专利名称：一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及核酸固相有机载体及其制备方法，更具体的说，是涉及一种通用型聚苯乙烯 基质核酸固相有机合成载体及其制备方法。
背景技术：
核酸固相有机合成是将固相合成和亚磷酰胺法相结合，借助于商品化的DNA/RNA合成 仪(如ABI公司的392 DNA/RNA合成仪或GE公司的KTA oligopilot DNA/RNA合成仪)，在 固相载体上依次按照核酸序列进行偶联，实现快速、高效、稳定的核酸合成。由于固相有机 合成具有自动化程度高、产物量大、没有序列限制、合成产物易进行化学修饰等优点，因此 是目前获得大量核酸最主要的途径之一。
目前大多数核酸固相载体均是在可控孔度玻璃(CPG)载体上连接目标核酸的起始核苷单 体，以此提供核酸序列衍生的活性位点，在此基础上依次进行目标序列的合成，如Sigma公 司的核酸合成系列载体就是将CPG与核苷单体通过琥珀酸键连接得到的，CPG上核苷单体作 为合成核酸序列的起始核苷。除琥珀酸键外，还有一些化学间臂也能用于连接CPG和起始核 苷单体，如Alul和Pon分别采用乙二酰键和对苯二酚-O,O，-乙酰乙酸键作为连接间臂，得到 了不同的CPG固相有机合成载体(Alul, Nucleic Acids Research(19):1527(1991); Pon, Nucleic Acids Research(25) :3629-363 5(1997))。
CPG作为一种无机硅氧基载体，具有表面易衍生、反应活性较高、不溶胀等优点，但由 于其表面富含羟基，亲水性较强，且其保护基在合成过程中易脱落， 一定程度上影响了核酸 的合成效率和质量。此外，传统的固相载体根据连接的起始核苷(A、 T、 C、 G、 U)分为不同 的种类，要满足不同序列的合成要求需备齐全部种类的固相载体，提高了试验成本和工作量。 聚苯乙烯(PS)是一种性能优异的有机载体，McCollum C等利用甲基聚苯乙烯偶联核苷单 体琥珀酸衍生物作为固相有机合成载体进行DNA的合成，取得了较好的合成效果(McCollum, Tetrahedron Letters 32:4069-4072(1991))。聚苯乙烯表面疏水，通过无水溶剂的淋洗能够彻底 除去表面的残留水分，减少水分对核酸合成的干扰，其表面经过氨基衍生后活性位点相对较 少，核酸合成过程中不易产生错误序列，产物纯度较高。针对传统载体需分类的问题，Lyttle 等开发了一类以CPG为基质的通用载体，它仅提供核酸合成的位点(活性羟基)而不连接起始 核苷，能够满足不同核酸序列合成，解决了固相载体分类的麻烦(Lyllle， Nucleic Acids Research24:2793-2798(1996))。 Nelson等也开发了一种名为"Rainbow "的通用CPG载体，合成性 能也相当优异(Nelson, BioTechniques 22:752-759(1997))。
本发明将氨甲基聚苯乙烯与3-氨基-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-l,2-丙二醇通过琥珀酸键连 接，制备了一种通用型的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸固相有机合成载体。
本发明的目的还在于提供一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，它载量高于传统载
体，能够满足各种核酸序列的合成需要，具有较好的合成性能。
本发明的目的还在于提供一种核酸固相有机合成载体的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法。
本发明提供的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，它是将氨甲基衍生的聚苯乙烯载体
通过琥珀酸键与3-氨基-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-l,2-丙二醇偶联得到的固相载体。载体的载
量大于60pmol/g载体，合成反应中每步偶联效率大于95%。同时，它具有通用性，能够满
足各种核酸序列的合成需要。
本发明还提供了一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，包括以下步骤
(a) 在浓度为0.1 5.0mmol/g载体的催化剂存在条件下，聚苯乙烯载体与N-氯甲基邻苯二 甲酰亚胺在有机溶液中反应，得到邻苯二甲酰亚胺甲基聚苯乙烯载体；
(b) 邻苯二甲酰亚胺甲基聚苯乙烯载体在浓度为3 30%肼的乙醇溶液中反应，得到氨甲 基聚苯乙烯载体；
(c) 氨甲基聚苯乙烯载体与琥珀酸酐在有机溶液中于室温反应，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙 烯载体；
(d) 在有机溶液中，琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体与3-氨基-1-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇间臂在浓度为1 10mmol/g载体的催化剂催化下于室温反应，得到所述核酸固相有机 备成载体。
上述制备方法中，所使用的聚苯乙烯载体二乙烯基苯交联度为0.5% 15%，更优选的是 1%~3%;载体粒径范围为20 100(Him，更优选的是30 30(Him;所使用的有机溶剂为二氯甲 烷、四氢呋喃、N,N，-二甲基甲酰胺、乙腈、三乙胺、吡啶、2，6-二甲基吡啶中的一种或几种 的混合溶剂；有机溶剂的用量2 100mL，更优选的是4 50mL;反应时间为2~48h，更优选的 是2 24h;反应温度为室温 80。C。上述制备方法中，步骤(a)中所使用的催化剂为甲基磺酸、四氯化锡、氢氟酸、三氯化铁、 三氯化铁-二苯甲酮、硝基甲垸中的一种；催化剂用量为0.1 5.0mmol/g载体，更优选的是 0.2~2.0mmol/g载体；N-氯甲基邻苯二甲酰亚胺的用量为0.2 5.0mmol/g载体，更优选的是 0.5-2.0 mmol/g载体。
上述制备方法中，步骤(b)中所使用的肼的乙醇溶液的浓度为3 30%，更优选的是 5%~15°/。；用量为5 50mL/g载体，更优选的是10~25mL/g载体。
上述制备方法中，步骤(c)中琥珀酸酐的用量为0.5 10mmol/g载体，更优选的是 l~5mmol/g载体。
上述制备方法中，步骤(d)中载体与间臂偶联时，3-氨基-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-l,2-丙 二醇间臂的用量为0.5 10mmol/g载体，更优选的是l~5mm0l/g载体；反应所用的催化剂为 1-羟基苯并三唑、N，N'二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺中的一种或几种的混合物； 催化剂用量为1 10mmol/g载体，更优选的是2 5mmol/g载体。
本发明公开的制备方法与现有技术相比，具有如下优点
1. 本发明提供了一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，并得到了一种合 成性能优良的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体。
2. 本发明制备的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体载量大于60pmol/g，高于传统载体 载量。
3. 本发明制备的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体能够满足各种核酸序列的合成需 要，具有通用性。
4. 本发明的操作方法简单易行，反应条件温和，易于工业化的放大生产。 具体实施方法
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明并不仅仅限制于该实施例中。 实施例1
5.0g3-氨基-l,2-丙二醇加入50mL三氟乙酸甲酯中，室温搅拌反应24 h，反应结束后蒸 馏除去三氟乙酸甲酯，得油状产物3-三氟乙酰胺-l,2-丙二醇，产物经红外检测结构正确，离 子阱质谱检测分子量为187.2，与理论值相符。3.0g3-三氟乙酰胺-l，2-丙二醇加入50mL吡啶 中，搅拌同时加入4.5gDMT-Cl，室温搅拌反应8h，加入2mL甲醇终止反应。蒸馏除去溶剂， 产物用硅胶柱色谱纯化得到淡黄色油状产物3-三氟乙酰胺-l-DMT-l,2-丙二醇，产物红外检测结构正确，离子阱质谱检测分子量为489.1，与理论值相符。2.5g 3-三氟乙酰胺-l-(4，4，-二甲 氧三苯甲基)-l，2-丙二醇溶于100mL6M氨的甲醇溶液中，室温搅拌反应10h，蒸干得无色油 状产物3-氨基小DMT-l,2-丙二醇，收率卯％， HPLC检测纯度为96.5%，产物红外检测结构 正确，离子阱质谱检测分子量为393.2，与理论值相符。
实施例2
称取l.Og聚苯乙烯载体(二乙烯基苯交联度为2%，粒径为30 80|_im)， 0.15gN-氯甲基 邻苯二甲酰亚胺，20mL二氯甲烷加入茄形瓶中，搅拌加入200mg三氯化铁作催化剂，25°C 搅拌反应15h。反应结束后，分别用二氯甲烷(5X10mL)，甲醇(2X10mL)淋洗载体，真空干 燥2h，将干燥后的载体加入10mL10。/。肼的乙醇溶液中，回流反应7h，然后用乙醇(5X10mL) 淋洗，真空干燥得氨甲基衍生的聚苯乙烯载体。红外检测载体结构正确，水杨醛法测载体氨 基载量为0.48mmo1/ g载体。。
实施例3
称取2.5g聚苯乙烯载体(二乙烯基苯交联度为1.5%，粒径为80 120pm)， 2.0gN-氯甲基 邻苯二甲酰亚胺，80mL 二氯甲烷加入茄形瓶中，加入0.5mL甲基磺酸作催化剂，60。C搅拌 反应10 h。反应结束后，分别用N，N，-二甲基甲酰胺(3X10mL)，甲醇(2X lOmL)淋洗载体， 真空干燥2h。将干燥后的载体加入50mL12。/。肼的乙醇溶液中，回流反应10h，然后用乙醇 (3X10mL)，甲醇(3X10mL)淋洗载体，真空干燥得氨甲基衍生的聚苯乙烯载体。红外检测载 体结构正确，水杨醛法测载体氨基载量为0.89mmo1/ g载体。
实施例4
l.Og氨甲基聚苯乙烯，5.0g琥珀酸酐，15mL吡啶混合，室温振荡24h，得到琥珀酰胺甲 基聚苯乙烯载体。干燥后的载体与2.0g 3-氨基-l-DMT-l,2-丙二醇，0.8g 1-羟基苯并三唑，10mL 2，6-二甲基吡啶混合，室温振荡48h;过滤收集载体，真空干燥2h。 l.Og干燥后的载体悬浮 于30mL四氢呋喃中，加入5mL甲酸和3mL乙酸酐混的合物(3 h内加三次，每次1.5mL)进 行甲酰化，室温振荡8h;用20mL乙腈淋洗载体，真空干燥2h，得所需的核酸固相有机合成 载体。分光光度法检测DMT载量为128.75nmol/g。
7实施例5
2.0g氨甲基聚苯乙烯，4.0g琥珀酸酐，25mL吡啶混合，室温振荡过夜，得到琥珀酰胺甲 基聚苯乙烯载体。干燥后的载体与5.0g3-氨基-l-DMT-l，2-丙二醇，3.0gN,N'-二异丙基碳二亚 胺，50mL吡锭混合，室温振荡36h;过滤收集载体，真空干燥2h。 2.0g载体悬浮于30mL吡 啶:四氢呋喃(3:4)中，加入10mL甲酸和6mL乙酸酐混的合物(5h内加三次，每次3mL)进行甲 酰化，室温振荡12h;用30mL四氢呋喃淋洗载体，真空干燥2h，得所需的核酸固相有机合 成载体。分光光度法检测DMT载量为85.36pmol/g
实施例6
利用例4中得到的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，合成寡核苷酸片段 5'-AUUGGCCAUGCUA-3'，按照3，一5'的顺序依次在载体上偶联核苷亚磷酰胺单体，合成规 模为lpmol，每个偶联循环操作步骤为(a)DMT保护基的脱除反应前，使用无水乙腈充分 洗涤反应仪器和固相载体，然后加入0.7mL2。/。三氯乙酸的二氯甲烷溶液，反应60s，使用无 水乙腈洗涤除去三氯乙酸和水；(b)偶联反应将lOOpL O.lmmol/mL亚磷酰胺单体溶液和 95.2pL0.25mmol/mL5-乙硫基四氮唑溶液加入反应器中，反应15min，反应结束后固相载体 用无水乙腈洗涤；(c)封闭反应加入10(HiL16。/。N-甲基咪唑的四氢呋喃溶液和100^10%无 水乙酸酐,10%嘧啶的四氢呋喃溶液，反应5s; (d)氧化反应加入0.5mL碘氧化溶液，反应 45s，将亚磷酸三酯氧化为稳定的磷酸三酯，结束本偶联周期。重复偶联步骤直至完成核酸片 段的合成。合成结束后，取出载体，加入2M氨的甲醇溶液，2(TC反应lh，将产物从载体上 切割，后加入32y。NH40H， 55'C反应4h脱除保护基。产物进行RP-HPLC检测，出峰时间 与用Sigma公司CPG载体合成的同序列产物出峰时间相同。质谱检测产物分子量也与理论值 符合。合成过程中分光光度法检测DMT离子吸光度可计算出每步偶联效率为96.5%。
实施例7
利用例5中得到的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，合成寡核苷酸片段 5，-UAUCCGCUAUUGCA-3，，按照3，一5'的顺序依次在载体上偶联核苷亚磷酰胺单体，合成 规模为ll^mo1，每个偶联循环操作步骤为(a)DMT保护基的脱除反应前，使用无水乙腈充 分洗涤反应仪器和固相载体，然后加入0.70mL2。/。三氯乙酸的二氯甲烷溶液，反应60s，使 用无水乙腈洗涤除去三氯乙酸和水；(b)偶联反应将lOOpL O.lmmol/mL亚磷酰胺单体溶液 和95.2nL0.25mmol/mL5-乙硫基四氮唑溶液加入反应器中，反应15min，反应结束后固相载体用无水乙腈洗涤；(c)封闭反应加入100pL16。/。N-甲基咪唑的四氢呋喃溶液和100pL10% 无水乙酸酐,10%嘧啶的四氢呋喃溶液，反应5s; (d)氧化反应加入0.5mL碘氧化溶液，反 应45s，将亚磷酸三酯氧化为稳定的磷酸三酯，结束本偶联周期。重复偶联步骤直至完成核酸 片段的合成。合成结束后，取出载体，加入2M氨的甲醇溶液，2(TC反应lh，将产物从载体 上切割，后加入32%氨水，55。C反应4 h脱除保护基。产物进行RP-HPLC检测，出峰时间 与用Sigma公司CPG载体合成的同序列产物出峰时间相同。质谱检测产物分子量也与理论值 符合。合成过程中分光光度法检测DMT离子吸光度可计算出每步偶联效率为97%。
权利要求
1. 一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，其特征在于，它是将氨甲基聚苯乙烯载体与3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇通过琥珀酸键偶联得到的固相载体，具有如下结构式其中，PS为聚苯乙烯载体，DMT为4，4’-二甲氧三苯甲基。
2. —种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，包含如下步骤(a) 在浓度为0.1 5.0mmol/g载体的催化剂存在条件下，聚苯乙烯载体与N-氯甲基邻苯二 甲酰亚胺在有机溶液中反应，得到邻苯二甲酰亚胺甲基聚苯乙烯载体；(b) 邻苯二甲酰亚胺甲基聚苯乙烯载体在浓度为3 30%肼的乙醇溶液中反应，得到氨甲 基聚苯乙烯载体；(c) 氨甲基聚苯乙烯载体与琥珀酸酐在有机溶液中反应，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体；(d) 在有机溶液中，琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体与3-氨基-1-(4，4，-二甲氧三苯甲基)-1,2-丙二醇间臂在浓度为1 10mmol/g载体的催化剂催化下于室温反应，得到如权利要求1所述 聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其中所使用的有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、N，N'-二甲 基甲酰胺、乙腈、三乙胺、吡啶、2,6-二甲基吡啶中的一种或几种的混合溶剂。
4. 如权利要求2所述的制备方法，其中所使用的有机溶剂的量为2 100mL，更优选的是 4~50mL。
5. 如权利要求2所述的制备方法，其中的反应时间为248h，更优选的是2 24h。
6. 如权利要求2所述的制备方法，其中的反应温度为室温 8(TC。
7. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(a)所使用的聚苯乙烯载体DVB交联度为0.5 15。/。， 更优选的是1%~3%。
8. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(a)所使用的聚苯乙烯载体粒径范围为20 100(^m， 更优选的是30~300|xm。
9. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(a)所使用的催化剂是甲基磺酸、四氯化锡、氢氟酸、 三氯化铁、三氯化铁-二苯甲酮、硝基甲垸中的一种。
10. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(a)所使用的催化剂的用量为0.1 5.0mmol/g载体，更优选的是0.2~2.0mmol/g载体。
11. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(a)所使用的N-氯甲基邻苯二甲酰亚胺的用量为0.2 5.0mmol/g载体，更优选的是0.5~2.0mmol/g载体。
12. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(b)所使用的肼的乙醇溶液的浓度为3 30%，更优 选的是5%~15%。
13. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(b)所使用的肼的乙醇溶液的用量为5 50mL/g载 体，更优选的是10 25mL/g载体。
14. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(c)所使用的琥珀酸酐的用量为0.5 10mmol/g载体， 更优选的是l~5mmol/g载体。
15. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(d)所使用的3-氨基-1-(4,4，-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇间臂的用量为0.5 10mmol/g载体，更优选的是l~5mmol/g载体。
16. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(d)所使用的催化剂种类为1-羟基苯并三唑、N，N' 二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺中的一种或几种的混合物。
17. 如权利要求2所述的制备方法，步骤(d)所使用的催化剂的用量为1 10mmol/g载体， 更优选的是2~5mmol/g载体。
18. 如权利要求1所述的核酸固相有机合成载体，其特征在于，所述的载体载量大于60(imol/g， 偶联效率大于95%。
19. 如权利要求1所述的核酸固相有机合成载体，其特征在于，所属的载体能够满足不同序列 核酸合成的需要，是一种通用型的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体。
全文摘要
本发明公开了一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法。将低交联度的聚苯乙烯载体与N-氯甲基邻苯二甲酰亚胺反应，然后通过肼解反应得到氨甲基聚苯乙烯载体；再将3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇与氨甲基聚苯乙烯载体通过琥珀酸键进行偶联，得到聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，具有如下结构式，式中PS为聚苯乙烯载体，DMT为4，4’-二甲氧三苯甲基。本发明得到的载体具有载量高，合成性能优异，能够满足不同序列核酸固相有机合成的需要等优势，是一种通用型的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体。
文档编号C08F112/00GK101519467SQ200910080949
公开日2009年9月2日 申请日期2009年3月30日 优先权日2009年3月30日
发明者竞 张, 洪 梁, 苏志国, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所