产物可注入到负载型抗生物素蛋白单体柱上。根据供应商Pierce描述的条件进行洗脱。然后将由此获得的生物素化馏分(与抗生物素蛋白亲合的)和未生物素化馏分(与抗生物素蛋白非亲合的)注入到HPLCSAX上(参见图2，附图2/4):图2显示了通过负载型抗生物素蛋白单体柱后获得的生物素化和未生物素化馏分的HPLCSAX分析。图2表明，具有可官能化葡糖胺的物类已经以高于90%的转化率转化成相应的生物素化物类。非亲合的镏分主要由1，6-脱水衍生物(其本质上不能转化成生物素化衍生物)构成。举例给出一些主峰的结构以表征所得产物(参见上示结构)。实施例2:NH生物素酰基(NHBiotinoyl)依诺肝素依诺肝素，根据专利USRE38743中所述的方法获得的低分子量肝素，根据流程图3中所述的反应次序被转化成生物素化衍生物将依诺肝素经由还原性氨基化反应转化成在其还原端上具有氨基官能的化合物l，然后经由与生物素酰基-3-磺基琥珀酰亚胺基酯，钠盐的反应将该衍生物转化成生物素化化合物3。流程图3Y=S03Na，COCH:化合物3将200毫克1-氨基依诺肝素在大约2(TC的温度溶解在5毫升0.5M碳酸氢钠溶液中。将107毫克Sulfo-NHS-生物素添加到所得溶液中。将该溶液在大约20。C温度搅拌1小时30分钟。所得悬浮液用10毫升0.5M碳酸氢钠溶液稀释。加入107毫克Sulfo-NHS-生物素，并将所得混合物搅拌3小时。所得反应介质用水稀释(Q.S.P.150毫升)，经0.45|am膜过滤，然后注入到Q-S6pharose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将收集的馏分在S6phadexG10柱上脱盐。将收集的镏分冻干。获得190毫克白色冻干产物。观测到的收率为大约90%。通过HPLCSAX控制所得产物:(参见图3,附图3/4,"Global"图)，并经证实，在其还原端上具有氨基官能的物类通过与生物素酰基-3-磺基琥珀酰亚胺基酯，钠盐反应而以高于90%的转化率被转化成生物素化衍生物。该寡糖混合物在D20中的！HNMR谱(25。C，S(ppm)):1.4-1.8(6H,m)，2.05(CH3CO,s),2.3(CH2CO生物素，m),2.80(1H,dd，12和7Hz)，3.03(1H，m)，3.20-5.65(多糖质子)，5.98(1H,d，4Hz)。将根据实施例2获得的产物注入到负载型抗生物素蛋白单体柱上。根据供应商Pierce描述的条件进行洗脱。然后将所得的生物素化馏分(与抗生物素蛋白亲合的)和未生物素化馏分(与抗生物素蛋白非亲合的)注入到HPLCSAX上(参见图3，附图3/4)。非亲合的馏分主要由1,6-脱水衍生物(其本质上不能转化成生物素化衍生物)构成。例如，图3描述了该寡糖混合物的某些主要化合物的结构。参考结构如下所示。LC-MS分析能够经由与呈酸形式的产物对应的质谱证实这些化合物的结构△ISlS|<j1,6-脱水m/z=1056;AIsIskjIswi,6-脱水m/z=1633;Alsls!dlSwlsnn,6-脱水m/z=2210;Alsls!dNHBiotm/z=1381;AlslsldlsldNHBiotm/z=1958;AlslsldlsldlsldNHBiotm/z=2535.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>实施例3:NH-LC-LC生物素酰基(NH-LC-LCBiotinoyl)依诺肝素依诺肝素，根据专利USRE38743中所述的方法获得的低分子量肝素，也可根据流程图4中所述的反应次序被转化成生物素化衍生物将依诺肝素经由还原性氨基化反应转化成在其还原端上具有氨基官能的化合物1,然后通过与3-磺基-琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酰己酸酯，钠盐的反应将该衍生物转化成生物素化化合物4。流程图4Y=S03Na,COCH3化合物4将200毫克1-氨基依诺肝素在大约2(TC的温度溶解在5毫升0.5M石灰酸氬钠溶液中。将164毫克Sulfo-NHS-LC-LC-生物素添加到所得溶液中。将该溶液在大约2(TC温度搅拌2小时。该悬浮液用10毫升0.5M碳酸氩钠溶液稀释。加入164毫克Sulfo-NHS-LC-LC-生物素并将所得混合物搅拌5小时。所得反应介质用水稀释(Q.S.P.150毫升)，经0.45]um膜过滤，然后注入到Q-S6pharose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将收集的馏分在S6phadexG10柱上脱盐。将收集的镏分冻干。获得210毫克白色冻干产物。观测到的收率为大约92%。通过HPLCSAX控制所得产物(参见图4,附图4/4,"Global"图)，并证实，在其还原端上具有氨基官能的物类通过与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酰己酸酯，钠盐反应而以高于90%的转化率^皮转化成生物素化书f生物。-该寡糖混合物在020中的iHNMR谱(25。C,5(ppm)):1.3-1.8(16H,m),2.05(CH3CO,s)，2.25(6H,m)，2.80(1H，dd，12和7Hz)，3.03(1H,m)，3.20-5.65(多糖质子)，5.98(1H,d，4Hz)。20将根据实施例3获得的产物注入到负载型抗生物素蛋白单体柱上。根据供应商Pierce描述的条件进行洗脱。然后将所得生物素化馏分(与抗生物素蛋白亲合的)和未生物素化镏分(与抗生物素蛋白非亲合的)注入到HPLCSAX上(参见图4)。非亲合的馏分主要由1,6-脱水衍生物(其本质上不能被转化成生物素化衍生物)构成。通过LC-MS联用证实主要化合物的结构。例如，图4描述了该寡糖混合物的某些主要化合物的结构。参考结构如下所示。LC-MS分析能够经由与呈酸形式的产物对应的质谱证实上述化合物的结构Alslsw1,6-脱水m/z=1056;Alslsldlsld1^脱水m/z=1633;AlslSwlswlSw,6,脱水m/z=2210;AlslswNHLCLCBiotm/z=1607;AlslsldlsldNHLCLCBiotm/z=2184;△lslsldlsldlsldNHLCLCBiotm/z=2761.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>△lslsldlsldlsldNHLCLCBiot实施例4:NH-LC生物素酰基亭扎肝素亭扎肝素，通过用肝素酶1处理而获得的大约6000道尔顿的低分子量肝素，也可以根据流程图5中所述的反应次序被转化成生物素化衍生物将亭扎肝素经由还原性氨基化反应转化成在其还原端上具有氨基官能的化合物5，然后经由与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酯钠盐的反应将该衍生物转化成生物素化化合物6。流程图5X=H或SO,NaY=S03Na,COCH3化合物64.1:1-氨基亭扎肝素将250毫克亭扎肝素溶解在10毫升5M氯化铵水溶液中。将250毫克氰基硼氢化钠添加到所得溶液中。将该混合物在70。C保持20小时。将该溶液冷却至大约2(TC的温度，用水稀释(Q.S.P.20毫升)。将22所得滤液在S6phadexG10柱上脱盐，然后冻干。获得215毫克白色冻干产物。观测到的收率为86%。该寡糖混合物在020中的^NMR语(25。C,S(ppm)):2.05(CH3COs)，3,10和3.40(各1H，m，CH2NH2),3.20-5.65(多糖质子)，5.98(1H，d，4Hz)。可以^吏用前面在实施例1中描述的方法，通过HPLCSAX控制该化合物。该产物原样用在生物素化步骤中。4.2:NHLC生物素酰基亭扎肝素将100毫克1-氨基亭扎肝素在大约20。C的温度溶解在2.5毫升0.5M石灰酸氢钠溶液中。将47毫克Sulfo-NHS-LC-生物素添加到所得溶液中。将该溶液在大约20。C的温度搅拌1小时45分钟。所得悬浮液用5毫升0.5M碳酸氬钠溶液稀释。加入47毫克Sulfo-NHS-LC-生物素并将所得混合物搅拌6小时。再加入47毫克Sulfo-NHS-LC-生物素并将反应混合物搅拌20小时。该悬浮液再用1毫升0.5M碳酸氢钠溶液稀释并再加入47毫克Sulfo-NHS-LC-生物素。将反应混合物搅拌20小时。该悬浮液再用6.5毫升0.5M》灰酸氲钠溶液稀释并再加入47毫克Sulfo-NHS-LC-生物素。将反应混合物搅拌22小时，然后用水稀释(Q.S.P.100毫升)，经0.45nm膜过滤，并注入到Q-S6pharose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将收集的镏分在S印hadexG10柱上脱盐。将收集的最终馏分冻干。获得110毫克白色冻干产物。观测到的收率是定量的。该寡糖混合物在020中的！HNMRi普(25。C,S(ppm)):1.3-1.8(12H,m)，2.05(CH3CO，s)，2.25(4H，m),2.80(1H，dd,12和7Hz),3.03(1H,m),3.20-5.65(多泮唐质子)，5.98(1H，d，4Hz)。化合物1-氨基亭扎肝素和所得的NHLC生物素酰基亭扎肝素也可以通过之前在实施例1中所用的HPLCSAX方法进行表征。该HPLC控制表明，具有可官能化的葡糖胺的物类以高于90%的转化率被转化成在其还原端上具有氨基官能的衍生物，从而产生1-氨基亭扎肝素。其还表明，在其还原端上具有氨基官能的物类通过与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酯，钠盐反应而以高于90%的转化率被转化23成生物素化衍生物，从而产生NHLC生物素酰基亭扎肝素。以与实施例l相同的方式，可以通过LC-MS分析证实主要化合物的结构。也可以将所得产物注入到负载型抗生物素蛋白单体柱上。根据供应商Pierce描述的条件进行洗脱。可以通过HPLCSAX控制所得生物素化馏分(与抗生物素蛋白亲合的)和未生物素化馏分(与抗生物素蛋白非亲合的)。实施例5:NHLC生物素酰基贝米肝素，贝米肝素，通过碱性解聚获得的大约3500道尔顿的低分子量肝素，也可以根据下列流程图6中所述的反应次序被转化成生物素化衍生物将贝米肝素经由还原性氨基化反应转化成在其还原端上具有氨基官能的化合物7，然后经由与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酯，钠盐的反应将该衍生物转化成生物素化化合物8。流程图6NH4Cl/NaBH3CNX=H或S03Na一Y=S03Na,COCH3贝米肝素sulfo-NHS-LC-biotinNaHC03'H或SOaNa=S03Na,COCHs化合物7X=喊S03Na—r=SO,Na,COCH3化合物85.1:l-氨基贝米肝素将250毫克贝米肝素溶解在10毫升5M氯化铵水溶液中。将250毫克氰基硼氢化钠添加到所得溶液中。将该混合物在70。C下保持2024小时。将该溶液冷却至大约2(TC并用水稀释(Q.S.P.20毫升)。将所得滤液在S6phadexG10柱上脱盐，然后冻干。获得227毫克白色冻干产物。观测到的收率为91%。该寡糖混合物在D20中的^NMR谱(25。C,5(ppm)):2.05(CH3COs)，3.10和3.40(各1H,m，CH2NH2),3.20-5.80(多糖质子)，5.98(1H,d,4Hz).可以使用前面在实施例1中描述的方法，通过HPLCSAX控制该化合物。所得产物原样用在生物素化步骤中。5.2:NHLC生物素酰基贝米肝素将100毫克1-氨基贝米肝素在大约20。C的温度溶解在5毫升0.5M石友酸氬钠溶液中。将80毫克Sulfo-NHS-LC-生物素添加到所得溶液中。将该溶液在大约2(TC的温度搅拌2小时。所得悬浮液用10毫升0,5M碳酸氲钠溶液稀释。加入80毫克Sulfo-NHS-LC-生物素并将所得混合物搅拌2小时。再加入40毫克Sulfo-NHS-LC-生物素并将反应混合物搅拌20小时。所得反应介质用水稀释(Q.S.P.50毫升)，然后再S印hadexG10柱上脱盐。将所得馏分注入到Q-S6pharose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将收集的馏分在S6phadexG10柱上脱盐。所得产物再通过使其通过Q-S一harose柱来提纯并在S6phadexG10上脱盐。将收集的最终馏分冻干。获得101毫克白色冻干产物。观测到的收率为92%。该寡糖混合物在020中的!HNMR谱(25。C,5(ppm)):1.3-1.8(12H,m)，2.05(CH3CO，s),2.25(4H，m),2.80(1H，dd，12和7Hz)，3.03(1H,m),3.20-5,65(多糖质子)，5.98(1H,d，4Hz)。化合物1-氨基贝米肝素和所得NHLC生物素酰基贝米肝素也可以通过之前在实施例1中所用的HPLCSAX方法进行表征。该HPLC控制表明，具有可官能化葡糖胺的物类以高于90%的转化率被转化成在其还原端上具有氨基官能的衍生物，从而产生1-氨基贝米肝素。其还表明，在其还原端上具有氨基官能的物类通过与3-磺基琥珀酰亚胺基6-生物素酰氨基己酸酯，钠盐反应而以高于90%的转化率被转化成生物素化衍生物，从而产生NHLC生物素酰基贝米肝素。以与实施例1相同的方式，可以通过LC-MS分析证实主要化合物的结构。也可以将所得产物注入到负载型抗生物素蛋白单体柱上。根据供应商Pierce描述的条件进行洗脱。可以通过HPLCSAX控制所得生物素化馏分(与抗生物素蛋白亲合的)和未生物素化馏分(与抗生物素蛋白非亲合的)。所述的本发明的化合物作为生物化学和药理学研究对象。1.抗IIa因子活性和抗Xa因子活性的测量通过显色法分析了在人血浆或'緩冲体系中的抗IIa因子(抗-FIIa)活性和抗Xa因子(抗-FXa)活性借助含有发色底物S-2238、a-凝血酶和人ATIII(抗凝血酶III)的Actichrome肝素的抗IIa因子试剂盒(Americandiagnostica)测试抗IIa因子活性。使用含有ATIII、Xa因子和发色底物S-2765的H6parine试剂盒(InstrumentationLaboratory),用自动血凝4义ACL7000(InstrumentationLaboratory)测定抗-FXa活性。根据制造商的指示进行两次分析。使用下列标样以建立用于测量生物素化低分子量肝素馏分在人血浆和緩冲体系中的体外活'性的标准校准曲线-用于低分子量肝素的第一国际标样(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,Londre,R-U,在1987年建立，编号No.85/600)-用于低分子量肝素的第二国际标样(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,Londre，R國U，在1987年建立，编号No.01/608,自2006年6月起使用)-依i若肝素(Clexane⑧，sanofi-aventis，France)用4乍内才示。为了测定抗-FIIa活性，将10微升样品或低分子量肝素的国际标样用在人血浆或含有0.05MTrisHCl、0.154MNaCl的緩冲体系(pH7.4)中的抗凝血酶稀释至1:16。将10孩t升该溶液添加到96孔^f敖滴定板中。一式三份地重复该测量(在3个孔上)。在300转/分钟下搅拌的同时，将该微滴定板保持在37。C下。将40微升凝血酶添加到所述孔的每一个孔中并正好培养2分钟。加入40孩i升Spectrozyme。90秒后，通过添加40微升乙酸，终止该反应。使用SpectraMax340(MolecularDevices)在405nm下测量吸收。为了测量抗-FXa活性，将样品或低分子量肝素的国际标样在人血浆或含有0.05MTrisHC1、0.154MNaCl的緩冲体系(pH7.4)中进行稀释。将在血浆或该緩冲液中含有类肝素(h6parinoMes)的样品再用含ATIII的工作緩冲液稀释至1:20,并一式两份地装在探针转子(rotordesondage)中。将Xa因子试剂和发色底物倒入自动血凝仪ACL7000的指示储器中。用集成到ACL7000软件中的"Heparin，，规程进行抗-FXa活性的测量。在分析过程中，将50微升样品(用工作緩冲液稀释)与50微升Xa因子试剂混合。在37。C下60秒培养时间后，加入50孩i升浓度1.1mM的发色底物，并在405nm波长下测量作为时间的函数的吸收变化。所得结果尤其描述在表1中。表1MM(Da〉抗-F》(Ul/测量值:a活性mg)校正值抗-FI(Ul/测量值Ia活性mg)校正值依诺肝素41001211212828l-M依诺肝素410011611626.526.5NHLC生物素酰基依诺肝素44411011092122.7NH生物素酰基依诺肝素4328981032931NHLCLC生物素酰基依诺肝素465382932427亭扎肝素60001081087979l-氩基亭扎肝素60001131138080NHLC生物素酰基亭扎肝素63411061126367贝米肝素35001381381717l-M贝米肝素35001011011616NHLC生物素酰基贝米肝素3841931021314在该表中，MM是指平均摩尔质量(以道尔顿为单位)，且"校正，，活性能够在该测量中校正整体稀释效应(effetdedilutionmassique)。如下计算校正活性校正活性=(测得活性x制成的化合物的MM)/原料产品的MM其中制成的化合物的MM:制成的化合物的理论平均摩尔质量，原料产品的MM:原料低分子量肝素的平均摩尔质量。这些结果表明，本发明的生物素化低分子量肝素保持与天然低分子量肝素相当的抗Xa因子和抗IIa因子活性。这些生物性质的保持因此使它们可用于治疗。2.用抗生物素蛋白中和后的抗-FXa活性的测量用溶液中的抗生物素蛋白中和生物素化产品的效应在递增浓度的抗生物素蛋白存在下测量与产品相关的抗-FXa或抗-FIIa抗凝血酶活性，以测量抗生物素蛋白与该产品的生物素的结合对该活性的影响。将研究产品以1毫克/毫升溶解在含有0.9%NaCl的水中。然后稀释所述产品以获得能够在抗凝血酶(人抗凝血酶，Milan,Italy)存在下抑制Xa因子(Xa因子，ChromogenixMilan,Italy)或IIa因子(IIa因子,laboratoiredusang[BloodLaboratory],Strasbourg)的50%活小生的产品浓度。然后在递减浓度的抗生物素蛋白(来自蛋白的SIGMA抗生物素蛋白，Ref.A-9275,在NaCl中稀释)300、30、3、0.3、0.03、0.003、0微克/毫升存在下测量这种抑制。通过添加特异性发色底物S2222(Chromogenix,Milan,Italy)用于Xa因子和S2238底物(Chromogenix,Milan,Italy)用于IIa因子，进行Xa因子(或IIa因子)的残留活性的测量。在405纳米下读取光学密度。在緩冲液中验证生物素化产品与连接到珠粒上的抗生物素蛋白的结合为了评测所述产品的结合抗生物素蛋白的能力，使所述产品与连接到珠粒上的抗生物素蛋白接触。在该混合物离心后，在上清液中测定抗-FXa或抗-FIIa活性。这种活性能够确定该混合物离心后留在该介质中的浓度并由此确定被俘获在沉淀物中的产品部分。将所述研究产品以1毫克/毫升溶解在0.9。/。NaCl溶液中。稀释所述产品以便能够抑制在该试验中存在的80。/。抗-FXa或抗-FIIa活性。通过用洗涤緩冲液20mMtrisMal6ate、150mMNaCl，pH7.35对其进行稀释，使珠粒溶液达到1毫克/亳升。搅拌该溶液并将IOO微升含珠粒的溶液(l毫克/毫升)置于Eppendorf试管中。加入500微升緩沖液。将所述试管在12000转/分钟下离心5分钟。在除去上清液后，将该沉淀物置于500微升緩沖液中。在搅拌后，进行第二次离心，并再除去上清液。然后使产品溶液与不同的含珠粒的溶液接触以获得1、0.1、0.01和0.001的以微克产品/微克抗生物素蛋白(SIGMA抗生物素蛋白Ref.A-9275,大约3毫克/毫升的溶液，取决于批次)表示的产品/珠粒比率。然后搅拌所述混合物并静置1小时，然后在12000转/分钟下离心5分钟。然后取上清液测量抗-FXa活性以确定留在上清液中的产品浓度。通过经由TeienA.N和LieM.，ThrombosisResearch,1977，10,399-410描述的方法修改的方法测量抗-FXa或抗-FIIa活性。所得结果尤其描述在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>由此看出，该低分子量肝素确实已被生物素官能化，具有高于80%的生物素化率，并确实能够用抗生物素蛋白中和。本发明的生物素化低分子量肝素可用于制备药物。它们尤其可用作抗血栓形成剂。因此，根据其另一方面，本发明的一个主题是包含如上定义的生物素化低分子量肝素的药物。这些药物可用于治疗，特别是用于治疗和预防静脉血栓形成、动脉血栓形成事件(accidentsthrombotiquesart&iels)(尤其是在心肌梗塞或不稳定心绞痛的情况下)、周围动脉血栓形成，如下肢动脉病、缺血性脑卒中(thrombosesart6riellesc6r6brales)和中风(accidentsvasculairesc6r6braux)。它们也可29用于预防和治疗平滑肌细胞增殖、血管生成和用作动脉粥样硬化和动脉硬化的神经保护剂。才艮据其另一方面，本发明还涉及上述病状的治疗方法，包括向患者给药有效剂量的本发明的化合物或其可药用盐。如上定义的生物素化低分子量肝素用于治疗和预防上述病状的用途因此构成本发明的一部分，以及所述生物素化低分子量肝素用于制造用于治疗或预防这些病状的药物的用途也构成本发明的一部分。根据其另一方面，本发明的主题是包含，作为活性成分，本发明的生物素化低分子量肝素或其可药用盐，以及至少一种可药用惰性赋形剂的药物组合物。根据所需药物形式和给药模式(例如口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、经粘膜、局部或直肠途径)选择所述赋形剂。在每单位剂量中，活性成分以适合所设计的每日剂量的量存在以获得所需预防和治疗作用。每单位剂量可以含有20至150毫克，有利地40至100毫克活性成分。抗凝血剂化合物的这些剂量可以用静脉注射、丸药或输注形式以0.2克-2克的抗生物素蛋白或链霉亲和素剂进行中和。可存在特定情况，其中更高或更低剂量是适当的；这些剂量不超出本发明的范围。根据一般实践，由医生根据给药模式和所述患者的体重和反应确定适合各患者的剂量。本发明的化合物也可以与一种或多种用于所希望治疗的其它活性成分，如抗血栓形成剂、抗凝血剂或抗血小板凝集剂组合进行使用。本发明的主题还包括使用抗生物素蛋白或链霉亲和素的方法，其特征在于，其能够中和本发明的生物素化低分子量肝素。因此，该抗生物素蛋白或链霉亲和素可用于制备用于中和本发明的生物素化低分子量肝素的药物。权利要求1.低分子量肝素，其特征在于它们具有3000至7000Da的平均分子量和在于它们的构成多糖在它们的还原端以共价方式与生物素或生物素衍生物键合。2.根据权利要求1的生物素化低分子量肝素，其特征在于它们的构成多糖符合通式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中-i等于0或1,-R1代表式(a)或(b)的链区其中j和k,相同或不同，是可以取1至10的任何值的整数，-Biot代表生物素基团或生物素衍生物，-PE代表具有肝素的构成多糖的一般结构的多糖链，画X代表H或S03Na,画Y代表S03Na或COCH3,-波形线是指位于与其相连的吡喃糖环的平面下方或上方的键，及其可药用盐。3.根据权利要求2的生物素化低分子量肝素，其特征在于i等于0,及其可药用盐。4.根据权利要求2的生物素化低分子量肝素，其特征在于i等于1且R1代表式(a)的链区，其中j等于5，及其可药用盐。5.根据权利要求2的生物素化低分子量肝素，其特征在于i等于l且R1代表式(b)的链区，其中j和k是相同的并等于5，及其可药用盐。6.根据权利要求2至5任一项的生物素化低分子量肝素，其特征在于Biot代表式(c)的生物素基团及其可药用盐。7.根据权利要求1至6任一项的生物素化低分子量肝素，其特征在于它们的构成多糖的至少60%在其还原端具有与生物素或生物素衍生物的共价键，及其可药用盐。8.根据权利要求7的生物素化低分子量肝素，其特征在于它们的构键，。、°0、'、-'、、及其可药用盐。9.根据权利要求7或权利要求8的生物素化低分子量肝素，其特征在于它们的构成多糖的至少90%在其还原端上具有与生物素或生物素衍生物的共价键，及其可药用盐。10.根据权利要求1至9任一项的生物素化低分子量肝素，其特征在于所述低分子量肝素选自依诺肝素、阿地肝素、贝米肝素、帕肝素和亭扎肝素，及其可药用盐。11.根据权利要求1至9任一项的生物素化低分子量肝素，其特征在于所述低分子量肝素为如它们的构成多糖的9。/o至20。/Q具有小于2000Da的平均分子量，它们的构成多糖的5%至20%具有大于8000Da的平均分子量，它们的构成多糖的60%至86%具有2000至8000Da的平均分子量，质量平均分子量与数均分子量之间的比率为1.3至1.6，且所述低分子量肝素具有比肝素更好的生物利用率和抗血栓形成活性，并具有大约3500至5500Da的平均分子量，及其可药用盐。12.制备如权利要求1至11任一项所定义的生物素化低分子量肝素的方法，其特征在于其包括下列步骤a)在胺盐和还原剂存在下，在20至80。C的温度下，在低分子量肝素上进行还原性氨基化，b)然后在水性介质或在有机介质中在碱存在下用活化基团-(Rl)广Biot进行酰化，其中R1、i和Biot如权利要求2至6任一项中所定义。13.根据权利要求12的方法，其特征在于其包括下列步骤a)在由化铵盐和硼氢化物盐存在下，在50至80。C的温度下，在<氐分子量肝素上进行还原性氨基化，b)然后在水性介质中在碱存在下用呈活化酯形式的基团-(Rl),-Biot进行酰化。14.药物，其特征在于其包含根据权利要求1至11任一项的生物素化低分子量肝素或所述生物素化低分子量肝素的可药用盐。15.药物组合物，其特征在于其包含，作为活性成分，根据权利要求1至11任一项的生物素化低分子量肝素或所述生物素化低分子量肝素的可药用盐，以及至少一种可药用赋形剂。16.根据权利要求l至ll任一项的生物素化低分子量肝素作为抗血栓形成药的用途。17.根据权利要求16的用途，其用于治疗和预防静脉血栓形成、动脉血栓形成事件，尤其是在心肌梗塞或不稳定心绞痛的情况下，周围动脉血栓形成，如下肢动月永病、缺血性脑卒中和中风，用于预防和治疗平滑肌细胞增殖、血管生成和用作动脉粥样硬化和动脉硬化的神经保护剂。18.使用抗生物素蛋白或链霉亲和素的方法，其特征在于其能够中和根据权利要求1至11任一项的生物素化低分子量肝素。19.抗生物素蛋白或链霉亲和素用于制备用于中和根据权利要求1至11任一项的生物素化低分子量肝素的药物的用途。全文摘要本发明涉及具有至少一个在其还原端与生物素或生物素衍生物的共价键的低分子量肝素，它们的制备方法、含有它们的治疗用途，以及使用抗生物素蛋白或链霉亲和素并可以中和所述生物素化低分子量的肝素的方法。文档编号C08B37/10GK101636417SQ200880005216公开日2010年1月27日申请日期2008年2月12日优先权日2007年2月14日发明者C·维斯科夫,P·休伯特,P·莫里尔申请人:赛诺菲-安万特