专利名称：一种超低分子量肝素的制备及纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种超低分子量肝素的制备及纯化工艺，具体地，涉及到利用β-消 除降解法制备分子量范围在2000D-2500D之间的超低分子量肝素钠或钙盐、利用陶瓷超滤 膜分离纯化的生产工艺，属于生物医药领域。
背景技术：
肝素(heparin)是广泛存在于动物器官和组织(如小肠粘膜、肺等)中的一种葡 萄糖胺聚糖，具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调节血脂等多种药理活性，但长期使 用则可能产生某些不良反应，如出血和诱导血小板减少等。低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH)是肝素分级或降解而得到的分子质量较小的片段。近10年来，人们 对低分子肝素的研究发现，其抗血栓作用优于肝素，具有生物利用度高、体内半衰期长、出 血倾向小，口服易吸收等特点。超低分子量肝素(ultra low molecular weight heparin, ULMWH)是在低分子肝素基础上开发的又一个新品种的抗血栓药物，与低分子肝素相比，其 抗血栓作用强，皮下注射易吸收，无毒副作用，主要用于血栓栓塞性疾病的预防，如肾病综 合症、手术后静脉血栓的形成、老年静脉血栓和心脑血管疾病的预防，防治高血脂症等。由于低分子量肝素在治疗和预防静脉血栓栓塞方面的有效性，已在欧美等多个国 家上市，有取代传统肝素的趋势。因此，结合临床实践，研制理想分子量及分子量分布的低 分子肝素和超低分子量肝素产品具有十分广阔的前景。我国是世界上生产肝素量最大的国家，粗品肝素的出口量一直居于生化药物的首 位。但同时，我国大量进口国外生产的低分子量肝素产品，因此，可以利用我国丰富的肝素 原料资源生产其替代产品，提高产品附加值。药理研究显示，随着肝素分子量的降低，其抗凝血活性较快下降，但和抗血栓功 能密切相关的抗)(a活性下降相对较慢，基于这一发现，人们研究出具有较高抗血栓活性 (FXa)和较低出血倾向——低抗凝血活性(F II a)的肝素片段。研究表明，分子量在2000D 以下的肝素片段没有抗)(a活性，分子量大于8000D的片段虽有较高的抗fe活性，但抗凝血 活性也较高，不符合药典中关于FXa/F II a的要求。低分子量肝素的制备方法大体上可分为三类即物理分离法、裂解法和合成法。物 理降解反应由于控制困难，无法实现产业化生产。裂解法分化学裂解法和酶裂解法，化学裂 解法主要有亚硝酸控制解聚降解法、过氧化物降解法、β -消除降解法、自由基催化降解法、 苯甲基化并碱降解法、高磺酸氧化降解法等。酶裂解法为肝素酶降解法。降解反应不同，产 品的末端结构也不同。酶降解法由于生产成本太高而缺乏竞争力。合成法是国外近年来对 肝素进行研究的一个方向，利用不同糖基人工合成肝素片段，还未进行产业化生产。目前国 际市场上低分子量肝素主流产品均以化学降解方法制得，辉瑞公司生产的达肝素钠、葛兰 素生产的纳曲肝素钠都采用了亚硝酸钠降解方法，赛诺菲-安万特生产的依诺肝素钠采用 了消除降解的方法，Opocin以双氧水-氯化亚铜降解，诺华采用亚硝酸异戊酯降解生产低 分子量肝素钠。我国现有公开号为CN101519459A的发明专利，公开了一种采用亚硝酸钠降解、阴离子柱吸附分离、超滤纯化、乙醇沉淀、冷冻干燥制备超低分子量肝素钠(钙)的生产 工艺，制备的超低分子量肝素平均分子量为23004900D，分子量在1500-5000D之间的比例 达到80%。以化学法降解的低分子量肝素是分子量从几百到近一万的不同分子量片段的混 合物，因此需要采用有效的分离纯化方法。目前采用的分级沉淀分离纯化技术难以分离出 分子量分布范围狭窄的片段；采用的凝胶过滤层析可以分离出合理的片段分布，但存在操 作繁杂、填料成本较高等问题；近年来超滤膜技术的发展，提供了一种很好的分子量分离纯 化方法，但是由于有机膜耐热性差，耐酸、碱和抗微生物侵蚀能力差等，在实际生产中的应 用受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的在于改进目前超低分子量肝素制备和分离纯化技术，提供一种超低 分子量肝素的制备及纯化工艺。本发明的目的是通过以下的技术方案实现的因为低分子量肝素无论是抗凝活性还是抗栓活性，都是以肝素与抗凝血酶 III (ATIII)相结合为前提的，该结合要求肝素必须有一个五糖单位，此结构为肝素抗FXa 及抗FIIa活性所必须。此外，抗FIIa活性不仅在五糖上与ATIII结合，还必须在十三糖上 与ATIII结合才能表达，所以低分子量肝素片段的抗FXa及抗FIIa活性与由肝素的降解 程度关系密切。如果肝素降解后只剩下五糖单位，那么制成的低分子肝素只能具有抗FXa 的活性，如果五糖单位也被降解了，那么抗Ffe的活性也将丧失，所以反应条件需要控制准 确，保证所得的低分子肝素相对分子质量不低于2000D。本发明以肝素钠为原料，在水溶液中与有机季铵盐作用生成肝素季铵盐，在二氯 甲烷溶液中肝素季铵盐的羧基与苄氯发生亲核取代反应生成肝素苄基酯，在碱性条件下， 酯水解降解得到低分子量的肝素片段。通过控制酯化过程中的反应条件可以控制肝素苄基 酯的生成量，生成量越高则降解后肝素片段的分子量越低，而酯水解降解时间的长短与得 到的超低分子量肝素的结构和生理活性相关。降解后沉淀得到的粗品，采用陶瓷膜结合中空纤维超滤膜进行分离纯化，通过选 择陶瓷膜的孔径、操作压力和料液温度，以及中空纤维膜的截留分子量，有效分离分子量分 布范围合理的片段，同时无机陶瓷膜还具有的耐高温、耐腐蚀、清洗方便、膜易消毒处理、机 械性能良好、膜的使用寿命长等优势。实现本发明生产工艺的主要特征包括以下步骤(1)肝素季铵盐的合成取肝素钠(抗II a因子效价140IU/mg左右)，加水溶解，制成重量体积浓度为 15-25%的溶液，搅拌下缓慢加入20倍量苄素氯铵溶液(重量体积浓度为2-5% )，溶液逐 渐变浑浊，过滤后的滤饼用纯化水洗涤，65°C烘干他，得肝素苄素氯铵盐。(2)肝素苄基酯的合成取肝素苄索氯铵盐，加入5倍量的二氯甲烷搅拌溶解，缓慢滴加氯苄，30-45°C反 应15-2证，控制酯化率为14-15%，反应结束时加入1. 5倍量溶有10%醋酸钠的甲醇，待沉 淀析出后，过滤。滤饼用甲醇洗涤，干燥，得肝素苄基酯。4
(3)肝素苄基酯碱性条件下降解取肝素苄基酯，溶于水中至浓度为30-50%，加热至55_65°C，加入氢氧化钠使其 浓度不低于0. lmol/L，搅拌解聚1-1. 25h。反应完毕，冷却到室温，用盐酸调至pH值为 6. 0-7.0，加氯化钠使其终浓度为10%。边搅拌边加入3倍体积甲醇，析出沉淀后过滤。滤 饼用甲醇洗涤，减压干燥，得降解粗品。在盐酸中和时，调节溶液的pH为6.0，加入氧化钙和氯化钙，使氯化钙的浓度为 8. Omol/L，则制备得到超低分子量肝素钙。(4)超低分子量肝素粗品纯化取降解后的超低分子量肝素粗品，加水溶解制成4-8%的溶液，通过无机陶瓷超滤 膜进行过滤，除去大分子量的肝素片段，本发明中采用江苏久吾高科技有限公司生产的二 氧化锆陶瓷超滤膜，其是以高纯度的三氧化二铝为支撑体，膜孔径在lOnm，可实现分子筛级 过滤，根据其截留分子量，可以分离出分子量大于3000D的肝素片段，陶瓷膜过滤的操作压 力选择0. 1-0. 4MPa,优选0. 2MPa,过滤温度选择40-60°C，提高温度有利于提高膜通量。通过无机陶瓷膜过滤后的透过液，继续通过中空纤维超滤膜进行过滤，本发明中 选择截留分子量为1000D的超滤膜，由于超低分子量肝素的分子呈螺旋型，实际透过的分 子量要高于1000D，超滤操作压力在0. 05 0. 07MPa，循环流速控制在2d/s左右，料液温度 20-40°C，截留的溶液为浓缩的超低分子量肝素溶液。在浓缩液中加入3倍量的乙醇进行沉 淀，过滤后滤饼用乙醇洗涤，沉淀中加入少量纯化水冷冻干燥，得到白色粉末状固体为超低 分子量肝素钠(钙)。本发明的效果是(1)通过控制肝素降解反应的温度和时间，控制降解产物达到较低的分子量和较 窄的分子量分布范围，得到分子量分布范围在2000D-2500D，平均分子量为2200D的超低分 子量肝素钠，其抗)(a因子效价在100-125IU/mg，抗II a因子效价在10_25IU/mg，FXa/FII a的比值范围在5. 0-10.0之间，溶解度和澄明度达到国际优级产品的要求，波长^Onm处的 吸光度为0. 06-0. 10，波长260nm处的吸光度为0. 4-0. 6。(2)通过在碱性条件下解聚时加入氯化钠或氯化钙，可相应得到超低分子量肝素 钠或超低分子量肝素钙。(3)本发明将膜超滤技术巧妙的应用于不同分子量段的分离中，有效的解决了超 低分子量肝素的分离问题，避免了在纯化中应用繁琐昂贵的凝胶柱吸附分离法。超低分子 量肝素钠的分离采用无机陶瓷膜与中空纤维超滤膜结合的方法实现，同时首先进行无机陶 瓷膜过滤也有效减少了膜过滤过程中出现的膜污染问题，满足了工业化连续生产的条件。 采用的两步法超滤技术解决了产品质量的稳定性，生产连续性。生产过程不产生环境污染， 产品的生产成本较低，相应收率高。
具体实施例方式实施例1取未分级肝素钠(抗II a因子效价140IU/mg) IOOg,加水500ml溶解，搅拌下缓慢 加入25%的苄素氯铵溶液10000ml，溶液逐渐变浑浊，过滤后的滤饼用纯化水洗涤，65°C烘 干乩，得肝素苄素氯铵盐325g。
取肝素苄索氯铵盐200g，加入二氯甲烷IOOOml搅拌溶解，缓慢滴加氯苄200ml， 40°C反应20h，控制酯化率为14. 5%，反应结束时加入溶有10%醋酸钠的甲醇1800ml，待沉 淀析出后，过滤。滤饼用甲醇洗涤，干燥，得肝素苄基酯71. 50g。取肝素苄基酯50g，溶于1500ml水中，加热至65°C，加入氢氧化钠6. 4g，搅拌解聚 1.25h。反应完毕，冷却到室温，用盐酸调至pH值为6. 5，加入分析纯氯化钠150g搅拌溶 解。边搅拌边加入3倍体积甲醇，析出沉淀后过滤。滤饼用甲醇洗涤，减压干燥，得降解粗 口口 31. 8g0取降解后的超低分子量肝素粗品20g，加400ml水溶解制成约5%的溶液，通过无 机陶瓷超滤膜进行过滤，采用江苏久吾高科技有限公司生产的二氧化锆陶瓷超滤膜，膜孔 径在lOnm，过滤的操作压力为0. 2MPa,过滤温度60°C，获得过滤透过液。通过无机陶瓷膜过 滤后的透过液，继续通过截留分子量为IOOOD的中空纤维超滤膜进行过滤，超滤操作压力 在0. 06MPa,循环流速控制在2d/s左右，料液温度30°C，截留的溶液为浓缩的超低分子量肝 素溶液，体积为68ml。在浓缩液中加入200ml 95%的乙醇进行沉淀，过滤后滤饼用无水乙醇洗涤。收集 的沉淀中加入约15ml纯化水溶解，预冷后冷冻干燥，得到白色粉末状固体13. 6g，纯化收率 为 68%。经检验，制备的超低分子量肝素钠分子量分布范围在2000D-2500D的比例占 92%，平均分子量为2200D。其抗)(a因子效价为lMIU/mg，抗II a因子效价为16IU/mg， FXa/F II a的比值为7. 75，溶解度和澄明度按照法定方法检测，波长^Onm处的吸光度为 0. 08，波长^Onm处的吸光度为0. 52。实施例2取未分级肝素钠(抗II a因子效价140IU/mg) 150g,加水750ml溶解，搅拌下缓慢 加入25%的苄素氯铵溶液15000ml，溶液逐渐变浑浊，过滤后的滤饼用纯化水洗涤，65°C烘 干乩，得肝素苄素氯铵盐477g。取肝素苄索氯铵盐400g，加入二氯甲烷2000ml搅拌溶解，缓慢滴加氯苄400ml， 35 °C反应25h，控制酯化率为13.8%，反应结束时加入溶有10 %醋酸钠的甲醇3500ml，待沉 淀析出后，过滤。滤饼用甲醇洗涤，干燥，得肝素苄基酯142g。取肝素苄基酯100g，溶于3000ml水中，加热至62°C，加入氢氧化钠12g，搅拌解聚 lh。反应完毕，冷却到室温，用盐酸调至pH值为6. 0，加入分析纯氯化钙1800g，搅拌溶解。边 搅拌边加入3倍体积甲醇，析出沉淀后过滤。滤饼用甲醇洗涤，减压干燥，得降解粗品75g。取降解后的超低分子量肝素钙粗品60g，加1200ml水溶解制成约5%的溶液，通过 无机陶瓷超滤膜进行过滤，采用江苏久吾高科技有限公司生产的二氧化锆陶瓷超滤膜，膜 孔径在lOnm，过滤的操作压力为0. 3MPa,过滤温度60°C，获得过滤透过液。通过无机陶瓷膜 过滤后的透过液，继续通过截留分子量为1000D的中空纤维超滤膜进行过滤，超滤操作压 力在0. OSMPa,循环流速控制在2d/s左右，料液温度30°C，截留的溶液为浓缩的超低分子量 肝素溶液，体积为145ml。在浓缩液中加入450ml 95%的乙醇进行沉淀，过滤后滤饼用无水乙醇洗涤。收集 的沉淀中加入约IOOml纯化水溶解，预冷后冷冻干燥，得到白色粉末状固体39. 6g，纯化收 率为66%。
经检验，制备的超低分子量肝素钙分子量分布范围在2000D-2500D的比例占 90%，平均分子量为2200D。其抗)(a因子效价为105IU/mg，抗II a因子效价为12. 8IU/mg， FXa/FII a的比值为8. 20，溶解度和澄明度按照法定方法检测，波长^Onm处的吸光度为 0.082，波长洸Onm处的吸光度为0.55。钙含量10.80%。实施例3取分级肝素钠(抗II a因子效价150IU/mg，硫酸皮肤素含量低于2% ) 100g，加 水500ml溶解，搅拌下缓慢加入25%的苄素氯铵溶液10000ml，溶液逐渐变浑浊，过滤后的 滤饼用纯化水洗涤，65 °C烘干他，得肝素苄素氯铵盐332g。取肝素苄索氯铵盐300g，加入二氯甲烷1500ml搅拌溶解，缓慢滴加氯苄300ml， 40 °C反应20h，控制酯化率为14. 0-14. 5%,反应结束时加入溶有10 %醋酸钠的甲醇 2700ml，待沉淀析出后，过滤。滤饼用甲醇洗涤，干燥，得肝素苄基酯115g。取肝素苄基酯100g，溶于3000ml水中，加热至65°C，加入氢氧化钠9g，搅拌解聚 lh。反应完毕，冷却到室温，用盐酸调至pH值为6. 5，加入分析纯氯化钠300g搅拌溶解。边搅 拌边加入3倍体积甲醇，析出沉淀后过滤。滤饼用甲醇洗涤，减压干燥，得降解粗品68. 60g。取降解后的超低分子量肝素粗品50g，加IOOOml水溶解制成约5%的溶液，通过无 机陶瓷超滤膜进行过滤，采用江苏久吾高科技有限公司生产的二氧化锆陶瓷超滤膜，膜孔 径在lOnm，过滤的操作压力为0. 3MPa,过滤温度60°C，获得过滤透过液。通过无机陶瓷膜过 滤后的透过液，继续通过截留分子量为1000D的中空纤维超滤膜进行过滤，超滤操作压力 在0. 06MPa,循环流速控制在2d/s左右，料液温度30°C，截留的溶液为浓缩的超低分子量肝 素溶液，体积为158ml。在浓缩液中加入450ml 95%的乙醇进行沉淀，过滤后滤饼用无水乙醇洗涤。收集 的沉淀中加入约15ml纯化水溶解，预冷后冷冻干燥，得到白色粉末状固体32. 8g，纯化收率 为 65. 6%。经检验，制备的超低分子量肝素钠分子量分布范围在2000D-2500D的比例占 93%，平均分子量为2200D。其抗)(a因子效价为120IU/mg，抗II a因子效价为15IU/mg， FXa/F II a的比值为8，溶解度和澄明度按照法定方法检测，波长^Onm处的吸光度为 0. 068，波长260nm处的吸光度为0. 50。权利要求
1.一种超低分子量肝素钠(钙)的制备及纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤(1)肝素季铵盐的合成；(2)肝素苄基酯的合成；(3)肝素苄基酯碱性条件下降解；(4)超低分子量肝素粗品纯化；(5)超低分子量肝素的真空冷冻干燥及成品。未分级或分级肝素原料在水溶液中与有机季铵盐作用生成肝素季铵盐，在二氯甲烷溶 液中肝素季铵盐的羧基与苄氯发生亲核取代反应生成肝素苄基酯，在碱性条件下，酯水解 降解得到低分子量的肝素片段。通过无机陶瓷超滤与中空纤维超滤结合的方法进行分离纯 化，获得合理分子量分布范围的超低分子量肝素钠(钙)，真空干燥后制得成品。
2.根据权利要求1所述的方法在肝素苄基酯的合成过程中的反应条件控制，其特征在 于取肝素苄索氯铵盐，加入5倍量的二氯甲烷搅拌溶解，缓慢滴加氯苄，酯化反应的条件 为30-45°C反应15-2证，控制酯化率为14-15%，优选反应温度35°C反应20h。
3.根据权利要求1所述的方法在肝素苄基酯降解过程中碱性条件的控制，其特征在 于氢氧化钠的加入浓度在0. 1-0. 15mol/L之间，加热至55_65°C，搅拌解聚1_1. 25h。
4.根据权利要求1所述的方法采用的超低分子量肝素粗品纯化方法，其特征在于采 用无机陶瓷超滤膜结合中空纤维超滤膜的方法进行纯化，获得分子量分布范围合理的超低 分子量肝素。
5.权利要求4所述的纯化方法中的无机陶瓷超滤膜，其特征在于所述的无机陶瓷膜 是二氧化锆陶瓷超滤膜，以高纯度的三氧化二铝为支撑体，膜孔径在lOnm，可以分离出分子 量大于3000D的肝素片段。
6.权利要求4所述的纯化方法中的中空超滤膜，其特征在于所述的中空纤维超滤膜 的截留分子量为1000D。
7.权利要求4所述的无机陶瓷膜超滤的操作条件，其特征在于操作压力选择 0. 1-0. 4MPa，优选0. 2Mpa ；过滤温度选择40-60°C，提高温度有利于提高膜通量。
8.一种由上述权利要求制备和纯化方法获得的超低分子量肝素钠(钙)，其特征在 于分子量分布范围在2000-2500D的超低分子量肝素占85%以上，平均分子量为2200D， 其抗)(a因子效价在100-125IU/mg，抗II a因子效价在10_25IU/mg，FXa/F II a的比值范 围在5. 0-10. O之间，溶解度和澄明度达到国际优级产品的标准，280nm处波长的吸光度为 0. 06-0. 10，波长260nm处的吸光度为0. 4-0. 6。
全文摘要
本发明公开了一种超低分子量肝素钠(钙)的制备及纯化工艺肝素与有机季铵盐作用生成的肝素季铵盐亲核取代后生成的肝素苄基酯，碱性条件下降解得到低分子量的肝素片段，通过无机陶瓷超滤与中空纤维超滤结合的方法进行分离纯化，获得分子量分布范围在2000-2500D、平均分子量为2200D的超低分子量肝素钠(钙)。本发明通过控制酯化过程中的反应条件以及酯水解的降解时间，获得较低分子量的肝素片段；采用陶瓷膜结合中空纤维超滤膜进行分离纯化，通过选择陶瓷膜的孔径、操作压力和料液温度，以及中空纤维膜的截留分子量，有效分离肝素片段的分子量分布范围。
文档编号C08B37/10GK102040671SQ20091018028
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者姬胜利, 王秀云, 肖佳普 申请人:北京贯虹科技有限公司